Snelle detectie van neurologische fenotypen in menselijke neurale voorlopercellen (NPC)

Het algemene doel van dit protocol is om vroege hersontwikkelingsprocessen van menselijke neurale voorlopercellen op een snelle en reproduceerbare manier te karakteriseren, en om de effecten van belangrijke extracellulaire factoren bij het reguleren van deze processen te definiëren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van neuropsychiatrie en neurodevelopmentele stoornissen, zoals of alle getroffen individuen dezelfde cellulaire abnormaliteit hebben, of dat elk een persoonlijke specifieke disfunctie vertoont. Het grote voordeel van ons protocol is dat het snel, zeer reproduceerbaar en eenvoudig te implementeren is.

Hoewel deze methode kan worden gebruikt om inzicht te geven in neurodevelopmentele stoornissen, kan het ook worden gebruikt om neurodegeneratieve en neuropsychiatrische stoornissen zoals Alzheimer en depressie te bestuderen. Visuele demonstratie van enkele van deze methoden is noodzakelijk, omdat sommige technieken het verplaatsen van cellen van de ene schaal naar de andere inhouden of morfologische analyses vereisen die het beste worden gecommuniceerd door middel van visuele demonstratie. Om de menselijke neurale voorlopercellen op te tillen, aspireer het medium en was de cellen eenmaal met 1X fosfaat gebufferd zout. Vervolgens was je de cellen opnieuw met een milliliter fosfaat gebufferd zout en draag de was naar de buis over. Vervolgens draaien de cellen bij 300 G gedurende vijf minuten om de pellet te vormen.

Vervolgens gooi de supernatant weg en resuspendeer de pellet in één tot vijf milliliter voorverwarmde DMEM F12 medium. Plaats 100.000 cellen in drievoudige putten in een 24-well plate. Na 46 uur, voeg getritieerd thymidine toe aan het kweekmedium en incubeer bij 37 graden Celsius gedurende twee uur.

Vervolgens, na het verwijderen van het medium, voeg 300 microliter voorverwarmde 0,25% trypsin EDTA toe en incubeer gedurende 20 minuten bij 37 graden Celsius om de cellen uit elkaar te breken en het DNA vrij te maken. Draai vervolgens de cell harvester en pomp aan. Plaats een filterpapier in de cell harvester.

Verzamel de buizen van de cell harvester in een lege lege lade. Druk vervolgens op prewash om het filterpapier nat te maken. Plaats de verzamelbuizen in monsterputten en begin.

Gebruik een hete lichtbron om het filterpapier te drogen en plaats overeenkomstige flesjes op de lade. Snijd papier restjes uit in de flesjes en voeg vervolgens twee milliliter vloeibaar scintillatiecocktail toe aan elk flesje. Incubeer de flesjes gedurende één uur in de scintillatieteller voordat u de machine bedient om de tellen per minuut van elk monster te verkrijgen, wat de actieve DNA-synthese weerspiegelt.

Zaai 500.000 cellen in een 35-millimeter kweekschaal. Roer vervolgens de schaal in alle richtingen om de cellen gelijkmatig te verdelen. Vervolgens incuberen de cellen bij 37 graden Celsius gedurende 46 uur.

Vervolgens, voeg twee microliter per milliliter van vijf millimolair EdU toe aan de kweek en incubeer gedurende twee uur. Dissocieer vervolgens en pellet de cellen. Voeg aan de celpellet drie milliliter van 30% expansiemedium toe met of zonder groeifactoren of geneesmiddelen.

Plaats een milliliter van de celsuspensie op de voorgecoate schalen en incubeer de plaat bij 37 graden Celsius gedurende twee uur. Om het aantal neurale voorlopercellen in cultuur te bestuderen, label en bereid na twee dagen microcentrifugebuisjes. Vervolgens aspireer het medium van de put en voeg 200 microliter 1X celdetachment-oplossing toe en incubeer de plaat bij 37 graden Celsius gedurende 15 minuten.

Na celdetachment, voeg 300 microliter 1X fosfaat gebufferd zout toe aan elke put. Gebruik een P1000 pipet om de celoplossing meerdere keren te pipetten en de cellen van de plaat te verwijderen. Draag vervolgens de celoplossing over naar de voorbereide 1,5-milliliterbuis en draai de buis twee tot drie keer om.

Trek met behulp van een pipet 50 microliter cellen halverwege de buis en voeg toe aan trypanblauw oplossing in een 0,5-milliliterbuis. Tel vervolgens de cellen met behulp van een hemocytometer. Om de neurosfeer te vormen, pipet een milliliter 100%expansiemedium in een 35-millimeter schaal zonder enige coating substraat.

Voeg vervolgens een miljoen neurale voorlopercellen toe in elk van deze platen en incubeer de plaat bij 37 graden Celsius gedurende 48 tot 96 uur. Om de plaat voorwaarts te bereiden voor neurosfeer migratie, lost ECM-mimic gel aliquots op in zes milliliter 30%expansiemedium. Voeg een milliliter ECM-mimic gel met 30%expansiemedium toe in een enkele put van een zes-well plate.

Vervolgens incubeer de plaat bij 37 graden Celsius gedurende 30 minuten. Om de neurosferen te plateren, gebruik een pipet om de cellen in het medium van de 35-millimeter schaal te verzamelen en deze over te brengen naar een conische buis. Draai vervolgens de buis bij 100 G om de neurosferen te pelleten.

Vervolgens resuspendeer de pellet in één tot drie milliliter voorverwarmd 30%expansiemedium. Pipet vervolgens 200 microliter van de gesuspendeerde neurosferen in de zes-well plate met ECM-mimic gel met 30%expansiemedium en schud de plaat. Vervolgens incubeer de plaat bij 37 graden Celsius gedurende 48 uur.

Aspibeer de ECM-mimic gel met 30%expansiemedium en fixeer vervolgens de cellen gedurende 30 minuten met behulp van 4%paraformaldehyde. Om de neurosferen te analyseren, maak afbeeldingen met behulp van fasecontrastinstellingen bij 10X vergroting. Gebruik de NIH ImageJ software om de gemiddelde migratie van de neurosferen te meten.

Gebruik op ImageJ de vrijhandlijntool om de buitenste contour van de neurosfeer te traceren. Gebruik vervolgens de meetfunctie om het traceringsgebied te berekenen en traceer de binnenste celmassa van de bol. Trek de binnenste celmassa af van het totale neurosfeergebied om de gemiddelde migratie te kwantificeren.

De immunocytochemische kleuring werd gedaan om de expressie van cytoskeletal eiwitten en transcriptiefactoren zoals SOX2