Fabricage van aangepaste Agarose putten voor het zaaien van de cellen en weefsel Ring zelf-assemblage met behulp van 3D-gedrukte mallen
2 april 2018
Dit protocol beschrijft een platform voor het fabriceren van zelf geassembleerde weefsel ringen in verschillende afmetingen met behulp van een aangepaste 3D-gedrukte kunststof schimmel. PDMS negatieven worden genezen in de 3D-gedrukte mal; vervolgens is agarose gegoten in de uitgeharde PDMS negatieven. Cellen worden overgeënt in de resulterende agarose putten waar ze in weefsel ringen aggregaat.
Het algemene doel van deze procedure is om aangepaste celzaai-malen te creëren die worden gebruikt om zelfsamengestelde weefselringen van verschillende afmetingen te maken. Deze methode stelt ons in staat om driedimensionale weefselringen van menselijke cellen te maken die kunnen worden gebruikt om weefselstructuur, sterkte en functie te evalueren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een eenvoudige methode is om mallen te fabriceren voor zelfsamengestelde weefsels met aangepaste afmetingen.
Om de procedure te beginnen, gebruik computer-aided design-software om een tekening van een mal in de gewenste afmetingen te maken. Stuur het CAD-bestand naar een 3D-printer met hoge resolutie. Druk de mal af in een plastic met een glanzende afwerking die stabiel is bij 50 graden Celsius.
Was de gedrukte mal grondig met een borstel, detergent en water. Spoel de mal met gedestilleerd water af en laat het in een rek drogen. Het is belangrijk om een 3D-geprinte kunststof te kiezen die stabiel is bij de PDMS-uithardingstemperatuur.
Residuen die tijdens het verwarmen op PDMS worden overgedragen, kunnen de ringvorming beïnvloeden. Meet vervolgens 25 gram PDMS-basis in een wegwerp weegbakje. Voeg geneesmiddel toe in een verhouding van 1:10 op gewicht en roer krachtig totdat de basis en het geneesmiddel grondig zijn gemengd.
Bevestig vervolgens laboratoriumtape rond de zijden van de mal om een muur van ongeveer een centimeter hoog rond het gezicht met de gedrukte putjes te vormen. Zorg ervoor dat er geen openingen in de tapemuur zijn. Giet het PDMS-mengsel in de 3D-geprinte mal.
Ontgas het PDMS in een vacuümkamer gedurende 30 tot 60 minuten of totdat er geen bubbels meer over zijn. Laat het PDMS uitharden bij 50 graden Celsius gedurende twee tot vier uur of totdat het PDMS voldoende stevig is om uit de mal te worden verwijderd. Verwijder vervolgens het tape en scheid voorzichtig het PDMS-negatief van de mal.
Incubeer het PDMS-negatief in een oven bij 60 graden Celsius gedurende één uur om ervoor te zorgen dat het volledig is uitgehard. Was vervolgens het negatief grondig met detergent en water. Spoel de mal met gedestilleerd water af en laat het drogen.
Voorafgaand aan het fabriceren van de agarose mal, sterieliseer het PDMS-negatief, een paar stompe krachttangen en alle andere gewenste gereedschappen. Om met fabricage te beginnen, bereid en sterieliseer ten minste 50 milliliter twee procent agarose in DMEM. Bereid agarose putjes een dag voor het zaaien van de ring voor.
Pipetteer vier milliliter gesmolten agarose in het gesteriliseerde PDMS-negatief, zorg ervoor dat u de mal niet overvult. Pipetteer vervolgens gesmolten agarose in de holtes voor de agarose putjes. Gebruik de pipettenpunt om alle luchtbellen te verwijderen.
Het uiteindelijke agarose oppervlak moet vlak zijn. Laat de agarose ongeveer 10 minuten afkoelen. Gebruik vervolgens stompe krachttangen om voorzichtig het gekoelde agarose mal van het PDMS-negatief te scheiden.
Plaats de mal met de zijde omhoog in een put van een zes-puttenplaat. Voeg het juiste volledige kweekmedium toe aan de plaatput zodat de agarose putjes volledig ondergedompeld zijn. Laat de agarose putjes overnacht bij 37 graden Celsius gelijkwaardig worden voor gebruik.
Kweek eerst Rat Aortic Smooth Muscle Cellen bij 37 graden Celsius in een 5 procent koolstofdioxide atmosfeer in een 15 centimeter kweekschaal tot 70 procent confluentie is bereikt. Zodra de gewenste agarose mal is voorbereid en overnacht is geëquilibreerd, spoel de kweekschaal twee keer met vijf milliliter fosfaatgebufferd zout water. Verwijder het PBS en voeg drie milliliter van 0,25 procent trypsine toe aan de schaal.
Incubeer bij 37 graden Celsius gedurende twee tot drie minuten of totdat de cellen van de schaal zijn losgelaten. Neutraliseer de trypsine met drie milliliter van het volledige kweekmedium. Breng de cellen over naar een conische buis en pipetteer de cellen voorzichtig tot ze volledig zijn opgeschort.
Verdun een aliquot van de celsuspensie met een gelijk volume trypan blauw kleurstof en tel de cellen met een hemocytometer. Centrifugeer vervolgens de suspensie bij 200 keer G gedurende vijf minuten. Verwijder het supernatant en schud de cellen opnieuw op in volledig kweekmedium om een concentratie van 10 miljoen cellen per milliliter te bereiken.
De belangrijkste stappen om consistente ringvorming te garanderen zijn het optimaliseren van het aantal cellen en het kweekmedium voor de cellijn die u gebruikt. Verkrijg vervolgens de geëquilibreerde agarose putjes. Zuig voorzichtig al het medium van zowel rond de buitenkant van de agarose als binnen de agarose putjes, zorg ervoor dat u de bodems van de putjes niet doorboort.
Pipetteer 50 microliter van de celsuspensie in elk putje. Voeg twee milliliter vers medium toe rond de buitenkant van de agarose putjes zonder het medium in de putjes te laten lekken. Incubeer de plaat een nacht bij 37 graden Celsius in een vijf procent CO2-atmosfeer om cellen te laten aggregatie.
Aspibeer vervolgens het medium van buiten de agarose. Voeg 4,5 milliliter vers medium toe aan de plaatput zodat de agarose putjes gevuld zijn en de volledige agarose mal volledig is ondergedompeld. Blijf de plaat incuberen totdat de weefselringen voldoende zijn ontwikkeld, vervang het medium elke dag.
Schuif vervolgens voorzichtig elke weefselring van zijn pen met behulp van een pincet. Bevestig onmiddellijk de ringen voor histologie, of gebruik de ringen voor functionele of mechanische beoordelingen. 3D-printen maakte een flexibelere malontwerp mogelijk.
De diameters van de pennen werden gemakkelijk gevarieerd, zoals wordt getoond door ratten gladde spiercellenringen die zijn gemaakt rond pennen met diameters van twee, vier en twaalf millimeter. Weefselringen zijn ook bereid uit primaire menselijke SMC's, menselijke mesenchymale stamcellen en SMC's afgeleid uit geïnduceerde pluripotente stamcellen. De ringen zijn gebruikt als in vitro weefselmodellen voor beoordelingen van weefselfunctie en mechanische sterkte.
Hoewel deze
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode voor het creëren van zelfgeassembleerde weefselringen van verschillende formaten met behulp van een aangepaste 3D-geprinte mal. Het proces omvat het fabriceren van PDMS-negatieven en het gieten van agarose om putjes voor celaggregatie te creëren.
Belangrijke componenten van de studie
Wetenschapsgebied
- Tissue Engineering
- Celkweek
- 3D-printen
Achtergrond
- Zelfgeassembleerde weefselringen kunnen worden gebruikt om de structuur en functie van weefsels te bestuderen.
- 3D-printen maakt aanpasbare ontwerpvormen van mallen mogelijk.
- Deze techniek kan worden toegepast op diverse weefseltypen, waaronder vasculaire en cardiale weefsels.
- Het optimaliseren van het celaantal en de kweekcondities is cruciaal voor een succesvolle vorming van de weefselringen.
Doel van de studie
- Om een eenvoudige methode te ontwikkelen voor het vervaardigen van weefselringen met specifieke afmetingen.
- Om de mechanische eigenschappen en functionaliteit van engineered weefsels te evalueren.
- Om een platform te bieden voor het bestuderen van verschillende celtypen in weefseltechnologie.
Gebruikte methoden
- Ontwerpen van mallen met CAD-software en het 3D-printen hiervan in stabiel plastic.
- Creëren van PDMS-negatieven en agarose-putjes voor het zaaien van cellen.
- Zaaien van cellen in agarose-putjes en deze laten aggregeren tot weefselringen.
- Beoordelen van de gevormde weefselringen op structurele en functionele eigenschappen.
Belangrijkste resultaten
- Weefselringen zijn met succes gevormd uit diverse celtypen, waaronder menselijke gladde spiercellen.
- De methode demonstreerde flexibiliteit in het ontwerp van de mal en de fabricage van weefsel.
- De ringen werden gebruikt voor in vitro beoordelingen van de weefselfunctie en mechanische sterkte.
- Verschillende dimensies van weefselringen werden bereikt door de diameters van de pinnen in de malen te variëren.
Conclusies
- Dit protocol biedt een eenvoudige en effectieve manier om op maat gemaakte weefselringen te creëren.
- Het kan worden aangepast voor diverse toepassingen binnen de weefseltechnologie.
- De techniek verbetert de studie naar engineered weefsels en hun eigenschappen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie
Deze methode stelt biopharma R&D-teams in staat om aanpasbare, scaffold-vrije weefselringen te genereren voor preklinische modellering, wat bijdraagt aan het mechanistische de-risking van therapeutische kandidaten. Door een nauwkeurige controle over de dimensies en samenstelling van het weefsel mogelijk te maken, verhoogt het de voorspellende betrouwbaarheid in workflows voor targetvalidatie en assayontwikkeling in een vroeg stadium. De aanpak vermindert de afhankelijkheid van scaffold-gebaseerde systemen, waardoor de translationele relevantie voor drugscreening en toepassingen voor ziekmodellering wordt verbeterd.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk via zelfgeassembleerde weefselringen die de functionaliteit van signaalpaden en de binding aan het doelwit verduidelijken.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door een reproduceerbaar systeem te bieden voor de evaluatie van doelwitmodulatie in 3D-weefselcontexten.
- Voorspellende waarde: Verbetert de triage van portfolio's door functionele readouts te genereren die correleren met weefselresponsen op verbindingen.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Produceert gestandaardiseerde, steiger-vrije weefselringen die geschikt zijn voor kwantitatieve beoordeling van de effecten van verbindingen op de weefselmechanica en -functie.
- Operationele waarde: Maakt assay-gereedheid mogelijk door reproduceerbare fabricage van agarose-putjes, waardoor de variabiliteit in downstream screeningcampagnes wordt verminderd.
- Schaalbaarheid: Faciliteert hergebruik van het platform voor meerdere celtypen en weefselmodellen, wat efficiënte evaluatiecascades van verbindingen ondersteunt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen ontdekking en preklinische validatie door weefselringen te genereren die de oorspronkelijke weefselstructuur en mechanische eigenschappen nabootsen.
- Ziekterellevant systeem: Ondersteunt de modellering van vasculaire, cardiale, skeletspier- en kraakbeenweefsels met behulp van primaire bronnen of uit stamcellen afgeleide bronnen.
- Risico-gecorrigeerde vooruitgang: Biedt functionele en histologische eindpunten om go/no-go-beslissingen te onderbouwen vóór in vivo-studies.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode kan worden geïntegreerd in vroege discovery-workflows door hypothesegestuurde weefselfabricage mogelijk te maken, wat ten behoeve van lead-identificatie informatie verschaft via functionele en mechanische fenotypering.
- Discovery Biology: Ondersteunt het verminderen van mechanistische risico's door teams in staat te stellen doelwitafhankelijke weefselvorming, sterkte en functie te beoordelen in een gecontroleerde 3D-omgeving.
- Screening: Levert assay-klare weefselringen met consistente afmetingen, waardoor betrouwbare compound-screening voor fenotypes op weefselniveau mogelijk wordt.
- Analytics: Biedt kwantitatieve resultaten, waaronder weefseldiameter, contractiekracht en histologische markers voor comparatieve conditieanalyse.
- Translationeel Onderzoek: Waarborgt continuïteit van discovery naar preklinisch gebruik door weefselmodellen te genereren die toepasbaar zijn voor mechanische, functionele en histologische evaluatie.
- Enterprise Hergebruik: Positioneert de 3D-geprinte mal-workflow als een herbruikbaar platform voor het genereren van diverse weefselringen over verschillende projecten en celtypen heen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen door mechanische ambiguïteit in weefsel-doelwitinteracties te verminderen.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie en reproduceerbaarheid via aanpasbare fabricage van mallen met een lage variantie.
- Strategische waarde: Verhoogt de kapitaalefficiëntie door snelle iteratie van weefselmodellen mogelijk te maken zonder scaffold-gerelateerde artefacten.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering door vroege functionele gegevens over tissue-engineered modellen te leveren.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in CAD-ontwerp, 3D-printen en steriele weefselkweektechnieken.
- Toegang tot een 3D-printer die in staat is om glanzende, hittebestendige plastic onderdelen te produceren en standaard apparatuur voor de bereiding van PDMS/agarose is noodzakelijk.
- Vraagt om cross-team standaardisatie van malontwerpparameters, celzaaidichtheden en kweekcondities voor reproduceerbare resultaten.
- Houdt rekening met aanpassingen bij het toepassen van de methode op verschillende celtypen of weefseldoelen, met name met betrekking tot de agaroseconcentratie en de diameter van de post.
- Omvat praktische beperkingen, zoals de noodzaak van nauwkeurige agarosegietvorming om vervorming van de wells te voorkomen en het belang van het optimaliseren van het aantal cellen per well voor een consistente ringvorming.
