Name: Flexibele meting van bioluminescente verslaggevers met behulp van een geautomatiseerde longitudinale Luciferase Imaging Gas - en temperatuur-geoptimaliseerde Recorder (ALLIGATOR) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Leer bioluminescente verslaggevers observeren met het ALLIGATOR-systeem voor circadiane ritmestudies. Deze methode maakt longitudinale opnames van gecultiveerde cellen onder variërende extracellulaire omstandigheden mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We zouden graag bedanken Cairn onderzoek voor het werken met ons tot het ontwikkelen van dit systeem, in het bijzonder Mark Henson, Jeremy Graham en Joao Correia. Wij danken ook David Welsh en Akhilesh Reddy voor waardevolle discussie tijdens de ontwerpfase, evenals Peter Laskey (voorheen van Hamamatsu) voor het regelen van de lening van een demo-camera en David Wong voor zijn kritische inbreng in het manuscript.

<ol><li>Morgan, L. W., Greene, A. V., Bell-Pedersen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+and+light-induced+expression+of+luciferase+in+Neurospora+crassa%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genet.+and+Biol%22%5BJournal%5D)">Circadian and light-induced expression of luciferase in Neurospora crassa.</a> Fungal Genet. and Biol. 38 (3), 327-332 (2003).</li>
<li>Millar, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Circadian+Phenotype+Based+on+Firefly+Luciferase+Expression+in+Transgenic+Plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Online%22%5BJournal%5D)">A Novel Circadian Phenotype Based on Firefly Luciferase Expression in Transgenic Plants.</a> Plant Cell Online. 4 (9), 1075-1087 (1992).</li>
<li>Yu, W., Hardin, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Firefly+Luciferase+Activity+Assays+to+Monitor+Circadian+Molecular+Rhythms+In+Vivo+and+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Circadian+Rhythms%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Use of Firefly Luciferase Activity Assays to Monitor Circadian Molecular Rhythms In Vivo and In Vitro.</a> Circadian Rhythms: Methods and Protocols. , 465-480 (2007).</li>
<li>Yoo, S. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PERIOD2%3A%3ALUCIFERASE+real-time+reporting+of+circadian+dynamics+reveals+persistent+circadian+oscillations+in+mouse+peripheral+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues.</a> Proc Natl Acad Sci. 101 (15), 5339-5346 (2004).</li>
<li>Buhr, D. E., Yoo, S. -H., Takahashi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+as+a+universal+resetting+cue+for+mammalian+circadian+oscillators%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Temperature as a universal resetting cue for mammalian circadian oscillators.</a> Science. 330 (6002), 379-385 (2010).</li>
<li>Brown, S. A., Zumbrunn, G., Fleury-Olela, F., Preitner, N., Schibler, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhythms+of+mammalian+body+temperature+can+sustain+peripheral+circadian+clocks%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Rhythms of mammalian body temperature can sustain peripheral circadian clocks.</a> Current Biology. 12 (18), 1574-1583 (2002).</li>
<li>Balsalobre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resetting+of+circadian+time+in+peripheral+tissues+by+glucocorticoid+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Resetting of circadian time in peripheral tissues by glucocorticoid signaling.</a> Science. 289 (5488), 2344-2347 (2000).</li>
<li>Balsalobre, A., Marcacci, L., Schibler, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+signaling+pathways+elicit+circadian+gene+expression+in+cultured+Rat-1+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol.+CB%22%5BJournal%5D)">Multiple signaling pathways elicit circadian gene expression in cultured Rat-1 fibroblasts.</a> Curr. Biol. CB. 10 (20), 1291-1294 (2000).</li>
<li>Hastings, M. H., Reddy, A. B., McMahon, D. G., Maywood, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+circadian+mechanisms+in+the+suprachiasmatic+nucleus+by+transgenesis+and+biolistic+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Analysis of circadian mechanisms in the suprachiasmatic nucleus by transgenesis and biolistic transfection.</a> Methods Enzymol. 393, 579-592 (2005).</li>
<li>Chen, Y., Stevens, B., Chang, J., Milbrandt, J., Ba Barres,, Hell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NS21%3A+re-defined+and+modified+supplement+B27+for+neuronal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">NS21: re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures.</a> J. Neurosci Methods. 171 (2), 239-247 (2008).</li>
<li>Feeney, K. A., Putker, M., Brancaccio, M., ONeill, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-depth+Characterization+of+Firefly+Luciferase+as+a+Reporter+of+Circadian+Gene+Expression+in+Mammalian+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Rhythms%22%5BJournal%5D)">In-depth Characterization of Firefly Luciferase as a Reporter of Circadian Gene Expression in Mammalian Cells.</a> J. Biol. Rhythms. 31 (6), 540-550 (2016).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Hirota, T., Lewis, W. G., Liu, A. C., Lee, J. W., Schultz, P. G., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+biology+approach+reveals+period+shortening+of+the+mammalian+circadian+clock+by+specific+inhibition+of+GSK-3beta%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">A chemical biology approach reveals period shortening of the mammalian circadian clock by specific inhibition of GSK-3beta.</a> Proc Natl Acad Sci. 105 (52), 20746-20751 (2008).</li>
<li>Meng, Q., Maywood, E. S., Bechtold, D. A., Lu, W., Li, J., Gibbs, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entrainment+of+disrupted+circadian+behavior+through+inhibition+of+casein+kinase+1+%28+CK1+%29+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Entrainment of disrupted circadian behavior through inhibition of casein kinase 1 ( CK1 ) enzymes.</a> Proc Natl Acad Sci. 1, 1-6 (2010).</li>
<li>Khabirova, E., Chen, K. -F., O'Neill, J. S., Crowther, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flyglow%3A+Single-fly+observations+of+simultaneous+molecular+and+behavioural+circadian+oscillations+in+controls+and+an+Alzheimer%27s+model%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Flyglow: Single-fly observations of simultaneous molecular and behavioural circadian oscillations in controls and an Alzheimer's model.</a> Sci. Rep. 6, 33759(2016).</li>
</ol>

Geen tegenstrijdige belangen bestaan.

Het protocol hier beschreven is voor zoogdieren celcultuur, beide onder geperfundeerd en statische omstandigheden. De ALLIGATOR kan echter gemakkelijk worden aangepast aan andere modelsystemen. Inderdaad, het is reeds aangetoond vormen een uitstekend platform voor de gelijktijdige bewaking van motoriek, slaap, en perifere gen expressie ritmes in Drosophila melanogaster gehandhaafd onder constante duisternis15. Ook wordt opgemerkt dat, afhankelijk van de toepassing, camera typen dan die hier genoemd kunnen dienstig zijn. Wij willen dat met de juiste filters, een gewijzigde versie van de huidige setup kan in principe worden gebruikt voor fluorescentie kwantificering.
De enige toepassingen waarvoor de ALLIGATOR niet thuishoren in zijn degenen waarvoor met name hoge ruimtelijke resolutie vereist, zoals beeldvorming van Spatio organisatie van PER2::LUC expressie in organotypic plakjes van de zoogdieren is suprachiasmatic nucleus, of andere kleine weefsel segmenten.
De ALLIGATOR maakt het mogelijk vele experimenten worden uitgevoerd die tot nu toe niet gemakkelijk haalbaar door conventionele technieken hebben. Vergeleken met de huidige methoden voor het meten van bioluminescentie, biedt de ALLIGATOR meer flexibiliteit in zowel het type cel cultuur schotel of dia die kan worden gebruikt, de externe media voorwaarden, gevoeligheid en processivity.
Dit is vooral belangrijk op een moment wanneer er een beweging weg van standaard 2D cel cultuur modellen naar 3D organoid en stroom cultuur systemen. Als zodanig, verwacht wordt dat de ALLIGATOR zorgt voor een flexibele methode waarmee bioluminescentie vele dagen en weken onder een brede waaier van voorwaarden kan worden gemeten.

Het gebruik van luciferases als verslaggevers van genexpressie en eiwit activiteit is uitgegroeid tot een populaire techniek in de moleculaire en cellulaire biologie onderzoek. Dit geldt in het circadiane veld, waar de kinetiek van firefly luciferase synthese en katalytische inactivatie zijn bijzonder geschikt voor het melden van de longitudinale wijzigingen in genexpressie die optreden via de circa 24 h circadiane cyclus. Luciferase is als zodanig werkzaam als een circadiane verslaggever in een breed scala aan organismen, met inbegrip van schimmels, planten, vliegen en zoogdieren1,,2,,3,4.
Wanneer kwantificeren circadiane gen expressie in vitro, wordt een fotomultiplicator (PMT) vaak gebruikt om te registreren de bioluminescente signaal. Bet gebaseerde metingen hebben beperkte flexibiliteit echter meestal beperkt tot een vooraf bepaald formaat bord of schotel. Het is ook niet mogelijk om te verzamelen geen ruimtelijke informatie van monsters gecontroleerd met behulp van een bet, wat tot een verlies van informatie leiden kan wanneer imaging monsters die ruimtelijke variatie in luciferase expressie weergeven. Bovendien, als de bet en de bijbehorende elektronica gevoelig zijn voor storing wanneer blootgesteld aan het bevochtigde milieu van een standaard cel cultuur incubator, met PMTs van de opname van de longitudinale luciferase wordt altijd uitgevoerd in de niet-bevochtigde incubators. Bijgevolg, cel cultuur gerechten moeten worden verzegeld luchtdichte te voorkomen vochtverlies door verdamping en de cultuur-media moet daarom worden gebufferd met 3-(N- morfolino) propanesulfonic zuur (MOPS) of 4-(2-hydroxyethyl) -1- piperazineethanesulfonic zuur (HEPES), in plaats van de CO-2/bicarbonate systeem dat werkt in vivo en routinematig wordt gebruikt in zoogdieren weefselkweek bufferen.
Als gevolg van deze beperkingen legt meting van bioluminescentie door PMTs meestal strenge beperkingen op de voorwaarden waaronder cellen worden gehandhaafd tijdens experimenten. Om deze problemen te overwinnen, en ook te vergroten van het bereik van mogelijke experimentele omstandigheden, we gebruiken een standaard CO2/n2 170 L weefselkweek incubator dat is aangepast door de toevoeging van een water-gekoeld elektron-vermenigvuldigen Charge - coupled apparaat (EMCCD) camera met anti-nevel optica en digitale controle van temperatuur en gas niveaus. Dit is een geautomatiseerde longitudinale Luciferase Imaging Gas en Temperature-Optimized Recorder of ALLIGATOR dubbed. De ALLIGATOR zorgt voor aanzienlijk toegenomen flexibiliteit van bioluminescente imaging, zowel voor high-throughput beeldvorming van standaard weefselkweek platen (tot 6 x 96 - of 384-well platen tegelijk) en ook voor niet-standaard weefselkweek systemen, dergelijke Als geperfundeerd cellen gekweekt in microfluidic apparaten. Dit instrument voorziet ook in imaging moet worden uitgevoerd met variabele controle van zowel CO2 en O2 gedeeltelijke druk als temperatuur en bevochtigde voorwaarden.
Het onderstaande protocol beschrijft een methode voor de bioluminescente opname van zoogdiercellen en weefselkweek systemen met behulp van een ALLIGATOR (voortaan 'bioluminescentie incubator' genoemd). Opgemerkt moet worden, maar dat zou het systeem geschikt aan bioluminescente imaging en ook met enige aanpassing, TL beeldvorming, in een aantal andere biologische systemen en contexten.

<table><tbody><tr><td>DMEM (1x) + GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone FetalClone III Serum</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30109.03</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Thermofisher</td><td>21103049</td><td>basal medium</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma</td><td>A4919</td><td></td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma</td><td>C40</td><td></td></tr><tr><td>Glutathione</td><td>Sigma</td><td>G6013</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma</td><td>I1882</td><td></td></tr><tr><td>Superoxide Dismutase</td><td>Sigma</td><td>S5395</td><td></td></tr><tr><td>Holo-transferrin</td><td>Calbiochem</td><td>616424</td><td></td></tr><tr><td>T3 (triiodo-L-thyronine</td><td>Sigma</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>L-Carnitine</td><td>Sigma</td><td>C7518</td><td></td></tr><tr><td>Ethanolamine</td><td>Sigma</td><td>E9508</td><td></td></tr><tr><td>D (+)-Galactose</td><td>Sigma</td><td>G0625</td><td></td></tr><tr><td>Putrescine</td><td>Sigma</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Selenite</td><td>Sigma</td><td>S9133</td><td></td></tr><tr><td>Corticosterone</td><td>Sigma</td><td>C2505</td><td></td></tr><tr><td>Linoleic Acid</td><td>Sigma</td><td>L1012</td><td></td></tr><tr><td>Linolenic Acid</td><td>Sigma</td><td>L2376</td><td></td></tr><tr><td>Lipoic Acid</td><td>Sigma</td><td>T1395</td><td></td></tr><tr><td>Progesterone</td><td>Sigma</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>Retinol Acetate</td><td>Sigma</td><td>R7882</td><td></td></tr><tr><td>Retinol, all trans</td><td>Sigma</td><td>95144</td><td></td></tr><tr><td>D,L-alpha-Tocopherol</td><td>Sigma</td><td>95240</td><td></td></tr><tr><td>D,L-alpha-Tocopherol acetate</td><td>Sigma</td><td>T3001</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate Solution</td><td>Sigma</td><td>S8761-100ML</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX (100x)</td><td>Gibco</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Galaxy 170R incubator&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>CO17301001</td><td></td></tr><tr><td>Luciferin</td><td>Biosynth</td><td>L-8220</td><td></td></tr><tr><td>D -(+)-Glucose solution</td><td>Sigma</td><td>G8644-100ML</td><td></td></tr><tr><td>DMEM powder</td><td>Sigma</td><td>D5030</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma</td><td>PHG0007</td><td></td></tr><tr><td>1 mm I.D. silicone tubing&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>19-4692-01</td><td></td></tr><tr><td>Elbow luer connector</td><td>Ibidi</td><td>10802</td><td></td></tr><tr><td>Male luer fittings</td><td>Ibidi</td><td>10826</td><td></td></tr><tr><td>Female luer fittings</td><td>Ibidi</td><td>10825</td><td></td></tr><tr><td>&micro;-slide luer I 0.6</td><td>Ibidi</td><td>80196</td><td></td></tr><tr><td>BD plastipak 20ml syringe</td><td>Becton Dickinson</td><td>300613</td><td></td></tr><tr><td>1mm I.D. ETFE tubing</td><td>GE Healthcare</td><td>18-1142-38</td><td></td></tr><tr><td>PF670462</td><td>Sigma</td><td>SML0795</td><td></td></tr><tr><td>B27 Supplement (50x)</td><td>ThermoFisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>iXon Ultra EMCCD camera</td><td>Andor</td><td>iXon 888</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>ImageJ</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Prism 7.0</td><td>Graphpad Software</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Deltaphase Isothermal Pad</td><td>Braintree Scientific</td><td>39DP</td><td></td></tr><tr><td>Heated neutral density filter&nbsp;</td><td>Cairn Research</td><td>Custom item</td><td></td></tr><tr><td>Osmomat 030</td><td>Gonotech</td><td>Discontinued</td><td></td></tr><tr><td>300 mOsmol/kg calibration standard</td><td>Gonotech</td><td>30.9.0020</td><td></td></tr><tr><td>Measuring vessel</td><td>Gonotech</td><td>30.9.0010</td><td></td></tr><tr><td>Focusing cylinder</td><td>Cairn Research</td><td>Custom item</td><td></td></tr><tr><td>NE-1600 programmable syringe pump</td><td>Pump Systems inc.</td><td>NE-1600</td><td></td></tr><tr><td>Andor Solis Software</td><td>Andor</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

flexibele meting van bioluminescente verslaggevers met behulp van een geautomatiseerde longitudinale luciferase imaging gas - en temperatuur-geoptimaliseerde recorder (alligator)

Flexible Measurement of Bioluminescent Reporters Using an Automated Longitudinal Luciferase Imaging Gas- and Temperature-optimized Recorder (ALLIGATOR)

Luciferase gebaseerde verslaggevers van cellulaire genexpressie zijn op grote schaal gebruikt voor zowel longitudinale en eindpunt testen van biologische activiteit. In de circadiane ritmen onderzoek, bijvoorbeeld geven klok gen fusies met firefly luciferase aanleiding tot robuuste ritmes in cellulaire bioluminescentie die vele dagen aanhouden. Technische beperkingen die verband houden met fotomultiplicator buizen (PMT) of conventionele microscopie gebaseerde methoden voor bioluminescentie kwantificering meestal hebben geëist dat cellen en weefsels worden gehandhaafd onder heel niet-fysiologische omstandigheden tijdens opname, met een trade-off tussen de gevoeligheid en de doorvoer. Hier, rapporteren we een verfijning van de voorafgaande methoden waarmee op lange termijn bioluminescentie imaging met hoge gevoeligheid en doorvoer die steunt een breed scala aan cultuur voorwaarden, met inbegrip van variabele gas en controle van de vochtigheid, en accepteert dat veel verschillende Weefselkweek platen en gerechten. Deze geautomatiseerde longitudinale luciferase imaging gas - en temperatuur-geoptimaliseerde recorder (ALLIGATOR) ook kunt de observatie van ruimtelijke variaties in luciferase expressie in een cel enkelgelaagde of weefsel, dat niet gemakkelijk worden waargenomen door traditionele methoden. We benadrukken hoe de ALLIGATOR biedt enorm toegenomen flexibiliteit voor de detectie van luciferase activiteit in vergelijking met bestaande methoden.

Dit artikel schetst een protocol voor de bioluminescente beeldvorming van zoogdiercellen met behulp van een ALLIGATOR (bioluminescentie incubator). Deze techniek zorgt voor flexibiliteit van fysieke installatie en extracellulaire voorwaarden wanneer beeldvormende bioluminescente systemen. Methoden voor zowel de eenvoudige statische weefselkweek (Figuur 1, aanvullende Video 1) en de cultuur van de cel geperfundeerd (Figuur 2, aanvullende Video 2) worden beschreven, maar vele andere opstellingen kunnen worden beeld met behulp van dit systeem. Alle gegevens werden gekwantificeerd aan de hand van de methoden die worden beschreven in sectie 7.
Figuur 1A ziet u een voorbeeld van een opname van 6 x 96-wells-platen met PER2::LUC fibroblasten4bioluminescentie video. De buitenste wells bevatten geen cellen zoals deze niet vereist voor dit experiment waren. Cellen hebben ondergaan differentiële temperatuur entrainment, waarbij ze beide temperatuur cyclus van 12 h, op 32 ° C, gevolgd door 12 h 37 ° C gedurende 72 uur of het omgekeerde (12 h, bij 37 ° C, gevolgd door 12 h, op 32 ° C gedurende 72 uur), ondergaan voordat het wordt gehouden bij constante 37 ° C voor opname. 60 min posities werden genomen elk uur. Twee van deze voorwaarden worden gekwantificeerd in figuur 1B.
Figuur 2A toont een schema van de installatie van een systeem voor weefselkweek geperfundeerd. Dit bestaat uit twee kanaal dia's die zijn verbonden met leidingen. Media wordt gedreven over de cellen door een spuitpomp. De eerste van deze dia's fungeert als een permeabele waterventiel gas (buffer dia) en geen cellen, met de tweede bevat met de cellen waaruit de Bioluminescentie is opgenomen. Een vertegenwoordiger van de opname van de video van dit systeem is afgebeeld in figuur 2B. 15 min posities werden genomen om 15 min. Hier, de cellen worden gehandhaafd onder standaard perfusie voorwaarden of in de aanwezigheid van caseïne kinase inhibitor PF670462, die eerder is aangetoond dat het circadiane periode verlengen en verminderen de amplitude van het klok gen expressie ritmes in gekweekte zoogdiercellen14. Het effect op de PER2::LUC expressie wordt weergegeven in figuur 2C (bovenzijde) tegen cellen behandeld met dezelfde concentratie van de drug onder standaard statische cel kweekomstandigheden weergegeven in figuur 2C (onderste paneel), met kwantificering van de periode weergegeven in figuur 2D. Het is duidelijk uit deze dat behandeling met PF670462 PER2::LUC expressie onder beide sets voorwaarden beïnvloedt. Echter, terwijl cellen behandeld met PF670462 onder geperfundeerd voorwaarden Toon periode verlenging van ongeveer 3 h (3 ±0.9-h), cellen in statische toestand behandeld met het geneesmiddel Toon aanzienlijk grotere periode verlengen tot een periode van &#62; 48 h. Dit kan worden passen door een gedempte cosinus, zoals beschreven in sectie 7, (extra som-van-kwadraten F testen ten opzichte van een rechte lijn, p &#60; 0.0001). Interessant is dat is de omvang van de periode verlengen onder perfusie veel dichter bij die in vivo14waargenomen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56623/56623fig1v2.jpg"> 
Afbeelding 1: voorbeeld van de gegevens. (A) voorbeeld video momentopname van bioluminescentie van vereeuwigd PER2::LUC in 6 x 96 goed in de Bioluminescentie incubator platen. Putten worden gekwantificeerd zijn gemarkeerd in geel in de aanvullende Video 1. (B) kwantificering van bioluminescentie van A. Twee sets van 3 platen van cellen werden entrained met behulp van temperatuur cycli (12 h, op 32 ° C, 12 h, bij 37° C), die anti-phasic aan elkaar waren te produceren tegenover fasen van PER2 eiwit expressie (n = 6, ± SEM te betekenen). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56623/56623fig1v2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56623/56623fig2v2.jpg"> 
Figuur 2: perfusie met CK1δ remmers. (A) schema van perfusie systeem. (B) voorbeeld video momentopname van een opname uit PER2::LUC bioluminescentie onder perfusie cellen. Een samplegebied van lenen wordt geel gemarkeerd. (C) kwantificering van bioluminescentie van PER2::LUC fibroblasten onder perfusie en in statische toestand met en zonder 3 µM CK1 inhibitor PF670462 (n = 3, ± SEM te betekenen). Bioluminescentie heeft op minimale en maximale waarden zijn genormaliseerd. (D) analyse van periode (Two-way ANOVA, Holm-Sidak van meerdere vergelijkingen test).<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56623/56623fig2v2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Component</td>
			<td>Middellange eindconcentratie (μM)</td>
			<td>Voorraad (mg/mL)</td>
			<td>Voor 400 mL NS21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boviene albumine</td>
			<td>37</td>
			<td>-</td>
			<td>50 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Katalase</td>
			<td>0,01</td>
			<td>-</td>
			<td>50 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathion</td>
			<td>3.2</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insuline</td>
			<td>0.6</td>
			<td>10</td>
			<td>8 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superoxide dismutase</td>
			<td>0.077</td>
			<td>-</td>
			<td>50 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holo-transferrine</td>
			<td>0.062</td>
			<td>-</td>
			<td>100 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3 (triiodo-L-thyronine)</td>
			<td>0.0026</td>
			<td>2</td>
			<td>20 ΜL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Carnitine</td>
			<td>12</td>
			<td>-</td>
			<td>40 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanolamine</td>
			<td>16</td>
			<td>Vloeistof (1 g/ml)</td>
			<td>20 ΜL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D (+)-Galactose</td>
			<td>83</td>
			<td>-</td>
			<td>300 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Als putrescine</td>
			<td>183</td>
			<td>-</td>
			<td>322 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Natriumseleniet</td>
			<td>0.083</td>
			<td>1</td>
			<td>280 ΜL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corticosterone</td>
			<td>0.058</td>
			<td>2</td>
			<td>0,2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linolzuur</td>
			<td>3.5</td>
			<td>100</td>
			<td>0,2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linoleenzuur</td>
			<td>3.5</td>
			<td>100</td>
			<td>0,2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liponzuur</td>
			<td>0.2</td>
			<td>4.7</td>
			<td>0,2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesteron</td>
			<td>0.02</td>
			<td>3.2</td>
			<td>0,04 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinol acetaat</td>
			<td>0.2</td>
			<td>20</td>
			<td>0,1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinol, alle trans</td>
			<td>0.3</td>
			<td>10</td>
			<td>0,2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D, L-alpha-Tocopherol</td>
			<td>2.3</td>
			<td>100</td>
			<td>0. 2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D, L-alpha-tocoferolacetaat</td>
			<td>2.1</td>
			<td>100</td>
			<td>0,2 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabel 1: NS21 voorbereiding.
Aanvullende Video 1: voorbeeld video van bioluminescentie uit goed platen. In het volgende voorbeeld video momentopname van bioluminescentie van vereeuwigd PER2::LUC in 6 x 96 goed platen in de Bioluminescentie incubator. Putten worden gekwantificeerd worden benadrukt in geel. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56623/Video_1A_Revision-1.avi">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende Video 2: voorbeeld video momentopname van een opname uit PER2::LUC bioluminescentie cellen onder perfusie. Een samplegebied van lenen wordt geel gemarkeerd. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56623/Video_2B_Revision-1.avi">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Genetisch gecodeerde luciferase is een populaire niet-invasieve verslaggever van genexpressie. Gebruik van een geautomatiseerde longitudinale luciferase imaging gas - en temperatuur-geoptimaliseerde recorder (ALLIGATOR) staat longitudinale opname van bioluminescente cellen onder een brede waaier van voorwaarden stelt. Hier laten we zien hoe ALLIGATOR kan worden gebruikt in het kader van circadiane ritmen onderzoek.

Flexibele meting van bioluminescente verslaggevers met behulp van een geautomatiseerde longitudinale Luciferase Imaging Gas - en temperatuur-geoptimaliseerde Recorder (ALLIGATOR)

Luciferase-based reporters of cellular gene expression are in widespread use for both longitudinal and end-point assays of biological activity. In ...

Het algemene doel van dit systeem is om de eenvoudige observatie van bioluminescente reportergenen mogelijk te maken onder een breed scala aan extracellulaire omstandigheden, inclusief onder constante media-perfusie. Deze methode kan worden gebruikt om bioluminescentie longitudinaal te observeren van gekweekte cellen en weefsels. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het mogelijk maakt om op te nemen van cellen onder verschillende extracellulaire media- en gasomstandigheden, wat niet mogelijk is in de meeste bestaande systemen.Hoewel we deze techniek hier demonstreren in de context van circadiane ritme-experimenten, zou het gemakkelijk toegepast kunnen worden op andere systemen die bioluminescentie of fluorescente opname over tijdschalen van dagen tot weken vereisen. Om de procedure te beginnen, zaai gekweekte cellen op weefselkweekschotels of -platen. Incubeer de cellen bij 37 graden Celsius tot de monolagen 100% confluëntie hebben bereikt.Onmiddellijk voorafgaand aan het experiment, gebruik een computergestuurde cyclische incubator om om de 12 uur gedurende minimaal 72 uur tussen 32 en 37 graden Celsius te wisselen om cellulaire ritmen te synchroniseren. Robuuste synchronisatie van cellulaire circadiane oscillaties zowel binnen als tussen culturen is cruciaal voor experimentele reproduceerbaarheid. We bereiken dit door dagelijkse temperatuurcycli toe te passen vóór elke opname die cellen synchroniseren door lichaamstemperatuurritmen na te bootsen.Alternatief kan farmacologische synchronisatie ook behoorlijk effectief zijn. Combineer vervolgens 8,3 gram hoog-glucose DMEM-poeder met 900 milliliter ultrapuur water. Roer de oplossing 30 minuten om het poeder volledig op te lossen.Voeg vervolgens aan de oplossing 50 milliliter van een 100 gram per liter glucose-oplossing, 20 milliliter van een pH 7,6, een molaar MOPS-oplossing en 10 milliliter van een 100 keer penicilline-streptomycine-oplossing toe. Roer het mengsel 10 minuten. Voeg vervolgens 4,7 milliliter van een 7,5% natriumbicarbonaat-oplossing toe en roer het mengsel nog vijf minuten.Gebruik zoutzuur of natriumhydroxide om de pH op kamertemperatuur naar 7,6 aan te passen. Voeg ultrapuur water toe aan de oplossing om een ​​eindvolume van één liter te bereiken. Filter de oplossing door een 0,22 micrometer steriele filter in een steriele flacon.Bewaar het gefilterde stockmedium bij vier graden Celsius. Onmiddellijk voorafgaand aan het uitvoeren van het experiment, supplementeer de gewenste hoeveelheid stockmedium met 10% serum, twee millimolair GlutaMAX, 2% NS21 en één millimolair luciferine. Haal het resulterende werkmedium door een 0,22 micrometer steriele filter.Gebruik een vijf molaar oplossing van natriumchloride om de osmolalitéit van het werkmedium aan te passen tot 350 milliosmolen. Verwarm vervolgens het medium tot 37 graden Celsius in een waterbad. Om vervolgens te beginnen met het focussen van de bioluminescentie-incubatorcamera, draait u de waterdichte verwarmde neutrale dichtheidsfilter los.Stel in de instrumentsoftware de belichtingstijd in op 0,2 seconden en de kinetische cyclustijd op 0,3 seconden. Controleer of de elektronenvermenigvuldigingsversterking is uitgeschakeld, sluit vervolgens het setupvenster en start de video-opname. Gebruik de focuscilinder om de cameralens te draaien tot de testitems op het juiste steekproefrek duidelijk in focus staan.Stop vervolgens de video-opname. Plaats het neutrale dichtheidsfilter terug en verwijder de testitems. Gebruik vervolgens het bedieningspaneel aan de voorkant van de bioluminescentie-incubator om de gewenste zuurstof-, kooldioxide- en temperatuurniveaus voor het experiment in te stellen.Voor een bevochtigd experiment vult u de waterbak aan de basis van de incubator. Verwijder de cellen uit de weefselkweekincubator en vervang het kweekmedium door het voorverwarmde werkmedium. Voor bevochtigde experimenten met kleine volumes, sluit de platen af met gasdoorlatende film of tape.Plaats de platen in de bioluminescentie-incubator. Sluit de incubator en bevestig de deksel om licht van het systeem uit te sluiten. Stel vervolgens in de instrumentsoftware de acquisitiemodus in op kinetisch.Stel de gewenste belichtingstijd in. Stel accumulaties in op één, kinetische serielengte op het gewenste aantal acquisitiecycli en kinetische cyclustijd op het gewenste beeldinterval. Stel een shiftsnelheid van 4,33 microseconden, een versterking van één en een EM-versterking van het gewenste niveau in.Stel vervolgens het automatische opslagbestandstype in op sif of tiff. Geef het automatische opslagbestand een naam en stel de bestandspad in. Stel het spoolbestandstype in op sif of tiff.Geef de bestandsstapel een naam en stel het bestandspad in. Sluit het setupvenster en begin met het opnemen van gegevens. Zodra de gegevensverzameling is voltooid, importeert u de verworven beeldstapel in beeldverwerkingssoftware.Pas de helderheid en het contrast aan voor een optimale weergave van bioluminescentie. Selecteer vervolgens gebieden van belang en exporteer het gemiddelde signaal voor de geselecteerde gebieden. Kopieer de gegevens naar analysesoftware voor verdere verwerking.Om het experiment te beginnen, zaai cellen op enkele kanaalschijven met Luer-aansluitingen en een kanaaldiepte van 0,6 of 0,8 millimeter. Kweek en train de cellen. Bereid en verwarm hydrogencarbonaat gebufferd laag-glucose DMEM perfusiemedium voor.Snij vervolgens vijf twee-centimeter secties van siliconenslang met een binnendiameter van één millimeter. Snij 1,2 meter, 10 centimeter en 30 centimeter van één millimeter binnendiameter ethyleen tetrafluorethyleenbuis. Steriliseer de buis met 70% ethanol en spoel de buis door met steriele PBS.Gebruik de gesteriliseerde siliconenbuis om de 1,2 meter ETFE-buis aan te sluiten op een steriele vrouwelijke Luer-aansluiting en een steriele bocht Luer-aansluiting. Gebruik deze assemblage om het perfusiemedium-syringe aan te sluiten op een lege Luer-kanaalschijven. Vervang vervolgens het celkweekmedium door voorverwarmd perfusiemedium.Vul een steriele 20-milliliter spuit met voorver

flexible-measurement-bioluminescent-reporters-using-an-automated

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier beschrijven we de procedures voor het bestuderen van veranderingen in de fagocytose-geïnduceerde genexpressie met een luciferase-based reportergen benadering met behulp van de Dual-GloTM Luciferase Assay System van Promega.

Studeren Membraan Biogenese met een Luciferase-Based Reporter Gene test

Methoden voor bioluminescentie beeldvorming van bacteriële infecties bij levende dieren beschreven. Ziekteverwekkers worden aangepast om luciferase te drukken waardoor optisch het gehele lichaam van infecties in levende dieren. Diermodellen kunnen besmet zijn met luciferase uitdrukken pathogenen en de daaruit voortvloeiende beloop van de ziekte gevisualiseerd in real-time door bioluminescentie imaging.

Met behulp van Luciferase naar Afbeelding bacteriële infecties in Muizen

Hierin beschrijven we de methoden om te bouwen, visualiseren en kwantificeren van de bioluminescente reacties van zowel vuurvlieg en Renilla luciferase enzymen uitgedrukt in gemetastaseerde borstkanker cellen tijdens hun groei en...

In vivo Dual ondergrond Bioluminescent Imaging

Circadiane klokken functioneren binnen de individuele cellen, dat wil zeggen, ze zijn cel-autonoom. We beschrijven werkwijzen voor het genereren van cel-autonome klok modellen niet-invasieve, luciferase-gebaseerde real-time bioluminescentie technologie. Reporter cellen handelbaar, functionele modelsystemen voor het bestuderen van circadiane biologie.

Monitoring Cell-autonome circadiane klok Rhythms of genexpressie met behulp van Luciferase Bioluminescentie Reporters

Bioluminescent Bacteriële Imaging<em&gt; In Vivo</em

The video demonstrates the luciferase assay used to quantify luciferase-tagged proteins. The assay uses an engineered luciferase enzyme composed of a large fragment that binds with the small fragment, which is conjugated with a protein of interest. The bound subunits form an active enzyme that, in the presence of the substrate, releases a luminescent signal. This signal is then quantified using a luminometer.

The Luciferase Assay: A High-Throughput Assay to Measure Luminescent Signals Using Engineered Nanoluciferase System-Based Bioreporters

Zoogdierlijke cellen die het bacteriële bioluminescentie gencassette...

Autonoom Bioluminescente zoogdiercellen voor continue en real-time monitoring van de cytotoxiciteit

Hier presenteren we een nieuwe Ca 2+ -Imaging aanpak met behulp van een bioluminescente reporter. Deze benadering maakt gebruik van een gefuseerde construct GFP-aequorine dat bindt aan Ca2 + en licht emitteert, waardoor de noodzaak voor excitatie licht. Aanzienlijk deze methode maakt het mogelijk lange doorlopende beeldvorming, de toegang tot diepe hersenstructuren en hoge tijdsresolutie.

In vivo Functional Brain Imaging aanpak op basis van Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorine

Lichte productie regelen bioluminescente bacterie via allerlei mechanismen, zoals quorum sensing. Deze nieuwe methode kan de behandeling in situ van bioluminescentie en de correlatie van licht emissie celdichtheid. Een kunstmatige bioluminescente Escherichia coli systeem maakt het mogelijk de karakterisatie van lux operons, Lux eiwitten en hun samenspel.

In Situ Meting en de correlatie van de celdichtheid en lichte emissie van bioluminescente bacterie

Neurale stam/voorlopercellen vertonen verschillende expressie dynamiek van Inkeping signalering componenten die leiden tot verschillende uitkomsten van cellulaire gebeurtenissen. Een dergelijke dynamische uitdrukking kan worden onthuld door real-time monitoring, niet door statische analyse, met behulp van een zeer gevoelig bioluminescentie beeldvormings systeem dat visualisatie van snelle veranderingen in genexpressies mogelijk maakt.

Real-time bioluminescentie beeldvorming van Inkeping signalering dynamiek tijdens Murine neurogenese

Circadiane ritmes, die in de meeste organismen voorkomen, reguleren de tijdelijke organisatie van biologische processen. 3D-organoïden zijn onlangs naar voren gekomen als een fysiologisch relevant in vitromodel . Dit protocol beschrijft het gebruik van bioluminescente reporters om circadiane ritmes in organoïden te observeren, waardoor in vitro onderzoek naar circadiane ritmes in meercellige systemen mogelijk wordt.

Circadiane oscillaties monitoren met een bioluminescentiereporter in organoïden

Leer bioluminescente verslaggevers observeren met het ALLIGATOR-systeem voor circadiane ritmestudies. Deze methode maakt longitudinale opnames van gecultiveerde cellen onder variërende extracellulaire omstandigheden mogelijk.

Flexibele meting van bioluminescente verslaggevers met behulp van een geautomatiseerde longitudinale Luciferase Imaging Gas - en temperatuur-geoptimaliseerde Recorder (ALLIGATOR) (Video) | JoVE Journal

Flexibele meting van bioluminescente verslaggevers met behulp van een geautomatiseerde longitudinale Luciferase Imaging Gas - en temperatuur-geoptimaliseerde Recorder (ALLIGATOR)

Meer video's verkennen