Name: Fabricage van aangepaste Agarose putten voor het zaaien van de cellen en weefsel Ring zelf-assemblage met behulp van 3D-gedrukte mallen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Leer een eenvoudige methode voor het fabriceren van aangepaste agarose putten met 3D-geprinte mallen voor zelf-assemblage van weefselringen. Deze techniek maakt onderzoek naar structuur en functie van menselijke cellen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij nogmaals mijn dankbaarheid uitspreken Dr. Erica Stults (academisch onderzoek & toepassing wetenschapper, WPI Information Technology Services) voor haar hulp met 3D printing, Amanda Zoë Reidinger, Ph.D., Chris Nycz en Karen Levi, M.E., voor hun inbreng op schimmel ontwerp, Kathy Suqui en Jennifer Mann voor hun hulp testen schimmel ontwerpen en Michael O'Keefe voor zijn hulp met filmen.  Dit werk werd gesteund door de NSF IGERT DGE 1144804 (MWR, HAS), NIH R15 HL097332 (MWR, TAH), NSF REU EEC0754996 (BA), NIH 1R01 EB023907 (MWR, HAS) en NIH R15 HL137197 (MWR, HAS).
<div></div>

1. voorbereiding van de mal 3D-afgedrukt
<ol><li>Een CAD-tekening van de schimmel in de gewenste afmetingen voor te bereiden.</li>
	<li>Het CAD-bestand verzenden in een hoge resolutie 3D-printer. Selecteer de juiste afdrukken kunststof, met glanzende afwerking.</li>
	<li>Na het afdrukken de mal met wasmiddel en water grondig te wassen.</li>
</ol>2. casting PDMS negatieven
<ol><li>Meet de gewenste hoeveelheid PDMS basis op een evenwicht. Voor een schimmel met een 60 mm diameter en 2 mm goed posten, gebruik van 25 g.</li>
	<li>Uithardende agent toevoegen op een 1:10 (w/w) in verhouding tot de PDMS base.</li>
	<li>Roer krachtig tot de twee componenten grondig worden gecombineerd. Onvoldoende mengen kan leiden tot onvolledige uitharding van PDMS, resulterend in een "plakkerig" oppervlak.</li>
	<li>Plaats een stukje laboratorium tape rond de grens van 3D-gedrukte mallen, om de vorming van een basislaag PDMS boven de gedrukte putten.</li>
	<li>Giet het PDMS mengsel in de mal en leg de mal in een vacuuemcel ambtshalve gas tot alle bubbels zijn vrijgegeven.</li>
	<li>Genezen het PDMS bij 50 ° C gedurende 2-4 uur of totdat gestold genoeg om te verwijderen.</li>
	<li>Verwijder de tape lab en zorgvuldig het PDMS negatief uitpakken.</li>
	<li>Incubeer de PDMS bij 60 ° C voor een extra 1 h (na verwijdering uit de mal 3D-afgedrukt) om ervoor te zorgen dat schimmel volledig is uitgehard.</li>
	<li>Wassen het PDMS grondig met wasmiddel en water aan een residu te verwijderen. Onvoldoende wassen kan resulteren in slechte ring vorming voor het eerste gebruik van het PDMS negatief.</li>
</ol>3. het fabriceren van Agarose Wells
<ol><li>Bereiden agarose putten 1 dag vóór het zaaien van de cellen.</li>
	<li>Maak een oplossing van 2% (g/v) agarose in DMEM en autoclaaf.</li>
	<li>Pipetteer 4 mL gesmolten agarose in een gesteriliseerde met autoclaaf PDMS negatief. Daarna negatieven Pipetteer agarose rechtstreeks in de posten van PDMS. Verwijder eventuele luchtbellen met een pipet tip, zoals bubbels inhomogeneities in de goed dimensies veroorzaken kunnen.</li>
	<li>Opmerking: Niet overvol mallen; de bovenkant van het agarose moet plat, zodat agarose putten niveau op PDMS afgehaald en plaatsing in 6-well cultuur platen. Overgebleven agarose kunnen re-gesteriliseerde met autoclaaf en gebruikte weer, hoewel niet meer dan eens.</li>
	<li>Nadat de agarose cools (ongeveer 10 min. voor 4 mL agarose; grotere mallen wellicht meer koeling keer), zorgvuldig de agarose putten scheiden van de negatieven van de PDMS met botte pincet en breng kwantitatief over in een putje van de plaat van een 6-well.</li>
	<li>De agarose putten in volledige kweekmedium dompelen, en equilibreer 's nachts in een 37 ° C incubator voorafgaand aan het gebruiken.</li>
</ol>4. het zaaien van weefsel ringen
<ol><li>Cultuur rat aorta vlotte spier cellen21 (RaSMCs) in DMEM met 10% foetale runderserum (FBS), 1% L-glutamine, 1% niet-essentiële aminozuren, 1% natrium pyruvaat en 1% penicilline-streptomycine totdat zij 70% samenvloeiing. Opmerking: Cellen moeten worden gekweekt op 5% CO2 en 37 ° C in 15 cm weefselkweek platen.</li>
	<li>Na mallen zijn geëquilibreerd (afdeling 3), RaSMCs voor te bereiden voor het zaaien.</li>
	<li>Spoel de platen tweemaal met 5 mL per plaat fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).</li>
	<li>Voeg 3 mL 0,25% trypsine per 15 cm petrischaal. Verplaats de platen naar een incubator van de 37 ° C gedurende 2-3 min of totdat cellen hebben getild aan de plaat.</li>
	<li>Neutraliseer trypsine met een gelijk volume (3 mL per plaat) volledige kweekmedium. Resuspendeer de cellen grondig te breken van de bosjes.</li>
	<li>Verdun een hoeveelheid celsuspensie 1:1 met trypan blauwe kleurstof en tellen van de cellen met een hemocytometer.</li>
	<li>Centrifugeer het totale volume van de celsuspensie gedurende 5 min. op 200 x g tot pellet cellen.</li>
	<li>Resuspendeer de cellen bij een concentratie van 10 miljoen cellen per mL; Dit zal leiden tot 500.000 cellen per 50 µL. Opmerking: Verschillende soorten cellen wellicht verschillende cel concentraties.</li>
	<li>Alle medium uit de mal agarose gecombineerd. Wees voorzichtig alle medium verwijderen uit afzonderlijke putten, maar niet het doorprikken van de bodems van de putten.</li>
	<li>Pipetteer 50 µL van schorsing in elk putje.</li>
	<li>Voeg 2 mL verse voedingsbodem rond de buitenkant van de mal agarose. Wees voorzichtig niet te laten middellange overloop in de putten van het agarose. Plaats de platen in de incubator's nachts (ongeveer 16 h).</li>
	<li>Na een incubatieperiode van de overnachting, het medium van buiten de mallen gecombineerd en 4.5 mL verse medium toevoegen aan elk putje van de plaat 6-well, zodat schimmels en ringen zijn volledig ondergedompeld. Verandering medium dagelijks.</li>
</ol>

<ol><li>L'Heureux, N., Paquet, S., Labbe, R., Germain, L., Auger, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+completely+biological+tissue-engineered+human+blood+vessel%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">A completely biological tissue-engineered human blood vessel.</a> FASEB J. 12 (1), 47-56 (1998).</li>
<li>Adebayo, O., Hookway, T. A., Hu, J. Z., Billiar, K. L., Rolle, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembled+smooth+muscle+cell+tissue+rings+exhibit+greater+tensile+strength+than+cell-seeded+fibrin+or+collagen+gel+rings%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Self-assembled smooth muscle cell tissue rings exhibit greater tensile strength than cell-seeded fibrin or collagen gel rings.</a> J Biomed Mater Res A. 101 (2), 428-437 (2013).</li>
<li>Hayashi, K., Tabata, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+stem+cell+aggregates+with+gelatin+microspheres+to+enhance+biological+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Preparation of stem cell aggregates with gelatin microspheres to enhance biological functions.</a> Acta Biomater. 7 (7), 2797-2803 (2011).</li>
<li>Kelm, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+concept+for+scaffold-free+vessel+tissue+engineering%3A+self-assembly+of+microtissue+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A novel concept for scaffold-free vessel tissue engineering: self-assembly of microtissue building blocks.</a> J Biotechnol. 148 (1), 46-55 (2010).</li>
<li>McAllister, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+haemodialysis+access+with+an+autologous+tissue-engineered+vascular+graft%3A+a+multicentre+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of haemodialysis access with an autologous tissue-engineered vascular graft: a multicentre cohort study.</a> Lancet. 373, 1440-1446 (2009).</li>
<li>Svoronos, A. A., Tejavibulya, N., Schell, J. Y., Shenoy, V. B., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-mold+design+controls+the+3D+morphological+evolution+of+self-assembling+multicellular+microtissues%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Micro-mold design controls the 3D morphological evolution of self-assembling multicellular microtissues.</a> Tissue Eng Part A. 20 (7-8), 1134-1144 (2014).</li>
<li>Gwyther, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+vascular+tissue+fabricated+from+aggregated+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cells+Tissues+Organs%22%5BJournal%5D)">Engineered vascular tissue fabricated from aggregated smooth muscle cells.</a> Cells Tissues Organs. 194 (1), 13-24 (2011).</li>
<li>Mehesz, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+robotic+biofabrication+of+tissue+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Scalable robotic biofabrication of tissue spheroids.</a> Biofabrication. 3 (2), 025002(2011).</li>
<li>Laterreur, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+direct+burst+pressure+and+the+ring+tensile+test+methods+for+mechanical+characterization+of+tissue-engineered+vascular+substitutes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mech+Behav+Biomed+Mater%22%5BJournal%5D)">Comparison of the direct burst pressure and the ring tensile test methods for mechanical characterization of tissue-engineered vascular substitutes.</a> J Mech Behav Biomed Mater. 34, 253-263 (2014).</li>
<li>L'Heureux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+tissue-engineered+blood+vessels+for+adult+arterial+revascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Human tissue-engineered blood vessels for adult arterial revascularization.</a> Nat Med. 12 (3), 361-365 (2006).</li>
<li>Dash, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-Engineered+Vascular+Rings+from+Human+iPSC-Derived+Smooth+Muscle+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Tissue-Engineered Vascular Rings from Human iPSC-Derived Smooth Muscle Cells.</a> Stem Cell Reports. 7 (1), 19-28 (2016).</li>
<li>Heureux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+tissue-engineered+vascular+media%3A+a+new+model+for+pharmacological+studies+of+contractile+responses%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">A human tissue-engineered vascular media: a new model for pharmacological studies of contractile responses.</a> FASEB J. 15, 515-524 (2001).</li>
<li>Dikina, A. D., Strobel, H. A., Lai, B. P., Rolle, M. W., Alsberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+cartilaginous+tubes+for+tracheal+tissue+replacement+via+self-assembly+and+fusion+of+human+mesenchymal+stem+cell+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Engineered cartilaginous tubes for tracheal tissue replacement via self-assembly and fusion of human mesenchymal stem cell constructs.</a> Biomaterials. 52, 452-462 (2015).</li>
<li>Twal, W. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellularized+microcarriers+as+adhesive+building+blocks+for+fabrication+of+tubular+tissue+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Cellularized microcarriers as adhesive building blocks for fabrication of tubular tissue constructs.</a> Ann Biomed Eng. 42 (7), 1470-1481 (2014).</li>
<li>Norotte, C., Marga, F. S., Niklason, L. E., Forgacs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffold-free+vascular+tissue+engineering+using+bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Scaffold-free vascular tissue engineering using bioprinting.</a> Biomaterials. 30 (30), 5910-5917 (2009).</li>
<li>Tan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+printing+facilitated+scaffold-free+tissue+unit+fabrication%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">3D printing facilitated scaffold-free tissue unit fabrication.</a> Biofabrication. 6 (2), 1-11 (2014).</li>
<li>Dean, D. M., Napolitano, A. P., Youssef, J., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rods%2C+tori%2C+and+honeycombs%3A+the+directed+self-assembly+of+microtissues+with+prescribed+microscale+geometries%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Rods, tori, and honeycombs: the directed self-assembly of microtissues with prescribed microscale geometries.</a> The FASEB Journal. 21 (14), 4005-4012 (2007).</li>
<li>Gwyther, T. A., Hu, J. Z., Billiar, K. L., Rolle, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+cellular+self-assembly+to+fabricate+cell-derived+tissue+rings+for+biomechanical+analysis+and+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Directed cellular self-assembly to fabricate cell-derived tissue rings for biomechanical analysis and tissue engineering.</a> J Vis Exp. (57), e3366(2011).</li>
<li>Zhu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+printing+of+functional+biomaterials+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">3D printing of functional biomaterials for tissue engineering.</a> Curr Opin Biotechnol. 40, 103-112 (2016).</li>
<li>Jakab, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering+by+self-assembly+and+bio-printing+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering by self-assembly and bio-printing of living cells.</a> Biofabrication. 2 (2), 022001(2010).</li>
<li>Lemire, J. M., Potter-Perigo, S., Hall, K. L., Wight, T. N., Schwartz, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+Rat+Aortic+Smooth+Muscle+Cells+Differ+in+Versican%2FPG-M+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Distinct Rat Aortic Smooth Muscle Cells Differ in Versican/PG-M Expression.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 16 (6), 821-829 (1996).</li>
<li>Strobel, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+self-assembly+with+microsphere+incorporation+for+growth+factor+delivery+within+engineered+vascular+tissue+rings%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Cellular self-assembly with microsphere incorporation for growth factor delivery within engineered vascular tissue rings.</a> Tissue Eng Part A. 23 (3-4), 143-155 (2017).</li>
<li>Strobel, H. A., Calamari, E. L., Beliveau, A., Jain, A., Rolle, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+and+characterization+of+electrospun+polycaprolactone+and+gelatin+composite+cuffs+for+tissue+engineered+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22JBMR+Part+B%22%5BJournal%5D)">Fabrication and characterization of electrospun polycaprolactone and gelatin composite cuffs for tissue engineered blood vessels.</a> JBMR Part B. , In Press (2017).</li>
<li>Napolitano, A. P., Chai, P., Dean, D. M., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+the+self-assembly+of+complex+cellular+aggregates+on+micromolded+nonadhesive+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Dynamics of the self-assembly of complex cellular aggregates on micromolded nonadhesive hydrogels.</a> Tissue Eng. 13 (8), 2087-2094 (2007).</li>
<li>Gwyther, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Engineered+Vascular+Tissue+Generated+by+Cellular+Self-Assembly%22">Engineered Vascular Tissue Generated by Cellular Self-Assembly</a>. , Worcester Polytechnic Institute. (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier hebben we een veelzijdige methode voor de snelle fabricage van zelf geassembleerde weefsel ringen aangeboden met gemakkelijk aangepaste afmetingen met behulp van 3D printen. Onze methode is vergelijkbaar met die gerapporteerd in Svoronos et al. 6 , waar 3D-gedrukte honingraat en hond-bot gevormd wax mallen te werpen PDMS negatieven werden gebruikt. Echter hebben de mallen zijn aangepast verscheidene unieke design functies bevatten. Een inkeping (figuur 4A(1)) biedt oriëntatie van de mal om elke ring label en individueel gecontroleerd worden. Het centrale gat (figuur 4A(2)) helpt te verbeteren van de verspreiding van medium in de putjes. CAD bestandsnummers worden afgedrukt rechtstreeks op de mal; Daarom PDMS negatieven worden elk aangeduid met versienummer en post diameter (Figuur 4A3). De taps toelopende buitenmuren en (Figuur 3(1), 5 °), aan de bovenkant van de goed troggen (Figuur 3(2), 45 °), en gat in het midden (Figuur 3(3), 5 °) gemakkelijker te verwijderen PDMS negatieven uit de 3D-gedrukte mallen , en agarose putten zijn gemakkelijker te verwijderen uit de PDMS negatieven (figuur 4A(2), A(4)).
We hebben laten zien van de veelzijdigheid van dit systeem door het fabriceren van zelf geassembleerde ringvormige weefsels van een scala aan diameters en celtypes, met inbegrip van de primaire mens vlotte spier cellen (SMCs)18,22, rat aorta SMCs7 , 23, menselijke mesenchymale stamcellen (hMSCs)13en SMCs afgeleid van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs)11 (tabel 1). In de lopende werkzaamheden, zijn we de vorming van ringen van extra celtypes zoals endotheliale cellen evalueren en smelten van kraakbeen ringen van verschillende groottes voor potentiële toepassingen in tracheale vervanging. Naast volledig cel-afgeleide constructies, hebben wij ook dit systeem gebruikt voor het fabriceren van ringen met opgenomen kruislings gekoppelde gelatine microsferen13,22. Microbolletjes binnen weefsel ringen tijdens zelf-assemblage voor extra mechanische sterkte kunnen worden opgenomen, of gelokaliseerd voor levering van groeifactoren13,22.
Wanneer het fabriceren van weefsel ringen, kan optimalisatie van celaantal worden vereist voor verschillende soorten cellen. Minimumgrootte voor een cel nummers kan variëren op basis van de grootte en het type van cellen. Bijvoorbeeld, hSMCs iPSCs afgeleid worden overgeënt op 600.000 cellen/ring11, hMSCs en primaire hSMCs worden overgeënt op 400.000 cellen/ring13,22, en rat die aorta SMCs worden overgeënt op 500.000 cellen/ring18. Trog afmetingen kunnen ook invloed hebben op ring vorming en het minimum aantal cellen die nodig zijn voor ring vorming24. Voor studies met menselijke cellen en 3D-gedrukte mallen, werd een trog breedte van 2 mm gebruikt. De originele mallen van polycarbonaat had een trog breedte van 3,75 mm, die 750.000 hSMCs vereist vormen een 2 mm cel ring18. Met de breedte van de verminderde trog konden we aan het verminderen van het aantal cellen die nodig zijn voor de vorming van de ring met 46%, tot 400.000 cellen per ring25. Hoeveelheden cellen zaadjes per ring zijn samengevat in tabel 1.
Bij het kiezen van een 3D-drukwerk, vele factoren moeten worden overwogen. Omdat PDMS meestal bij 60 ° C genezen is, de 3D-drukwerk moet beschikken over een hoog genoeg smelttemperatuur om schade te voorkomen tijdens het PDMS genezen. De smelttemperatuur van het gebruikte materiaal in deze studie (een merkgebonden materiaal, Zie Tabel of Materials) is niet beschikbaar. Echter wanneer gebakken bij 60 ° C gedurende 1 uur, vastgesteld we hebben dat het materiaal begon te produceren een geur. Dus besloten we om het verlagen van de uithardende temperatuur tot 50 ° C en de uithardingstijd te verhogen om het PDMS bakken zonder beschadiging van de 3D-drukwerk. Aanpassingen in het genezen van tijd wellicht nodig als mallen zijn aangepast aan de vorm groter PDMS negatieven. Een extra uithardende periode bij 60 ° C na PDMS verwijdering uit de 3D-gedrukte mallen voorkomt dat de definitieve PDMS negatieve resterende smakeloos, terwijl het beperken van de temperatuur die de mal 3D-afgedrukt wordt blootgesteld aan. Merk op dat sommige materialen remmen voor PDMS genezen, dus zorg ervoor dat het geselecteerde materiaal is compatibel met de PDMS. Ten slotte is de schimmel materiële toxiciteit moet ook worden overwogen. Terwijl de mal 3D-afgedrukt niet in direct contact met cellen zijn zal, is het mogelijk dat sommige residu van de mal kan worden overgedragen aan de PDMS negatieve tijdens de uithardende procedure. We vonden dat zeer grondig wassen met afwasmiddel voldoende om alle residuen van het PDMS negatief was. Echter vastgesteld we hebben eerder dat onvoldoende wassen heeft geleid tot arme ring vorming in agarose putten voor de eerste paar toepassingen van het PDMS negatieve. Het gebruik van PDMS cast van andere 3D-gedrukte materialen mogelijk extra onderzoek om te verifiëren dat wasmiddel voldoende is voor het verwijderen van schimmel residuen, met inbegrip van alle mogelijke leachates. Periodieke testen kan ook nodig, als het mogelijk dat herhaald verwarming cycli (zelfs tot 50 ° C) kan de schimmel na verloop van tijd schade, en veroorzaken verhogingen in residu na herhaald gebruik zijn. Tot op heden hebben we een enkele 3D-gedrukte schimmel gebruikt voor de productie van meer dan 30 PDMS negatieven die zijn gebruikt voor het met succes het genereren van weefsel ringen.
Algemene, 3D printen kunt grotere veelzijdigheid voor de fabrikatie van agarose mallen dan verspanen van polycarbonaat. Het biedt een hogere resolutie dan mogelijk is met tooling, en schimmel ontwerp wordt niet beperkt door de afmetingen van de beschikbare instrumenten. Dit zorgt voor een grotere aanpassing, en de toevoeging van functies zoals stiftschroeven die wellicht niet mogelijk zijn met verspanen. Dit systeem kan worden toegepast op het fabriceren van zelf geassembleerde weefsels in andere vormen, naast ringen6,17. Gebruik de ringmethode fabricage, hebben we ontwikkeld weefsel ringen uit een verscheidenheid van celtypen en maten voor potentiële toepassingen in de trachea weefsel engineering13, gemanipuleerde bloedvaten7en modellering vasculaire ziekten11.

Cellulaire zelf-assemblage benaderingen voor het fabriceren van weefsel ontworpen bloedvaten zijn een alternatief voor steiger-gebaseerde benaderingen. Zelf geassembleerd, steiger-gratis weefsels wellicht grotere celdichtheid, verbeterde matrix afzetting en kracht en verbeterde biologische functie ten opzichte van steiger gebaseerde weefsels1,2,3,4 . Vorming van 3D weefsel zonder het gebruik van exogene steiger ondersteuning met specifieke maten en vormen echter een uitdaging. Sommige methoden smelten samen lagen van cel vellen vormen dikker constructies, hoewel dit proces kan tijdrovend en arbeid intensieve5. U kunt ook cellen kunnen worden uitgezaaid in niet-klevende mallen en toegestaan tot totaal in spheroïden, ringen en andere weefsels vormen6,7,8.
Zelf geassembleerde weefsel ringen vereisen minder cellen, kortere tijden van de cultuur, en minder reagentia dan grotere buisvormige ontworpen weefsels, maar kunnen nog steeds worden mechanisch getest, satellietgroepen, of gebruikt voor contractility en andere functionele testen7 , 9 , 10 , 11. omdat ze kunnen worden vervaardigd snel en gemakkelijk getest, weefsel ringen zijn ideaal voor het screenen van grote aantallen cultuur parameters, en potentieel voor gebruik als ziekte modellen11 of hulpmiddelen voor drug screening van12. Daarnaast ringen kunnen in meer complexe weefsel structuren zoals bloedvaten of luchtpijp7,13worden gesmolten en ringen meer volledig dan andere vormen zoals spheroïden14,15kunnen smelten.
Agarose wordt veel gebruikt als een schimmel materiaal voor het fabriceren van zelf geassembleerde weefsels als gevolg van de biocompatibiliteit, permeabiliteit en adhesieve eigenschappen van de niet-cel. Bijvoorbeeld, Norotte et al. gefabriceerd agarose mallen van geëxtrudeerde staven, die beperkte controle over de vorm van de mal en vereist speciale apparatuur15ingeschakeld. Tan et al. gestort alginaat druppels als gebouw eenheden om aangepaste hydrogel mallen in verschillende vormen (piramide, plein)16. Echter, de grote diameter van de alginaat spheroïden (300 µm) resulteerde in functies met een lage resolutie. Zo'n lage resolutie kan leiden tot ongelijke schimmel oppervlakken die cel aggregatie consistentie nadelig kunnen beïnvloeden. Als alternatief kan de agarose in polymeer negatieven niet-klevende mallen maken met gladde functies en specifieke afmetingen6,7,17geworpen te worden.
Eerder meldden wij een systeem voor het fabriceren van aangepaste ringvormige agarose cel-zaaien putten van een PDMS negatieve cast in een gefreesde polycarbonaat schimmel7,18. Agarose werd gegoten in de PDMS negatieve en toegestaan om7,18. Cellen werden vervolgens zaadjes in agarose wells, waar ze samengevoegd naar formulier zelf geassembleerd, steiger-vrije weefsel ringen in minder dan 24 h7,18. PDMS negatieven zijn autoclaaf kunnen vele malen worden hergebruikt en zijn zacht en flexibel, waardoor het gemakkelijk te verwijderen van de gestolde agarose putten. Wanneer dit systeem werd aanvankelijk gemeld in Gwyther et al. 7, PDMS negatieven werden gegoten uit gemalen polycarbonaat mallen (figuur 1A). Na agarose gieten, waren de cel seeding putten individueel uitgesneden en geplaatst in putjes van een 12-well plaat7,18. Het ontwerp is meer recent bewerkt zodat een enkele agarose schimmel 5 ringen produceert en in een put van een 6-well-plaat past, eliminerend de behoefte om individuele wells uitknippen en het verminderen van de hoeveelheid PDMS en agarose nodig voor de productie van elke ring (figuur 1B). Een kleinere cel zaaien trog breedte werd gebruikt ter vermindering van het aantal geplaatste cellen moeten bereiken ring vorming. Ondanks deze veranderingen, kan de resolutie en de aanpassing van mallen waren beperkt tot de afmetingen van de beschikbare standaard endmill, en micromilling onbetaalbaar. Bovendien, computer numerieke besturing (CNC) bewerking kan tijdrovend en omslachtig als gevolg van de noodzaak om tijd reserveren op zwaar gebruikt aangepaste apparatuur, extra computer-aided manufacturing (CAM) software voor het converteren van de (computer aided design CAD-) bestand naar een programmeerbare hulpmiddel pad, en een betrouwbare fixturing van het deel van de polycarbonaat tijdens het verspanen.
In de huidige studie onderzochten we het gebruik van 3D printen als alternatief voor CNC verspaning. 3D printen wordt veel gebruikt voor engineering aangepaste implantaten, steiger materialen, fabriceren en direct printen van cellen en weefsel spheroïden15,19,20. We gebruikten een high-resolution 3D-printer, en gespecialiseerde 3D printen materiaal waardoor ons om af te drukken een stijve mal met een gladde, glanzende oppervlak matteren (Zie Tabel van materialen). Onze techniek maakt het mogelijk voor de fabricage van hoogst klantgerichte, high-resolution plastic mallen die kunnen worden gebruikt voor het gieten van PDMS negatieven en agarose wells. Ontwerp iteraties worden samengevat in Figuur 1. Het ontwerp van de schimmel is verder bewerkt in de mal 3D-gedrukte versie met taps toelopende buitenmuren en een center-gat te verlichten van de verwijdering van zowel de PDMS negatieven van 3D-gedrukte mallen en de agarose putten uit PDMS negatieven. Deze spits toelopende functies worden niet bereikt met standaard verspanen van processen. De afstand van de onderkant van de putten naar de bodem van de mal werd verhoogd in deze iteratie, resulterend in een dikkere agarose basis onder de posten om het risico van posten breken tijdens het agarose goed verwijderen. De schimmel en ring fabricage-procedure is schematisch weergegeven in Figuur 2.

<table><tbody><tr><td>SeaKem LE Agarose</td><td>Lonza</td><td>50040</td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning Cellgro</td><td>15-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>VeroWhite</td><td>StrataSys</td><td>RGD835</td><td></td></tr><tr><td>3D printer</td><td>StrataSys</td><td>Objet 260 Connex</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning Cellgro</td><td>15-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Fisher</td><td>16000069</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-015-CI</td><td></td></tr><tr><td>Non-essential amino acids</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-025-CI</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-000-CI</td><td></td></tr><tr><td>Pen-strep</td><td>Corning Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-900-CI</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lonza</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td>6-well plate</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>WKY 3M-22 rat aortic smooth muscle cells</td><td>Verstrekt door T. Wight [ref 21]</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

fabricage van aangepaste agarose putten voor het zaaien van de cellen en weefsel ring zelf-assemblage met behulp van 3d-gedrukte mallen

Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds

Gemodificeerde weefsels worden klinisch gebruikt voor weefselherstel en vervanging, en worden ontwikkeld als instrument voor de drug screening en modellering van ziekten bij de mens. Zelf geassembleerde weefsels bieden voordelen ten opzichte van de steiger gebaseerde weefselengineering, zoals verbeterde matrix depositie, kracht en functie. Er zijn echter enkele beschikbare methoden voor het fabriceren van 3D weefsel zonder cellen op of in een ondersteunende steiger zaaien. Eerder, ontwikkelden we een systeem voor het fabriceren van zelf geassembleerde weefsel ringen door het zaaien van de cellen in niet-klevende agarose wells. Een Polydimethylsiloxaan (PDMS) negatieve werd eerst in een machinaal polycarbonaat mal gegoten, en vervolgens agarose was gegeleerde in de negatieve PDMS maken ringvormige cel zaaien wells. De veelzijdigheid van deze aanpak was echter beperkt door de resolutie van de tools beschikbaar voor de bewerking van de mal van polycarbonaat. Hier, we laten zien dat 3D-gedrukte kunststof kan worden gebruikt als alternatief voor machinaal polycarbonaat voor het fabriceren van PDMS negatieven. De 3D-gedrukte schimmel en de schimmel van de herziene ontwerp is eenvoudiger te gebruiken, goedkoop te produceren, en vereist aanzienlijk minder agarose en PDMS per cel zaaien goed. We hebben aangetoond dat de resulterende agarose putten kunnen worden gebruikt voor het maken van zelf geassembleerde weefsel ringen met aangepaste diameters uit een verscheidenheid van verschillende celtypes. Ringen kunnen vervolgens worden gebruikt voor histologisch, mechanische en functionele analyse, of voor het fabriceren van grotere en complexere buisvormige weefsels.

Dit systeem zorgt voor de eenvoudige, aangepaste fabricage van agarose cel zaaien wells, waarmee de cel zelf-assemblage van ringvormige 3D ontworpen weefsels. 3D printen kan betere resolutie en meer flexibiliteit in ontwerp van de schimmel dan verspanen van polycarbonaat, waar afmetingen worden beperkt door de beschikbare tool maten. Met een hoge resolutie 3D-printer, wanden zo dun als 0.254 mm kunnen worden afgedrukt, en via dimensies worden alleen beperkt door de resolutie van de printer (15.2 µm resolutie voor deze studies). Typisch, CNC endmills minder dan 0.3 mm zijn niet commercieel beschikbaar, dus het is niet mogelijk te maken van de troggen van kleinere breedtes. Micro-frezen kleinere functies kan produceren, hoewel de apparatuur vereist kan worden onbetaalbaar duur of ontoegankelijk voor veel biomedisch onderzoek labs. Trog afmetingen en kromtestraal zijn ook beperkt door de vorm van het endmill. Bovendien functies zoals schuin of taps toelopende muren zijn niet mogelijk, en kleine elementen kunnen breken tijdens het verspanen.
CAD-tekeningen kunnen eenvoudig worden aangepast voor de productie van de 3D-gedrukte mallen en PDMS negatieven van aanpasbare afmetingen. Figuur 3 beschrijft de afmetingen van onze huidige 2 mm post 3D-gedrukte mallen, in vergelijking met voorgaande ontwerp iteraties. Het proces is goedkoop; de 2 mm, 5-ring 3D-gedrukte schimmel kosten 44.67 USD naar 3D print en elk onderdeel kunnen worden gebruikt te maken van meerdere PDMS negatieven. Tot op heden hebben we meer dan 30 PDMS negatieven uit een enkele 3D-gedrukte schimmel. Elke negatieve vereist PDMS 0.11 USD 25 g / g (2.75 / USD per PDMS negatieve). Elke PDMS negatief kan worden gereinigd met wasmiddel, gesteriliseerde met autoclaaf, en hergebruikt voor tot jaren, afhankelijk van de frequentie van gebruik. In vergelijking met het oorspronkelijke ontwerp18, de compacte 3D-gedrukte mal gebruikt aanzienlijk minder PDMS en de agarose per 2 mm weefsel ring (figuur 1E).
Cellen zaadjes in de agarose geëquilibreerd putten samenvoegen toe aan het formulier weefsel ringen in minder dan 24 h. Ring afmetingen zijn afhankelijk van de afmetingen van de agarose putten. Hier, we laten zien dat zelf geassembleerde rat glad spierweefsel cel ringen kunnen worden vervaardigd in putjes met 2, 4 of 12 mm diameter berichten (Figuur 4). Terwijl ringen in deze studie alleen voor 3 dagen gekweekt werden, we hebben eerder hSMC ringen gedurende maximaal 2 weken22gekweekt, en hMSC-kraakbeen ringen voor maximaal 3 weken13. Zoals eerder gemeld, kunnen ringen functioneren zoals 3D in vitro modellen van menselijke weefsels voor kwantitatieve beoordeling van weefsel11 en mechanische sterkte13,22 functioneren, en ook dienen als modulaire gebouw eenheden kunnen buis-vormige weefsel constructies7,13te genereren. Cel seeding voorwaarden en functionele kenmerken van weefsel ringen ontworpen vanaf deze celtypes zijn samengevat in tabel 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56618/56618fig1.jpg"> Figuur 1: polycarbonaat schimmel ontwerpen. Aanvankelijk werden 15-well mallen machinaal in polycarbonaat (A). Een meer compact ontwerp (B), latere versies uitgerust met 5 putten die zijn ontworpen om te passen in een enkele polycarbonaat mal, en binnen één putje van de plaat van een 6-well. Hier, bewerkt we dit ontwerp gebruiken 3D-gedrukte kunststof als een beter aanpasbaar alternatief voor machinaal polycarbonaat (C). Weergegeven in (D) zijn agarose wells vervaardigd uit de eerste ontwerpen18 (links) in vergelijking met de huidige compacte ontwerp (rechts), die aanzienlijk minder agarose vereist, en vereist geen handmatige scheiding van putten. Hoeveelheden PDMS en agarose vereist voor elke iteratie ontwerp staan in (E). Centrum posten zijn 2 mm in diameter. Schimmel in()is 6 cm x 12 cm, (B) heeft een diameter van 5 cm, en (C) heeft een diameter van 6 cm. Schaal bar in (D) = 3 cm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56618/56618fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56618/56618fig2.jpg"> Figuur 2: fabricage van zelf geassembleerde weefsel ringen. Een 3D-gedrukte schimmel wordt gebruikt om te werpen een PDMS negatief, die vervolgens wordt gebruikt om te werpen de agarose putten (A). Cellen worden vervolgens rechtstreeks in de agarose putten, waar ze in minder dan 24 h van formulier weefsel ringen (B) totale overgeënt. Onderbroken lijnen in (B) weergeven het goed overzicht. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56618/56618fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56618/56618fig3.jpg"> Figuur 3: transversale weergave van 3D-gedrukte schimmel CAD tekening. Afmetingen voor trog breedte (A), trog hoogte (B), center gat (C), totale doorsnede (D), buitenste lip (E) en buitenmuur hoogte (F) worden weergegeven. De buitenmuren (1), bovenste gedeelte van de putten (2), en centrum gat (3) zijn kegelvormige (onder een hoek van 5 ° voor 1 en 3, 45 ° voor 2) ter verbetering van gebruiksgemak PDMS negatieve verwijdering. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56618/56618fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56618/56618fig4.jpg"> Figuur 4: CAD tekeningen met bijbehorende PDMS negatieven en zelf geassembleerde SMC ringen met 2 (A), 4 (B) en 12 (C) mm post diameters. In(),(1) geeft aan een inkeping voor het verstrekken van oriëntatie, (2) geeft aan een centraal boorgat ter verbetering van de perfusie, (3) is een dossiernummer, die rechtstreeks op de negatieven PDMS stempelt, en (4) weergave van de buitenste muur, die kegelvormige is om te verlichten PDMS negatieve verwijdering. Schaal van balken in de agarose wells = 1 cm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56618/56618fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Celtype</td>
			<td>Cellen zaadjes per ring</td>
			<td>De diameter van de ring</td>
			<td>Duur van de cultuur</td>
			<td>Functionele analyse uitgevoerd</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rat SMC</td>
			<td>0.5, 1 of 3 x 106
</td>
			<td>2, 4 of 12 mm</td>
			<td>3 dagen</td>
			<td>Huidige studie; N/B</td>
		</tr>
<tr>
<td>
iPSC afgeleid SMC 11
</td>
			<td>0,6 x 106
</td>
			<td>2 mm</td>
			<td>17 dagen</td>
			<td>Contractility testen, eenassige treksterkte test, histologisch analyse</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Menselijke SMC 22
</td>
			<td>0,4 x 106
</td>
			<td>2 mm</td>
			<td>2, 7 of 14 dagen</td>
			<td>Eenassige treksterkte test, histologisch analyse</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Menselijke MSC 14
</td>
			<td>0,4 x 106
</td>
			<td>2 mm</td>
			<td>21 dagen</td>
			<td>Eenassige treksterkte test, histologisch analyse, ring fusion en buis compressie testen, differentiatie in kraakbeen weefsel</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Cel nummers die nodig zijn voor de fabricage van de ring van verschillende celtypes.

Dit protocol beschrijft een platform voor het fabriceren van zelf geassembleerde weefsel ringen in verschillende afmetingen met behulp van een aangepaste 3D-gedrukte kunststof schimmel. PDMS negatieven worden genezen in de 3D-gedrukte mal; vervolgens is agarose gegoten in de uitgeharde PDMS negatieven. Cellen worden overgeënt in de resulterende agarose putten waar ze in weefsel ringen aggregaat.

Fabricage van aangepaste Agarose putten voor het zaaien van de cellen en weefsel Ring zelf-assemblage met behulp van 3D-gedrukte mallen

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease ...

Het algemene doel van deze procedure is om aangepaste celzaai-malen te creëren die worden gebruikt om zelfsamengestelde weefselringen van verschillende afmetingen te maken. Deze methode stelt ons in staat om driedimensionale weefselringen van menselijke cellen te maken die kunnen worden gebruikt om weefselstructuur, sterkte en functie te evalueren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een eenvoudige methode is om mallen te fabriceren voor zelfsamengestelde weefsels met aangepaste afmetingen.Om de procedure te beginnen, gebruik computer-aided design-software om een tekening van een mal in de gewenste afmetingen te maken. Stuur het CAD-bestand naar een 3D-printer met hoge resolutie. Druk de mal af in een plastic met een glanzende afwerking die stabiel is bij 50 graden Celsius.Was de gedrukte mal grondig met een borstel, detergent en water. Spoel de mal met gedestilleerd water af en laat het in een rek drogen. Het is belangrijk om een 3D-geprinte kunststof te kiezen die stabiel is bij de PDMS-uithardingstemperatuur.Residuen die tijdens het verwarmen op PDMS worden overgedragen, kunnen de ringvorming beïnvloeden. Meet vervolgens 25 gram PDMS-basis in een wegwerp weegbakje. Voeg geneesmiddel toe in een verhouding van 1:10 op gewicht en roer krachtig totdat de basis en het geneesmiddel grondig zijn gemengd.Bevestig vervolgens laboratoriumtape rond de zijden van de mal om een muur van ongeveer een centimeter hoog rond het gezicht met de gedrukte putjes te vormen. Zorg ervoor dat er geen openingen in de tapemuur zijn. Giet het PDMS-mengsel in de 3D-geprinte mal.Ontgas het PDMS in een vacuümkamer gedurende 30 tot 60 minuten of totdat er geen bubbels meer over zijn. Laat het PDMS uitharden bij 50 graden Celsius gedurende twee tot vier uur of totdat het PDMS voldoende stevig is om uit de mal te worden verwijderd. Verwijder vervolgens het tape en scheid voorzichtig het PDMS-negatief van de mal.Incubeer het PDMS-negatief in een oven bij 60 graden Celsius gedurende één uur om ervoor te zorgen dat het volledig is uitgehard. Was vervolgens het negatief grondig met detergent en water. Spoel de mal met gedestilleerd water af en laat het drogen.Voorafgaand aan het fabriceren van de agarose mal, sterieliseer het PDMS-negatief, een paar stompe krachttangen en alle andere gewenste gereedschappen. Om met fabricage te beginnen, bereid en sterieliseer ten minste 50 milliliter twee procent agarose in DMEM. Bereid agarose putjes een dag voor het zaaien van de ring voor.Pipetteer vier milliliter gesmolten agarose in het gesteriliseerde PDMS-negatief, zorg ervoor dat u de mal niet overvult. Pipetteer vervolgens gesmolten agarose in de holtes voor de agarose putjes. Gebruik de pipettenpunt om alle luchtbellen te verwijderen.Het uiteindelijke agarose oppervlak moet vlak zijn. Laat de agarose ongeveer 10 minuten afkoelen. Gebruik vervolgens stompe krachttangen om voorzichtig het gekoelde agarose mal van het PDMS-negatief te scheiden.Plaats de mal met de zijde omhoog in een put van een zes-puttenplaat. Voeg het juiste volledige kweekmedium toe aan de plaatput zodat de agarose putjes volledig ondergedompeld zijn. Laat de agarose putjes overnacht bij 37 graden Celsius gelijkwaardig worden voor gebruik.Kweek eerst Rat Aortic Smooth Muscle Cellen bij 37 graden Celsius in een 5 procent koolstofdioxide atmosfeer in een 15 centimeter kweekschaal tot 70 procent confluentie is bereikt. Zodra de gewenste agarose mal is voorbereid en overnacht is geëquilibreerd, spoel de kweekschaal twee keer met vijf milliliter fosfaatgebufferd zout water. Verwijder het PBS en voeg drie milliliter van 0,25 procent trypsine toe aan de schaal.Incubeer bij 37 graden Celsius gedurende twee tot drie minuten of totdat de cellen van de schaal zijn losgelaten. Neutraliseer de trypsine met drie milliliter van het volledige kweekmedium. Breng de cellen over naar een conische buis en pipetteer de cellen voorzichtig tot ze volledig zijn opgeschort.Verdun een aliquot van de celsuspensie met een gelijk volume trypan blauw kleurstof en tel de cellen met een hemocytometer. Centrifugeer vervolgens de suspensie bij 200 keer G gedurende vijf minuten. Verwijder het supernatant en schud de cellen opnieuw op in volledig kweekmedium om een concentratie van 10 miljoen cellen per milliliter te bereiken.De belangrijkste stappen om consistente ringvorming te garanderen zijn het optimaliseren van het aantal cellen en het kweekmedium voor de cellijn die u gebruikt. Verkrijg vervolgens de geëquilibreerde agarose putjes. Zuig voorzichtig al het medium van zowel rond de buitenkant van de agarose als binnen de agarose putjes, zorg ervoor dat u de bodems van de putjes niet doorboort.Pipetteer 50 microliter van de celsuspensie in elk putje. Voeg twee milliliter vers medium toe rond de buitenkant van de agarose putjes zonder het medium in de putjes te laten lekken. Incubeer de plaat een nacht bij 37 graden Celsius in een vijf procent CO2-atmosfeer om cellen te laten aggregatie.Aspibeer vervolgens het medium van buiten de agarose. Voeg 4,5 milliliter vers medium toe aan de plaatput zodat de agarose putjes gevuld zijn en de volledige agarose mal volledig is ondergedompeld. Blijf de plaat incuberen totdat de weefselringen voldoende zijn ontwikkeld, vervang het medium elke dag.Schuif vervolgens voorzichtig elke weefselring van zijn pen met behulp van een pincet. Bevestig onmiddellijk de ringen voor histologie, of gebruik de ringen voor functionele of mechanische beoordelingen. 3D-printen maakte een flexibelere malontwerp mogelijk.De diameters van de pennen werden gemakkelijk gevarieerd, zoals wordt getoond door ratten gladde spiercellenringen die zijn gemaakt rond pennen met diameters van twee, vier en twaalf millimeter. Weefselringen zijn ook bereid uit primaire menselijke SMC's, menselijke mesenchymale stamcellen en SMC's afgeleid uit geïnduceerde pluripotente stamcellen. De ringen zijn gebruikt als in vitro weefselmodellen voor beoordelingen van weefselfunctie en mechanische sterkte.Hoewel deze

fabrication-custom-agarose-wells-for-cell-seeding-tissue-ring-self

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Dit artikel schetst een veelzijdige methode om uit de cel afkomstige weefsel ringen te creëren door cellulaire zelf-assemblage. Gladde spiercellen gezaaid in de ring-vormige agarose putten aggregaat en contract tot robuuste driedimensionale (3D) weefsels maken binnen de 7 dagen. Millimeter schaal weefsel ringen bevorderlijk zijn voor mechanische testen en dienen als bouwstenen voor weefsel montage.

Gericht Cellular Self-Assembly to Cell-Derived weefsel Rings fabriceren voor Biomechanische Analyse en Tissue Engineering

Een bioprinter werd gebruikt om gevormde hydrogelen gebaseerd op een offer mal maken. De poloxamer mal werd opgevuld met een tweede hydrogel en vervolgens geëlueerd, waardoor holtes die gevuld waren met een derde hydrogel. Deze methode maakt gebruik van snelle elutie en goede bedrukbaarheid van poloxameer om complexe architecturen uit biopolymeren genereren.

Afdrukken warmteresponsieve Reverse Mallen voor de schepping van Patterned Hydrogelen Twee-component voor 3D Cell Culture

Engineering en analyse van dragende weefsels met heterogene celpopulaties is nog steeds een uitdaging. Hier beschrijven we een methode voor het maken van bi-gelaagde alginaat-hydrogelschijven als platform voor co-cultuur van diverse celpopulaties binnen één constructie.

Gelaagde Alginaat Constructen: Een platform voor Co-cultuur van heterogene celpopulaties

Schaalbare engineered bloedvaten zou de klinische toepasbaarheid te verbeteren. Gebruik gemakkelijk aanzienlijke 3D gedrukte geleiders, ringen van vasculaire gladde spieren zijn gemaakt en gestapeld in een buisvormige vorm, die een vasculair transplantaat. Enten kan worden aangepast aan de reeks van menselijke kransslagader afmetingen voldoen door eenvoudig de 3D gedrukte handleiding te wijzigen.

Het schalen van Engineered Vascular Enten Met behulp van 3D-Gedrukt Gidsen en de Ring Stapelen Method

Hierin presenteren wij een snelle, facile en goedkope methode voor het fabriceren van aangepaste Polydimethylsiloxaan mallen die kunnen worden gebruikt voor de productie van hydrogel gebaseerde gemodificeerde weefsels met complexe geometrieën. Daarnaast beschrijven we resultaten van mechanische en histologische evaluaties uitgevoerd op gemanipuleerde cardiale weefsels geproduceerd met behulp van deze techniek.

Aangepaste ontworpen weefselkweek mallen van Laser-geëtst meesters

Het protocol beschrijft high-throughput sferoïde generatie voor bioprinting met behulp van de multi-parametrische analyse van hun oxygenatie en celdood op een standaard fluorescentiemicroscoop. Deze aanpak kan worden toegepast om de levensvatbaarheid van de sferoïden te controleren en standaardisatie uit te voeren, wat belangrijk is bij het modelleren van 3D-weefsel, tumormicro-omgeving en succesvolle (micro)weefselbiofabricage.

Betaalbare zuurstofmicroscopie-geassisteerde biofabricage van meercellige sferoïden

Het huidige protocol beschrijft een techniek om op grote schaal en kosteneffectief weefselsferoïden te produceren met behulp van een 3D-geprint stempelachtig apparaat.

Genereren van weefselsferoïden via een 3D-geprint stempelachtig apparaat

Dit artikel presenteert een fabricageprotocol voor een nieuw type kweeksubstraat met honderden microcontainers per mm2, waarin organoïden kunnen worden gekweekt en waargenomen met behulp van microscopie met hoge resolutie. De protocollen voor het zaaien en immunostainen van cellen zijn ook gedetailleerd.

Een high-throughput platform voor cultuur en 3D-beeldvorming van organoïden

Deze studie presenteert een kosteneffectieve en efficiënte methodologie voor het genereren van 3D-celstructuren met behulp van een op stempels gebaseerd systeem om microwells in agaroseschimmels te maken. Het systeem bevordert de vorming van uniforme sferoïden/organoïden, waardoor de celinteracties worden verbeterd. Deze aanpak vermindert de experimentele variabiliteit en ondersteunt toepassingen in het testen van geneesmiddelen en weefselmanipulatie.

Generatie van driedimensionale sferoïden/organoïden uit tweedimensionale celculturen met behulp van een nieuw stempelapparaat

We beschrijven methoden om ovariële follikels te kweken in een nieuwe steigervrije agaroseschimmel die een aanvulling vormt op in vitro gametogenese.

Productie en gebruik van aanpasbare agarose-mallen voor steigervrije ovariële follikelcultuur van muizen

Leer een eenvoudige methode voor het fabriceren van aangepaste agarose putten met 3D-geprinte mallen voor zelf-assemblage van weefselringen. Deze techniek maakt onderzoek naar structuur en functie van menselijke cellen mogelijk.

Fabricage van aangepaste Agarose putten voor het zaaien van de cellen en weefsel Ring zelf-assemblage met behulp van 3D-gedrukte mallen (Video) | JoVE Journal

Fabricage van aangepaste Agarose putten voor het zaaien van de cellen en weefsel Ring zelf-assemblage met behulp van 3D-gedrukte mallen

Meer video's verkennen