De inname van TL, magnetische nanodeeltjes voor de bepaling van de vloeistof-opname capaciteiten in de insecten
20 december 2017
Vloeistof-voeding insecten hebben de mogelijkheid om minieme hoeveelheden van vloeistoffen uit poreuze oppervlakken te verwerven. Dit protocol beschrijft een methode om te bepalen direct de mogelijkheid voor insecten innemen van vloeistoffen uit poreuze oppervlakken met behulp van voeding oplossingen met fluorescerende, magnetische nanodeeltjes.
Het algemene doel van deze procedure is om fysiologische parameters van het voeden bij vloeistofvoedende insecten te beoordelen met behulp van een sucrose-oplossing gemengd met fluorescente magnetische nanodeeltjes. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het entomologieveld te beantwoorden, zoals structuur-functierelaties van insectenmonddelen en insectenvoedingsmechanismen. Het grote voordeel van deze techniek is dat het ons in staat stelt om te bepalen of insecten in staat zijn om vloeistoffen in te nemen die aanwezig zijn als poeltjes of als vloeistoffilms.
Deze demonstratie maakt gebruik van blauwe flesvliegen omdat hun vloeistofpompcapaciteiten en monddeelmorfologie goed gedocumenteerd zijn. Huisvliegen, koolvlinders en andere vloeistofvoedende insecten zouden kunnen worden gebruikt. Verkrijg vliegpupae en plaats ze in een omgevingskamer met 18 uur licht per dag en bij 23 graden Celsius.
Nadat de volwassenen uit hun pupae zijn gekomen, voer ze niet voor het experiment. Bereid voor het experimentele voedsel een 20 procent sucrose-oplossing met 0,5 milligram nanodeeltjes per milliliter. Bereid vervolgens een voedingsstation voor, bestaande uit een manipulator, een klem en een voedingsplatform.
Op het voedingsplatform houdt u het voedsel vast met een concave schuif. Bereid ook verschillende nylon netfilters en membraanfilters van verschillende poriëngroottes voor om de concave schuif te bedekken. Begin met het in een gevouwen weefselpapier vouwen van de lichaamsdelen, poten en vleugels van het insect.
Laat alleen het hoofd en de monddelen bloot. Terwijl u dit doet, houdt u het insect vast door de vleugels samen te knijpen. Zet nu de in weefselpapier gewikkelde vleugels tussen twee microscoopglazen.
Klem vervolgens de twee glazen vast en bevestig de klem aan een manipulator. Bevestig vervolgens het insect boven het voedingsplatform met behulp van de manipulator. Deponeer vervolgens 30 microliter voedingsoplossing in het midden van de concave schuif en bedek de oplossing met een poreus stuk filterpapier.
De druppel zal zich verspreiden langs het filterpapier en de poriën vullen. Positioneer vervolgens het insect zodat de distale delen van de monddelen contact kunnen maken met het bevochtigde filterpapier, zodat alleen het platte deel van de schuif kan worden bereikt en het insect niet kan voeden vanuit het concave gebied. Gebruik nu een insectenspeld om de monddelen op het filterpapier uit te strekken en laat het insect 45 seconden voeden.
Als het insect geen interesse toont in voeden, houdt u de monddelen gedurende de hele 45 seconden aan het filterpapier vast met behulp van de speld. Dit voltooit het voedingsprotocol. Voor de dissectie, laad een 50 milliliter horlogeglas met voldoende PBS om het lichaam van het insect te bedekken.
Stel dit op samen met alle dissectiegereedschappen bij de microscoop. Verwijder nu het insect van het weefselpapier en houd de vleugels gesloten. Verwijder vervolgens het hoofd, de poten en de vleugels met behulp van microdissectie-schaarjes en plaats de borst en buik in de PBS.
Om de darm te dissecteren, pakt u eerst het distale buikcutikel en snijdt u de cutikel in een anterieure richting langs de laterale zijde van het achterste uiteinde tot aan de borst. Zorg ervoor dat alleen de cutikel wordt gesneden en dat de spijsverteringskanaal niet wordt beschadigd. Verwijder vervolgens het buikcutikel, de vetlichaam en andere structuren met behulp van insectenpinnen totdat alleen de borst en het spijsverteringskanaal in het horlogeglas achterblijven.
Nu, identificeer de crop. Het is een zak-achtige structuur, gelegen nabij de verbinding van de borst en buik. Indien nodig, maak aanvullende insnijdingen in de borst om de crop te onthullen.
Snijd vervolgens de resterende borst weg en laat alleen het spijsverteringskanaal en de crop over. Om de aanwezigheid van ingenomen nanodeeltjes te testen, begint u door een fijne dissectiestang te gebruiken om de crop over te brengen naar een dekglas voor beeldvorming. Wees voorzichtig om scheuring van de crop te voorkomen.
Beeld de crop onmiddellijk af op een omgekeerde confocale microscoop met 20 keer vergroting met behulp van het CY3-kanaal of fasecontrast. Om ingenomen nanodeeltjes te identificeren, zwaai met een magnetische roerstaaf ongeveer 10 millimeter van de crop. Laat elke voor- en terugbeweging ongeveer een seconde duren.
Terwijl u de magneet zwaait, beweegt u langzaam de bedieningsfase om te scannen op beweging van nanodeeltjes binnen de bijna transparante crop. Als de nanodeeltjes aanwezig zijn in de crop, zullen ze in eens bewegen met de magnetische roerstaaf. Een insect dat voedt op oplossing van een poreus oppervlak moet een stabiele vloeistofbrug creëren via plateau-instabiliteit om de capillaire druk te overwinnen die de vloeistof in de poriën houdt.
Er wordt voorspeld dat de grootte van de voedingsleiding van een insect de kleinste poriëngrootte zal bepalen van waaruit ze kunnen voeden. Nadat insecten zijn gedisseceerd om te beoordelen of nanodeeltjes zijn ingenomen, werden hun monddelen gefotografeerd om de grootte van de voedselkanaalconduit te meten. Voor vliegen werd de diameter van de pseudotrachea en de orale opening gemeten.
Analyse van de ingenomen nanodeeltjes suggereert een nauwe relatie tussen de distale monddeelconduit grootte en de kleinste poriëngrootte waaruit een insect kan voeden. Deze relatie is niet te zien bij de proximale monddelen. Bijgevolg zou vloeistofopwaak voor dipteranen eerst plaatsvinden in de pseudotrachea in plaats van de orale opening en moet capillaire werking een belangrijke rol spelen in de voeding.
Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u insecten een nanodeeltjesoplossing kunt voeren, ze kunt dissecteren om hun crop te isoleren en vervolgens de crop kunt inspecteren op nanodeeltjes. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om voorzichtig te zijn tijdens de dissecties. Als de crop scheurt, kan het de vloeibare inhoud en nanodeeltjes morsen
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode voor het beoordelen van het vermogen van insecten om vloeistoffen op te nemen, waarbij specifiek wordt gefocust op hun vermogen om vloeistoffen van poreuze oppervlakken te consumeren. Door gebruik te maken van een sucrose-oplossing gemengd met fluorescerende magnetische nanodeeltjes, kunnen onderzoekers inzicht verkrijgen in de voedingsmechanismen van insecten.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Entomologie
- Insectenfysiologie
- Voedingsmechanismen
Achtergrond
- Vloeistofetende insecten kunnen vloeistoffen uit diverse oppervlakken extraheren.
- De structuur en functie van de monddelen van insecten zijn cruciaal voor het begrip van het voedingsproces.
- Deze methode kan worden toegepast op meerdere soorten vloeistofetende insecten.
- Blauwe bottlevliegen worden gebruikt vanwege hun goed gedocumenteerde voedingscapaciteiten.
Doel van de studie
- Om de fysiologische parameters van vloeistofopname bij insecten te evalueren.
- Om de relatie tussen de structuur van de monddelen en de voedingsefficiëntie te onderzoeken.
- Om het vermogen van insecten vast te stellen om vloeistoffen uit poelen en films op te nemen.
Gebruikte methoden
- Bereiding van een sucrose-oplossing met fluorescerende magnetische nanodeeltjes.
- Gebruik van blauwe bottleflies voor demonstratie vanwege hun bekende vermogen tot vloeistofopname.
- Opstelling van een milieukamer met gecontroleerde licht- en temperatuuromstandigheden.
- Directe observatie van het voedingsgedrag op poreuze oppervlakken.
Belangrijkste resultaten
- De mogelijkheid van insecten om vloeistoffen van diverse oppervlakken op te nemen is aangetoond.
- Inzicht is verschaft in de mechanica van het voedingsgedrag bij insecten.
- Het gebruik van fluorescerende magnetische nanodeeltjes in voedingsstudies is gevalideerd.
- Het potentieel voor toepassing bij andere vloeistofetende insectensoorten is aangetoond.
Conclusies
- Deze methode is effectief voor het bestuderen van vloeistofinname bij insecten.
- Inzicht in voedingsmechanismen van insecten kan bredere ecologische studies informeren.
- Toekomstig onderzoek kan de bevindingen uitbreiden met aanvullende insectensoorten.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Deze methode maakt een directe beoordeling van vloeistofopnamemechanismen bij insecten mogelijk en biedt een kwantitatieve benadering om het voedingsgedrag vanaf poreuze oppervlakken te evalueren. Door de morfologie van de monddelen te koppelen aan de functionele voedingscapaciteit, ondersteunt het de validatie van doelwitten bij vectorbestrijding en biomimetisch ontwerp. De techniek biedt een schaalbaar, reproduceerbaar systeem voor het onderzoeken van biologisch vloeistofstransport in microkanalen die relevant zijn voor onderzoek naar ziekteoverdracht.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Validatie van Targets
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt structuur-functierelaties in het voedingsapparaat van insecten om biologische hypothesen over vloeistoftransportmechanismen te valideren.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van fluorescerende magnetische nanodeeltjes als detecteerbare tracer om ingestie te bevestigen zonder afhankelijk te zijn van indirecte structurele gevolgtrekkingen.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Voorbereiding van gestandaardiseerde voedingsassays met filters met een gedefinieerde poriegrootte om drempelwaarden voor vloeistofopname bij verschillende insectensoorten te kwantificeren.
- Operationele waarde: Maakt high-resolution imaging van de distributie van nanodeeltjes in de crop mogelijk via confocale microscopie voor consistente, meetbare resultaten.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt studies naar ziektevectoren door het verifiëren van het voedingsvermogen op biologisch relevante substraten, wat bijdraagt aan interventiestrategieën.
- Operationele waarde: Kan worden aangepast aan diverse vloeistof-etende insecten (bijv. vliegen, vlinders) om continuïteit in voedingsplatforms voor verschillende soorten te waarborgen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen vroege discovery-workflows door functionele validatie van voedingsmechanismen te bieden voorafgaand aan target-gerichte screening of het ontwerp van interventies.
- Discovery Biology: Test de opname van fysiologische vloeistoffen om structuur-functierelaties in monddelen te verduidelijken, waardoor mechanistische onduidelijkheid bij de selectie van targets wordt verminderd.
- Screening: Levert kwantitatieve, op beeldvorming gebaseerde output (aanwezigheid van nanodeeltjes in de voltooie) om vergelijkende voedingsassays onder verschillende condities of genotypes mogelijk te maken.
- Analytics: Genereert binaire positieve/negatieve voedingsuitslagen die gecorreleerd zijn aan de poriegrootte, wat datagestuurde go/no-go beslissingen bij targetvalidatie ondersteunt.
- Translationeel onderzoek: Verbindt in het laboratorium uitgevoerde voedingsassays met het voedingsgedrag van vectoren in de echte wereld, wat de voorspellende waarde voor transmissiemodellen van ziekten verhoogt.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar beeldvormingsprotocol voor voeding met nanodeeltjes dat toepasbaar is op verschillende insectmodellen en studies naar vloeistofgeleiders.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Levert direct bewijs van vloeistofinname, wat het vertrouwen in mechanistische modellen van insectenvoeding en de relevantie van het doelwit vergroot.
- Operationele waarde: Standaardiseert de beoordeling van voeding via gecontroleerde sucrose-nanodeeltjes-oplossingen en gedefinieerde filterporiegroottes, wat de reproduceerbaarheid verbetert.
- Strategische waarde: Vermindert de afhankelijkheid van observationele gevolgtrekkingen, waardoor een snellere en nauwkeurigere risicoreductie van doelwitten in vectorbehandelingsprogramma's mogelijk is.
- Impact op de portfolio: Informeert de risico-gecorrigeerde prioritering van doelwitten op basis van geverifieerde voedingscapaciteit uit milieurelevante substraten.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in het hanteren van insecten, dissectie en confocale microscopie om ruptuur van de krop en verlies van nanodeeltjes te voorkomen.
- Afhankelijk van toegang tot fluorescente magnetische nanodeeltjes, magnetische roerstaafjes en een omgekeerde confocale microscoop met geschikte fluorescentiekanalen.
- Noodzaak van gestandaardiseerde preparatie van filterpapieren met nauwkeurige poriegroottes om consistentie van het voedingssurface over de experimenten waar te borgen.
- Vereist omgevingscontroles (23°C, 18u licht) om een consistente insectenfysiologie en voedingsgedrag te handhaven.
- Beperkt tot semi-transparante kroppen voor effectieve visualisatie van nanodeeltjes; ondoorzichtige weefsels kunnen alternatieve detectiemethoden vereisen.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:05
Title
0:38
Insect Species, Preparation of Solutions, and Feeding Station Setup
1:43
Feeding Protocol
3:05
Dissections
4:31
Testing for Ingested Nanoparticles
5:24
Results: A Relationship Between Feeding Pore Size and Feeding Conduit Size
6:28
Conclusion
