Name: In Vivo EPR beoordeling van pH, pO2, Redox Status, en concentraties van fosfaat en glutathion in de communicatie van de Tumor (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Leer hoe je in vivo EPR-technologie gebruikt voor kwantitatieve beoordeling van zuurstof, pH en redoxstatus in het tumormicro-milieu van muismodellen. Deze niet-invasieve methode biedt unieke inzichten voor kankeronderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd slechts gedeeltelijk ondersteund door de NIH grants CA194013, CA192064 en U54GM104942. De WVCTSI is erkend voor start-up VVK, AB, en onderzoekingen. De auteurs bedanken Dr. M. Gencheva en K. Steinberger voor de hulp bij de illustratieve experimenten. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijk de officiële standpunten van de NIH.

<ol><li>Siemann, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSiemann%2C+DW+%22Tumor+Microenvironment%22">Tumor Microenvironment</a>. , John Wiley & Sons Ltd.,. Chichester, UK; Hoboken, NJ, USA. (2011).</li>
<li>Tatum, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia%3A+importance+in+tumor+biology%2C+noninvasive+measurement+by+imaging%2C+and+value+of+its+measurement+in+the+management+of+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Biol%22%5BJournal%5D)">Hypoxia: importance in tumor biology, noninvasive measurement by imaging, and value of its measurement in the management of cancer therapy.</a> Int J Radiat Biol. 82 (10), 699-757 (2006).</li>
<li>Brahimi-Horn, M. C., Chiche, J., Pouyssegur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+signalling+controls+metabolic+demand%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Hypoxia signalling controls metabolic demand.</a> Curr Opin Cell Biol. 19 (2), 223-229 (2007).</li>
<li>Haulica, A., Ababei, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+glycolytic+activity+in+the+erythrocytes+of+animals+with+chronic+experimental+hypoxia+and+with+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasma%22%5BJournal%5D)">Comparative study of glycolytic activity in the erythrocytes of animals with chronic experimental hypoxia and with tumours.</a> Neoplasma. 21 (1), 29-35 (1974).</li>
<li>Matsumoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+mapping+of+tumor+redox+status+by+magnetic+resonance+imaging+using+nitroxides+as+redox-sensitive+contrast+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">High-resolution mapping of tumor redox status by magnetic resonance imaging using nitroxides as redox-sensitive contrast agents.</a> Clin Cancer Res. 12 (8), 2455-2462 (2006).</li>
<li>Estrela, J. M., Ortega, A., Obrador, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutathione+in+cancer+biology+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Clin+Lab+Sci%22%5BJournal%5D)">Glutathione in cancer biology and therapy.</a> Crit Rev Clin Lab Sci. 43 (2), 143-181 (2006).</li>
<li>Voegtlin, C., Thompson, J. W. <a target="_blank" href="http://www.jbc.org/content/70/3/801.full.pdf">Glutathione content of tumor animals.</a> J. Biol. Chem. 70, 801-806 (1926).</li>
<li>Bobko, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interstitial+Inorganic+Phosphate+as+a+Tumor+Microenvironment+Marker+for+Tumor+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Interstitial Inorganic Phosphate as a Tumor Microenvironment Marker for Tumor Progression.</a> Sci Rep. 7, 41233(2017).</li>
<li>Gillies, R. J., Raghunand, N., Garcia-Martin, M. L., Gatenby, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pH+imaging.+A+review+of+pH+measurement+methods+and+applications+in+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Eng+Med+Biol+Mag%22%5BJournal%5D)">pH imaging. A review of pH measurement methods and applications in cancers.</a> IEEE Eng Med Biol Mag. 23 (5), 57-64 (2004).</li>
<li>Gade, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intratumoral+convection%3A+pressure-dependent+enhancement+in+chemotherapeutic+delivery+to+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Imaging intratumoral convection: pressure-dependent enhancement in chemotherapeutic delivery to solid tumors.</a> Clin Cancer Res. 15 (1), 247-255 (2009).</li>
<li>Bobko, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+monitoring+of+pH%2C+redox+status%2C+and+glutathione+using+L-band+EPR+for+assessment+of+therapeutic+effectiveness+in+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Magn+Reson+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo monitoring of pH, redox status, and glutathione using L-band EPR for assessment of therapeutic effectiveness in solid tumors.</a> Magn Reson Med. 67, 1827-1836 (2012).</li>
<li>Dhimitruka, I., Bobko, A. A., Eubank, T. D., Komarov, D. A., Khramtsov, V. V. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja401572r">Phosphonated Trityl Probe for Concurrent In Vivo Tissue Oxygen and pH Monitoring Using EPR-based Techniques.</a> JACS. 135, 5904-5910 (2013).</li>
<li>Pandian, R. P., Parinandi, N. L., Ilangovan, G., Zweier, J. L., Kuppusamy, P. Novel particulate spin probe for targeted determination of oxygen in cells and tissues. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPandian%2C+RP+%22Free+Radic+Biol+Med%22">Free Radic Biol Med</a>. 35 (9), 1138-1148 (2003).</li>
<li>Bobko, A. A., Evans, J., Denko, N. C., Khramtsov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concurrent+Longitudinal+EPR+Monitoring+of+Tissue+Oxygenation%2C+Acidosis%2C+and+Reducing+Capacity+in+Mouse+Xenograft+Tumor+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Concurrent Longitudinal EPR Monitoring of Tissue Oxygenation, Acidosis, and Reducing Capacity in Mouse Xenograft Tumor Models.</a> Cell Biochem Biophys. 75, 247-253 (2017).</li>
<li>Khramtsov, V. V., Yelinova, V. I., Glazachev Yu, I., Reznikov, V. A., Zimmer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+determination+and+reversible+modification+of+thiols+using+imidazolidine+biradical+disulfide+label%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem+Biophys+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative determination and reversible modification of thiols using imidazolidine biradical disulfide label.</a> J Biochem Biophys Methods. 35 (2), 115-128 (1997).</li>
<li>Roshchupkina, G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+EPR+measurement+of+glutathione+in+tumor-bearing+mice+using+improved+disulfide+biradical+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Rad.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo EPR measurement of glutathione in tumor-bearing mice using improved disulfide biradical probe.</a> Free Rad. Biol. Med. 45, 312-320 (2008).</li>
<li>Hicks, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKhramtsov%2C+VV+%22Stable+Radicals%3A+Fundamentals+and+Applied+Aspects+of+Odd-Electron+Compounds%22">Stable Radicals: Fundamentals and Applied Aspects of Odd-Electron Compounds</a>. , John Wiley & Sons, Ltd. 537-566 (2010).</li>
<li>Bobko, A. A., Dhimitruka, I., Zweier, J. L., Khramtsov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fourier+Transform+EPR+of+Trityl+Radicals+for+Multifunctional+Assessment+of+Chemical+Microenvironment%29%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Edit%22%5BJournal%5D)">Fourier Transform EPR of Trityl Radicals for Multifunctional Assessment of Chemical Microenvironment).</a> Angew. Chem. Int. Edit. 53, 2735-2738 (2014).</li>
<li>Martin, M. L., Martin, G. J., Delpuech, J. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMartin%2C+ML+%22Practical+NMR+spectroscopy%22">Practical NMR spectroscopy</a>. , Heyden. (1980).</li>
<li>Lin, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+to+malignancy+in+the+polyoma+middle+T+oncoprotein+mouse+breast+cancer+model+provides+a+reliable+model+for+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Progression to malignancy in the polyoma middle T oncoprotein mouse breast cancer model provides a reliable model for human diseases.</a> Am J Pathol. 163 (5), 2113-2126 (2003).</li>
<li>Eubank, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulocyte+macrophage+colony-stimulating+factor+inhibits+breast+cancer+growth+and+metastasis+by+invoking+an+anti-angiogenic+program+in+tumor-educated+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Granulocyte macrophage colony-stimulating factor inhibits breast cancer growth and metastasis by invoking an anti-angiogenic program in tumor-educated macrophages.</a> Cancer Res. 69 (5), 2133-2140 (2009).</li>
<li>Khramtsov, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+determination+of+SH+groups+in+low-+and+high-molecular-weight+compounds+by+an+electron+spin+resonance+method%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Quantitative determination of SH groups in low- and high-molecular-weight compounds by an electron spin resonance method.</a> Anal Biochem. 182 (1), 58-63 (1989).</li>
<li>Komarov, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+paramagnetic+resonance+monitoring+of+ischemia-induced+myocardial+oxygen+depletion+and+acidosis+in+isolated+rat+hearts+using+soluble+paramagnetic+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Magnetic+Resonance+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Electron paramagnetic resonance monitoring of ischemia-induced myocardial oxygen depletion and acidosis in isolated rat hearts using soluble paramagnetic probes.</a> Magnetic Resonance in Medicine. 68 (2), 649-655 (2012).</li>
<li>Song, Y. G., Liu, Y. P., Liu, W. B., Villamena, F. A., Zweier, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+binding+of+the+Finland+trityl+radical+with+bovine+serum+albumin%5BTitle%5D)+AND+%22Rsc+Advances%22%5BJournal%5D)">Characterization of the binding of the Finland trityl radical with bovine serum albumin.</a> Rsc Advances. 4 (88), 47649-47656 (2014).</li>
<li>Khramtsov, V. V., Bobko, A. A., Tseytlin, M., Driesschaert, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exchange+Phenomena+in+the+Electron+Paramagnetic+Resonance+Spectra+of+the+Nitroxyl+and+Trityl+Radicals%3A+Multifunctional+Spectroscopy+and+Imaging+of+Local+Chemical+Microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Analyt.+Chem%22%5BJournal%5D)">Exchange Phenomena in the Electron Paramagnetic Resonance Spectra of the Nitroxyl and Trityl Radicals: Multifunctional Spectroscopy and Imaging of Local Chemical Microenvironment.</a> Analyt. Chem. 89 (9), 4758-4771 (2017).</li>
<li>Samouilov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Proton-Electron+Double-Resonance+Imaging+of+Extracellular+Tumor+pH+Using+an+Advanced+Nitroxide+Probe%5BTitle%5D)+AND+%22Analyt.+Chem%22%5BJournal%5D)">In Vivo Proton-Electron Double-Resonance Imaging of Extracellular Tumor pH Using an Advanced Nitroxide Probe.</a> Analyt. Chem. 86 (2), 1045-1052 (2014).</li>
<li>Goodwin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+tumour+extracellular+pH+monitoring+using+electron+paramagnetic+resonance%3A+the+effect+of+X-ray+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22NMR+Biomed%22%5BJournal%5D)">In vivo tumour extracellular pH monitoring using electron paramagnetic resonance: the effect of X-ray irradiation.</a> NMR Biomed. 27 (4), 453-458 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De gepresenteerde methoden toestaan voor noninvasive in vivo beoordeling voor de kritische parameters van de chemische TME, namelijk pO2, pH, redox status en concentraties van interstitiële Pi en intracellulaire GSH. Magnetische resonantie technieken, zoals MRI en lage-veld EPR, zijn de methoden van keuze voor noninvasive in vivo profilering van deze TME-parameters. MRI visualiseert anatomische structuren maar mist functionele gevoeligheid. In tegenstelling tot MRI bieden EPR technie...

Een sleutelrol van de TME in de progressie van kanker en therapie is steeds meer gewaardeerd1. Onder belangrijke fysiologische parameters van de TME in stevige tumors, weefsel hypoxie2, acidose3,4, hoge verminderen capaciteit5, verhoogde concentraties van intracellulaire GSH6,7, en interstitiële Pi8 zijn goed gedocumenteerd. Noninvasive in vivo pO2, pH, Pi, GSH en redox evaluaties unieke inzicht verwerven in de biologische processen in TME en voorschot tools voor pre-klinische screening van anti-kanker medicijnen en TME-gerichte therapeutische strategieën helpen. Een redelijke radiofrequentie indringingsdiepte in weefsels door magnetische resonantie beeldvorming (MRI) en lage-veld EPR gebaseerde technieken maakt ze de meest geschikte benaderingen voor noninvasive beoordeling van deze TME-parameters. MRI berust grotendeels op imaging water protonen en wordt veel gebruikt in de klinische instellingen om anatomische omzetting te leveren maar mist functionele resolutie. De metingen van de fosfor-31 nucleaire magnetische resonantie (31P-NMR) van extracellulaire Pi concentratie en pH op basis van een signaal van endogene fosfaat potentieel aantrekkelijk zijn voor TME karakterisering, maar zijn meestal gemaskeerd door meerdere malen hogere intracellulaire Pi concentraties9,10. In tegenstelling tot dit, EPR metingen gebaseerd op spectroscopie en beeldvorming van speciaal ontworpen paramagnetisch sondes om functionele omzetting te leveren. Opmerking dat exogene EPR sondes een voordeel ten opzichte van exogene hebben NMR sondes te wijten aan de veel hogere intrinsieke gevoeligheid van EPR en afwezigheid van endogene achtergrond EPR signalen. De recente ontwikkeling van een dubbele functie-nitroxyl voor pH en redox sonde11 en multifunctionele trityl sonde12 onovertroffen mogelijkheden biedt voor in vivo gelijktijdige metingen van verschillende TME parameters en hun correlatie analyse onafhankelijke sonde distributie en tijdstip van de meting. Om onze kennis zijn er geen andere methoden beschikbaar voor het gelijktijdig in vivo fysiologisch belangrijke chemische TME parameters in levende onderwerpen, zoals pO2pHe, Pi, redox en GSH te beoordelen.
Sondes voor In Vivo Functionele metingen:
Figuur 1 toont chemische structuren van de paramagnetisch sondes gebruikt voor toegang tot TME parameters, waaronder sondes voor deeltjes en oplosbaar. Hoge functionele gevoeligheid, stabiliteit in levend weefsel, en minimale toxiciteit zijn een paar voordelen waardoor deeltjes sondes over oplosbare sondes voor in vivo EPR oxymetrie de voorkeur. Bijvoorbeeld, zwevende sondes toegenomen retentietijden op de site van weefsel implantaat in vergelijking met oplosbare sondes waardoor longitudinale meting van weefsel pO2 weken. Aan de andere kant, oplosbare sondes deeltjes sondes overtreffen door middel van ruimtelijke-resolved metingen met behulp van EPR gebaseerde beeldvormende technieken evenals waardoor gelijktijdige analyses van veelvoudige functionaliteit (pO2, pH, Pi, redox, en GSH).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56624/56624fig1.jpg"> Figuur 1. Chemische structuren van de paramagnetisch sondes die TME beoordeling assay monteren. Dit omvat de zwevende pO2 sonde, LiNc-BuO (R = - O (CH2)3CH3), en oplosbaar sondes: dubbele functie pH en redox sonde, NR; GSH-gevoelige sonde, RSSR; en multifunctionele pO2, pH en Pi sonde van de extracellulaire communicatie, de hoop sonde. De synthese van deze sondes is beschreven in de verstrekte referenties 11,12. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56624/56624fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

<table><tbody><tr><td>L-band EPR spectrometer</td><td>Magnettech, Duitsland</td><td></td><td>L-band (1,2 GHz) elektronenparamagnetische resonantie (EPR) spectrometer voor het verzamelen van in vitro en in vivo spectra van paramagnetische moleculen</td></tr><tr><td>&nbsp;Temperatuur &amp; Gas Controller&nbsp;</td><td>Noxygen, Duitsland</td><td></td><td>Temperatuur &amp; Gas Controller ontworpen om de temperatuur en gassamenstelling te regelen en aan te passen&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GSH (L-Glutathione gereduceerd)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4251</td><td></td></tr><tr><td>MMTV-PyMT&nbsp; muizen</td><td>In house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>Met-1 muis borstkankercellen</td><td>In house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57Bl/6 wild type muizen&nbsp;</td><td>Jackson Laboratory</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blauw Uitsluitingskleurstof&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Ohmeda Fluotec 3&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isofluraan (IsoFlo)</td><td>Abbott Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Natriumfosfaat dibasisch</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>Natriumfosfaat monobasisch</td><td>sigma-Aldrich</td><td>S07051</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Zoutzuur</td><td>sigma-Aldrich</td><td>320331</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxide</td><td>sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glucose oxydase</td><td>sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lauda Circulator E100</td><td>Lauda-Brikmann</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH meter Orion</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LiNc-BuO sonde</td><td>In house</td><td></td><td>De Octa-n-Butoxy-Naphthalocyanine sonde werd gesynthetiseerd volgens ref 13</td></tr><tr><td>NR sonde</td><td>In house</td><td></td><td>De Nitroxide sonde werd gesynthetiseerd volgens ref 11</td></tr><tr><td>RSSR sonde</td><td>In house</td><td></td><td>De di-Nitroxide sonde werd gesynthetiseerd volgens ref 15</td></tr><tr><td>HOPE sonde</td><td>In house</td><td></td><td>De monofosfonaat Triarylmethyl sonde werd gesynthetiseerd volgens ref 12</td></tr></tbody></table>

in vivo epr beoordeling van ph, po2, redox status, en concentraties van fosfaat en glutathion in de communicatie van de tumor

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

Dit protocol demonstreert de mogelijkheden van lage-veld elektron paramagnetisch resonantie (EPR)-op basis van technieken in combinatie met functionele paramagnetisch sondes kwantitatieve informatie te verstrekken over de chemische tumor communicatie (TME), met inbegrip van p O2, pH, redox status, concentraties van interstitiële anorganisch fosfaat (Pi), en intracellulaire glutathion (GSH). In het bijzonder, een toepassing van een onlangs ontwikkelde oplosbare multifunctionele trityl sonde biedt onovertroffen gelegenheid voor in vivo gelijktijdige metingen van pHen pO2 Pi E xtracellular ruimte (hoop sonde). De metingen van drie parameters met behulp van één sonde voorzien in hun correlatie analyse onafhankelijk van de distributie van de sonde en het tijdstip van de metingen.

Weefsel p O 2 Evaluatie met behulp van de LiNc-BuO sondes:
Met behulp van de procedure beschreven onder stap 1.1, we de kalibratie van vers bereide LiNc-BuO microcrystals schorsing uitgevoerd. Figuur 2 toont de typische zuurstof-afhankelijkheid van de linewidth van de LiNc-BuO sonde, evenals haar...

Low-veld (L-band, 1,2 GHz) elektron paramagnetisch resonantie met behulp van oplosbare nitroxyl en trityl sondes is voor beoordeling van fysiologisch belangrijke parameters in de communicatie van de tumor in muismodellen van borstkanker aangetoond.

In Vivo EPR beoordeling van pH, pO2, Redox Status, en concentraties van fosfaat en glutathion in de communicatie van de Tumor

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Het algemene doel van deze in vivo elektroparamagnetische resonantietechnologie is om de fysiologisch relevante parameters van de lokale weefselmicro-omgeving kwantitatief en niet-invasief te beoordelen in preklinische omgevingen in diermodellen van kanker. Deze techniek is gebaseerd op de combinatie van flourofield APR met speciaal ontworpen functionele paramagnetische sondes om kwantitatieve informatie te verstrekken over weefseloxygenatie als CDT in dock-status evenals interstitiële organische fosfaat- en intercellulaire concentraties. Deze niet-invasieve techniek biedt een unieke blik in de wereld van de tumormicro-omgeving en tumorregeneratie en kan bijdragen aan de toekomstige rationele ontwikkeling van op de tumormicro-omgeving gerichte antikankertherapieën.De toepassing van deze techniek strekt zich uit naar de correlatie van de hersenen tussen de parameters van de toepassing van multifunctionele APR-sondes. Daarom biedt het aanvullende inzicht in de onderliggende biologische mechanismen. Naast mij en Andrey zullen Marieta Gencheva en Dr.Benoit Driesschaert en een afgestudeerde student, Kayla Steinberger van het IMMR Center, de procedure demonstreren.Om de partikelvormige zuurstofgevoelige sonde voor te bereiden, weegt u eerst 60 milligram van de microkristallen. Voor zuurstofsensitiviteitskalibratie, suspendeert u microkristallen in drie milliliter dolbeckas gemodificeerd eagle-media. Soniceer gedurende vijf minuten op ijs met een sondesonicator bij 20 kilohertz met behulp van zeven watt vermogen in een vijf milliliter glazen ronde bodembuis.Plaats vervolgens een milliliter van de gesoniceerde microkristallen in een glazen buis in de oppervlaktespoel van de L-band EPR-spectrometer. Verzamel continue golven EPR-spectra bij de fysiologische temperatuur van 37 graden Celsius en zuurstofconcentraties van nul, een, twee, vier, acht en 20,9 procent. Om de dubbelfunctie pH- en redoxsonde voor te bereiden, lost u 6,34 milligram van de sonde op in een milliliter zoutoplossing.Stel de pH af op 7,2 met kleine toewijzingen van zoutzuur of natriumhydroxide met behulp van een pH-meter. Om de pH-kalibratie van de nitroxidesonde uit te voeren, voegt u eerst 0,1 milliliter van de sonde-voorraadoplossing toe aan 0,9 milliliter van twee millimolair natriumfosfaatbuffer, 150 millimolair natriumchloride. Titreer vervolgens de verkregen ene millimolair sonde-oplossing met toewijzingen van zoutzuur of natriumhydroxide tot de gewenste pH met behulp van een pH-meter.Neem de EPR-spectra van de monsters op in 1,5 milliliter microcentrifugebuisjes met behulp van de L-band EPR-spectrometer. Om de GSH-gevoelige RSSR-sonde voor te bereiden, lost u 4,05 milligram van de sonde op in een milliliter DMSO-oplossing. Bepaal vervolgens de waarde van de snelheidsconstante van de reactie van RSSR met GSH.Voer dit uit door eerst 20 microliter van de RSSR-voorraadoplossing toe te voegen aan 0,98 milliliter van een millimolair fosfaatbuffer pH 7,2, 150 millimolair natriumchloride om een 0,2 millimolair RSSR-sonde-oplossing te verkrijgen. Meng vervolgens gelijke volumes van 0,2 millimolair RSSR-oplossing in een van de GSH-oplossingen voor een uiteindelijke concentratie van de sonde bij 0,1 millimolair en van GSH bij 0,5, een of 2,5 millimolair. Plaats het monster onmiddellijk na het mengen van RSSR- en GSH-oplossing in de EPR-sonde en neem het EPR-spectrum elke 12 seconden gedurende 10 minuten op.Bereken vervolgens de kinetica van de toename van de monoradicale spectrale amplitude voor de multifunctionele HOPE-sonde voor zuurstof-pH en Pi-beoordeling. Los 10,7 milligram van de sonde op in een milliliter zoutoplossing en stel de pH af op 7,4. Voeg vervolgens 20 microliter van de bereide voorraadoplossing toe aan 0,98 milliliter van de zoutoplossing om een 0,2 millimolair sonde-oplossing te verkrijgen.Voor sondekalibratie van de pH, titreert u 0,2 millimolair van de sonde-oplossing door de toevoeging van een klein volume natriumhydroxide of zoutzuur zodat de uiteindelijke verdunning van het monster minder dan 1% is. Verzamel de EPR-spectra bij intermediaire pH zoals beschreven in het tekstprotocol. Voor zuurstofsensitiviteitssonde-kalibratie, verzamel EPR-spectra van de sonde bij verschillende zuurstofconcentraties zoals beschreven in het tekstprotocol. Voor sondekalibratie van Pi, verzamel EPR-spectra van de sonde bij verschillende fosfaatconcentraties.Gebruik de radicaaloplossing met een pH-waarde nabij de PKA en titreer deze met verschillende fosfaatconcentraties. Houd de temperatuur en gassamenstelling zoals voorheen. In het geval van het MET1-tumormodel voor internalisatie van de partikelvormige sonde in MET1-cellen, voegt u 100 microliter van de gesoniceerde suspensie toe aan een T75-kolf met 10 milliliter kweekmedium dat MET1-cellen bevat.Alle procedures vinden plaats in een bioveiligheidskast en het medium bevat penicilline en streptomycine om mogelijke infectie tot een minimum te beperken. Incubeer de cellen gedurende 72 uur bij 37 graden Celsius of tot ze ongeveer 80% confluency bereiken. Aspergeer het medium en was de cellen vijf keer met 10 milliliter PBS.Los de cellen los met vijf milliliter tripsine-EDTA. Na het verzamelen van de cellen en centrifugeren zoals eerder, kleurt u de steekproef van de cellen van de uitsluitingskleurstof om de cellevensvatbaarheid en -hoeveelheid te bepalen. Suspendeer de cellen in een concentratie van een miljoen cellen per 100 microliter in minimaal DMEM.Gebruik een insulinesyringe om langzaam 100 microliter van de celsuspensie met de geïnternaliseerde microkristallen te injecteren in de nummer vier borstvetklier van een acht weken oude, vrouwelijke, wild-type muis zoals beschreven in het tekstprotocol. Monitor de tumorinitiatie en groei. Voor EPR-spectroscopische metingen, verdooft u de muizen door inademing van een isoflorane-luchtmengsel met behulp van een anesthesiemachine zoals beschreven in het tekstprotocol.Voer functionele metingen uit met behulp van een L-band EPR-spectrometer door de oppervlaktespoel

in-vivo-epr-assessment-ph-po2-redox-status-concentrations-phosphate

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Bioluminescentie beeldvorming van hypoxie induceerbare factor-1α-activiteit wordt toegepast op intracraniale tumor hypoxie ontwikkeling in een borstkanker hersenmetastasen muismodel te controleren.

In vivo bioluminescentie van Tumor Hypoxie Dynamiek van Borstkanker hersenmetastasen in een muismodel

Hier wordt real-time monitoring van het metabolisme van tumorcellen, gecombineerd met een in vivo kippenembryo chorio-allantoïsche membraan (CAM) model van metastase, gebruikt om nieuwe anti-kanker doelen/middelen te evalueren op hun vermogen om tumorcellen te sensitiviseren voor DNA-beschadigende chemotherapeutica.

Het evalueren van de effectiviteit van Cancer Drug Overgevoeligheid<em&gt; In Vitro</em&gt; En<em&gt; In Vivo</em

Een methode nieuwe elektronen paramagnetische resonantie (EPR), een snelle scan EPR (RS-EPR), is aangetoond voor 2D spectrale ruimtelijke beeldvorming die superieur is aan de traditionele continue golf (CW) techniek en opent nieuwe locaties voor in vivo beeldvorming. Resultaten worden gedemonstreerd op 250 MHz, maar de techniek is toepasbaar bij een bepaalde frequentie.

Rapid Scan Electron Paramagnetische Resonantie opent nieuwe wegen voor Imaging Fysiologisch belangrijke parameters<em&gt; In Vivo</em

Dit manuscript beschrijft de ontwikkeling van een diermodel dat directe testen van de effecten van tumorhypoxie op metastase en het ontcijferen van de werkingsmechanismen mogelijk maakt. Hoewel de hier beschreven experimenten zich richten op Ewing-sarcoom, kan een vergelijkbare aanpak worden toegepast op andere tumortypen.

In vivo model voor het testen Effect van hypoxie op tumormetastase

Een niet-invasieve in vivo imaging protocol dat is gestroomlijnd en kosteneffectieve, beschrijven we met behulp van L-012, een chemiluminescentie luminol-analoog, om te visualiseren en te kwantificeren van reactieve zuurstof soorten (ROS) gegenereerd in een excisional wond muismodel.

In Vivo Beeldvorming van reactieve zuurstof soorten in een RattenUitrustingen wond Model

Elektron paramagnetisch resonantie (EPR) spectroscopie is een eenduidige methode voor het meten van vrije radicalen. Het gebruik van selectieve spin sondes zorgt voor detectie van vrije radicalen in andere cellulaire compartimenten. Presenteren we een praktische, efficiënte methode voor het verzamelen van biologische monsters die behandeling, opslaan en overzetten van monsters voor EPR metingen te vergemakkelijken.

Gebruik van Electron paramagnetisch resonantie in biologische monsters bij kamertemperatuur en 77 K

We beschrijven twee methoden voor het beoordelen van voorbijgaande vasculaire permeabiliteit geassocieerd met tumor micro omgeving van metastasen (tmem) deuropening functie en kankercel intravasatie met behulp van intraveneuze injectie van hoog-moleculair gewicht (155 kDa) dextran bij muizen. De methoden omvatten intravital beeldvorming in levende dieren en vaste weefsel analyse met behulp van immunofluorescentie.

Beoordeling van tumor Microenvironment van metastasen doorway-gemedieerde vasculaire permeabiliteit geassocieerd met kanker cel verspreiding met behulp van Intravital beeldvorming en vaste weefsel analyse

We ontwikkelden een reproduceerbare methode om de internalisatie van niet-hydrolyseerbaar fluorescerend adenosinetrifosfaat (ATP), een ATP-surrogaat, met hoge cellulaire resolutie te visualiseren. We hebben onze methode gevalideerd met behulp van onafhankelijke in vitro en in vivo assays - menselijke tumorcellijnen en immunodeficiënte muizen xenografeerd met menselijk tumorweefsel.

Fluorescentiemicroscopie voor ATP-internalisatie gemedieerd door macropinocytose in menselijke tumorcellen en tumor-xenogetransplanteerde muizen

We beschrijven een protocol voor de productie, cultuur en visualisatie van menselijke kankers, die zijn uitgezaaid naar de peritoneale oppervlakken. Reseceerde tumormonsters worden gesneden met behulp van een vibratoom en gekweekt op permeabele inserts voor verhoogde oxygenatie en levensvatbaarheid, gevolgd door beeldvorming en downstream-analyses met behulp van confocale microscopie en flowcytometrie.

Cultuur en beeldvorming van ex vivo organotypische pseudomyxoma peritonei tumorplakken van gereseceerde menselijke tumorspecimens

Kwantitatieve 3D-zuurstofkaarten van muizentumoren werden niet-invasief in beeld gebracht met behulp van Pulse Electron Paramagnetic Resonance. Echografie B-modus en Power Doppler werden gebruikt voor anatomie en vasculaire structuur. Beelden van beide modaliteiten werden over elkaar heen gelegd, waardoor multiparametrische tumoranalyse mogelijk werd.

Beoordeling van tumorhypoxie: in vivo 3D-zuurstofbeeldvorming door middel van paramagnetische resonantie met elektronen 

Leer hoe je in vivo EPR-technologie gebruikt voor kwantitatieve beoordeling van zuurstof, pH en redoxstatus in het tumormicro-milieu van muismodellen. Deze niet-invasieve methode biedt unieke inzichten voor kankeronderzoek.

In Vivo EPR beoordeling van pH, pO₂, Redox Status, en concentraties van fosfaat en glutathion in de communicatie van de Tumor

Meer video's verkennen