Uitgebreide Workflow voor de genoom-brede identificatie en expressie Meta-analyse van de ATL E3 Ubiquitin Ligase Gene familie in Grapevine
22 december 2017
Dit artikel beschrijft de procedure voor de identificatie en karakterisering van de familie van een gen in grapevine toegepast aan de familie van Arabidopsis Tóxicos in Levadura (ATL) E3 ubiquitin ligases.
Het algemene doel van deze procedure is om een uitgebreide karakterisering van een genfamilie in planten te bereiken via een globale aanpak, inclusief de definitie van genstructuur, betrokken eiwitmotieven, chromosoomlocatie, genduplicaties en expressiepatronen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de classificatie van planten in families, zoals wereldwijde genomische identificatie van familieleden en hun transcriptoom, wat wordt geleverd door genexpressieanalyse. Het belangrijkste voordeel van de hele procedure is om een uitgebreide lijst van experimentele stappen te bieden om een complete genfamiliekarakterisering te bereiken.
Deze procedure kan worden toegepast op elke genfamilie van elke plantensoort waarvoor genetische gegevens beschikbaar zijn. Bovendien biedt deze aanpak waardevolle informatie om interessante kandidaten te identificeren voor functionele studies. Het demonstreren van de hele procedure zal Pietro Ariani zijn uit mijn laboratorium.
Open de Blast-webpagina en klik op de protein blast-sectie. Voer in het veld voor querysequentie de aminozuursequentie in van het eiwit dat zal worden gebruikt als sonde om de andere familieleden te identificeren. Gebruik een eiwit dat alle belangrijke kenmerken heeft die de familie karakteriseren.
Vervolgens, in het veld kies zoekset, selecteer de referentie-eiwitdatabase en het organisme van belang. Nu, in het veld programmaselectie, selecteer het PSI-BLAST-algoritme. Indien gewenst, klik op algoritmeparameters om geavanceerde parameters aan te passen zoals max doelsequentie en scoringmatrix.
De E-waarde is de drempel, die voor deze zoekopdracht is verlaagd van 005 naar 001. Klik op de BLAST-knop om de analyse uit te voeren. Van alle sequenties die relatieve overeenkomsten met de query weergeven, deselecteer de items die duidelijk niet tot de familie behoren.
Doe dit door te klikken op het vinkje in de kolom selecteren voor PSI-BLAST. Vervolgens, voer een tweede PSI-BLAST-iteratie uit door op de knop ga te klikken. Alle nieuw geïdentificeerde sequenties worden gemarkeerd in geel.
Selecteer opnieuw de overeenkomsten die niet tot de familie behoren. Ga dit proces voort totdat het algoritme geen relevante vermelding meer vindt of totdat het convergeert. Zodra alle valse positieven zijn uitgesorteerd, verzamel de aminozuursequenties in een FASTA-geformatteerd bestand en upload het bestand in de bio-informatica softwaresuite.
Selecteer vervolgens alle geïmporteerde sequenties in de lijst en klik op de knop uitlijnen/assembleren in de werkbalk. Klik vervolgens op paarsgewijze meervoudige uitlijning en selecteer MUSCLE-uitlijning en OK. De uitlijning zal nu worden gemaakt met de standaardinstellingen. Visualiseer nu het sequentielogo van de uitlijning en inspecteer de genen visueel om naar valse positieven te zoeken.
Verdere analyse van fysische eiwitparameters en domeinen, chromosomale verdeling, duplicaties en exon-intron organisatie worden beschreven in het tekstprotocol. Analyseer vervolgens de relaties tussen de ATL-familieleden door de constructie van een hoogwaardige fylogenetische boom en de definitie van een familienomenclatuur. Haal eerst de Arabidopsis thaliana ATL-sequenties op, vereist als referenties voor een druifwiensgennomenclatuur, uit de UmoProt-database als referentie.
Maak vervolgens een FASTA-bestand inclusief alle nucleotidesequenties van de druivenstok en de Arabidopsis-genfamilieleden voor de fylogenetische analyse. Blader nu door de fylogenie Frankrijk-homepage en selecteer de fylogenie-analysepijplijn. Eén klik is geschikt in de meeste gevallen, maar indien nodig is het mogelijk om specifieke geavanceerde instellingen te selecteren met behulp van de geavanceerde opties of zelfs een volledig aangepaste analyse met behulp van de a la carte-opties.
Voer vervolgens een naam in voor de analyse en upload het FASTA-bestand. Klik vervolgens op verzenden om de analyse uit te voeren. Als deze procedure resulteert in een foutmelding, voltooi elke stap van de fylogeniesuitepijplijn afzonderlijk.
Ga eerst naar de MUSCLE-softwarehomepage en upload het FASTA-bestand. Selecteer Pearson FASTA als uitvoerformaat en dien in. Download vervolgens het bestand in FASTA-formaat en verwijder alle slecht uitgelijnde posities.
Open de G-block-servertool, upload het uitlijnings-FASTA-bestand, selecteer DNA als type sequentie en kies de strengheid die het beste past bij de analyse. Voor een druifwienstok ATL-genfamilieuitlijning, selecteer alle drie de opties voor minder strenge selectie vanwege hoge sequentiedivergentie. Klik vervolgens op get blocks om de analyse uit te voeren.
Om de resultaten op te slaan, klik op resulterende uitlijning onderaan de uitvoerpagina en maak een nieuw FASTA-bestand. G-blocks elimineert slecht uitgelijnde posities in divergente regio's van een DNA- of sonde-uitlijning, zodat deze geschikter wordt voor een fylogenetische analyse. Voor deze stap is impericel parameterselectie voor de kolommen strengheid cruciaal om ervoor te zorgen dat ze een verplichting van de drie zijn.
Om de boom te voltooien, gaan we naar de Phylogeny France-homepage. Daar, selecteer de a la carte-pijplijn en deselecteer de volgende opties: meervoudige uitlijning en uitlijningscuration. Klik vervolgens op workflow maken, upload het G-blocks gecurateerde FASTA-bestand, selecteer bootstrapping-procedure en gebruik standaardparameters en instellingen.
Klik ten slotte op verzenden om de analyse uit te voeren. Dit voltooit het stap-voor-stap-proces. Nu de fylogenetische boom is gemaakt, vouw de slecht ondersteunde takken met bootstrapwaarden van minder dan 70% in. Download vervolgens de uiteindelijke resultaten in de Newick-indeling voor verdere analyse.
Het tekstprotocol geeft instructies voor het toewijzen van een gennaam op basis van de fylogene. Voor dit protocol, maak een getypt, gelinieerde, tekstformaatbestand van arma-genormaliseerde expressiewaarden afkomstig van een genexpressiebibliotheek. Organiseer de waarden voor elk familiegen onder dezelfde patroonrijen.
Voer vervolgens de hiërarchische bi-geclusterde analyse uit met behulp van multi-experiment viewer software. Upload eerst de werkgegevensmatrix en selecteer het tekstbestand. Selecteer enkelkleurig array en verwijder het vinkje van laad annotatie wanneer er geen automatische annotatie wordt geleverd.
Selecteer de bovenste linker expressiewaarde van de expressietafelvoorbeeld en klik op de knop laden. Pas vervolgens de gegevens aan, to
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een procedure voor de identificatie en karakterisering van een genfamilie in wijnstokken, met name gericht op de Arabidopsis Tóxicos in Levadura (ATL) E3 ubiquitine ligasen. De methode heeft tot doel een uitgebreid begrip te geven van genstructuur, eiwitmotieven, chromosoomlocatie, genduplicaties en expressiepatronen.
Belangrijke studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Plantgenetica
- Genkarakterisering
- Ubiquitine Ligasen
Achtergrond
- Het begrijpen van genfamilies is cruciaal voor plantenclassificatie.
- Genexpressieanalyse helpt bij het identificeren van familieleden.
- Karakterisering kan functionele kandidaten onthullen voor verdere studies.
- Deze methode is toepasbaar op elke plantensoort met beschikbare genetische gegevens.
Doel van de studie
- Om een uitputtende karakterisering van een genfamilie te bereiken.
- Om genstructuur en bijbehorende eiwitmotieven te definiëren.
- Om genduplicaties en expressiepatronen te analyseren.
Gebruikte methoden
- Globale genomische identificatie van genfamilieleden.
- Transcriptomanalyse voor genexpressieprofilering.
- Experimentele stappen voor volledige karakterisering van genfamilies.
- Toepassing van de procedure op verschillende plantensoorten.
Belangrijkste resultaten
- Uitgebreide lijst van experimentele stappen geleverd.
- Identificatie van interessante kandidaten voor functionele studies.
- Inzichten in de classificatie van genfamilies in planten.
- Demonstratie van de procedure door Pietro Ariani.
Conclusies
- De procedure biedt een systematische benadering voor genfamiliekarakterisering.
- Het verbetert het begrip van plantgenetica en evolutie.
- Waardevol voor toekomstig onderzoek in plantenbiologie.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Genome-wide identification and meta-analysis of gene families, such as ATL E3 ubiquitin ligases in grapevine, enable systematic target validation and mechanistic de-risking in plant biotechnology pipelines. This workflow supports predictive confidence in functional genomics, informing candidate prioritization for trait engineering and stress adaptation studies. The approach is broadly applicable to any plant species with genomic data, enhancing portfolio decision-making in agricultural R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables comprehensive cataloging of gene family members for hypothesis-driven target selection.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying gene structure, duplication, and conserved motifs.
- Facilitates functional annotation and prioritization of candidates for downstream validation.
Screening & Assay Development
- Provides standardized gene family datasets for assay development and screening workflows.
- Enables reproducible identification of expression patterns across tissues and conditions.
- Supports scalable analysis of gene function and response to biotic stressors.
Translational & Preclinical Research
- Aligns gene expression clusters with phenotypic outcomes relevant to stress adaptation.
- Enables continuity from discovery genomics to trait validation in preclinical plant models.
- Supports risk-adjusted advancement of gene candidates for functional studies.
Pipeline & Workflow Integration
This workflow integrates from early discovery through lead identification and preclinical trait validation in plant biotechnology pipelines.
- Discovery Biology: Supports genome-wide hypothesis testing and gene family classification for target validation.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative gene expression profiles for candidate triage.
- Analytics: Provides hierarchical clustering and phylogenetic outputs to compare gene family members.
- Translational Research: Links gene expression modulation to stress response phenotypes in plants.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable informatics workflow adaptable to any plant gene family with available genomic data.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in gene function and target selection.
- Operational Value: Standardizes gene family characterization and expression analysis across projects.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions for candidate advancement and resource allocation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of gene targets for trait engineering and stress adaptation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in bioinformatics, phylogenetics, and gene expression analysis.
- Depends on access to genomic databases, alignment tools, and clustering software.
- Necessitates standardized data processing and annotation protocols across teams.
- Adaptable to diverse plant species and gene families with available sequence data.
- Stringency in alignment and clustering parameters is critical for reliable outputs.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:04
Identifying Putative Gene Family Members, Making Alignments, and Sequence Logos
3:33
Phylogenetic Analysis and Nomenclature
6:51
Tissue Expression Meta-analysis
8:27
Results: Identified ATL Gene Family Members in the Grapevine Genome
9:52
Conclusion
