Toepassing van electrofysiologie meting op het bestuderen van de activiteit van Electro-neutrale Transporters
3 februari 2018
Dit manuscript beschrijft de toepassingen van proton-Ionselectieve electroden en patch klemmen van methoden voor het meten van de activiteit van proton vervoerssystemen. Deze methoden zijn sommige beperkingen van technieken gebruikt bij het bestuderen van proton vervoersactiviteit, zoals matige gevoeligheid, resolutie van de tijd en onvoldoende intracellulaire milieu controle.
De methode van reusachtige patches in combinatie met ion-selectieve microelektroden is een veelzijdige methode die wordt gebruikt om ionenfluxen te detecteren en te kwantificeren. Specifiek wordt het gebruikt om de protonfluxen te meten die worden gegenereerd door de activiteit van de elektro-neutrale ionentransporter, de natrium-waterstofwisselaar of NHE, die wordt uitgedrukt op het celmembraan. De natrium-waterstofwisselaar genereert een gradiënt van protonen in de nabijheid van het plasmamembraan, hier aangegeven als een oranje ring.
Deze gradiënt van protonen over het celmembraan wordt gemeten door whole cell patch clamp-opname in combinatie met een techniek die een proton-selectieve microelektrode gebruikt. De proton-selectieve microelektrode wordt dicht bij het celoppervlak bewogen, waar het de flux van protonen meet die uit de cellen stromen, hier weergegeven in positie A. En weg van het celoppervlak, waar het de vrije protonconcentratie meet die aanwezig is in de oplossing, aangegeven door positie B. En dan, terug naar positie A, dicht bij het celmembraan, in een herhaalde, oscillerende beweging. Het spanningsverschil van A naar B wordt geregistreerd en is afhankelijk van de vertegenwoordiger van de NHE-activiteit.
Transporteerders van ionen zoals protonen over het celmembraan beïnvloeden processen die essentieel zijn voor het leven. Daarom worden veranderingen in pH strikt gereguleerd door een reeks moleculen, waaronder de natrium-protonwisselaar, een proton-uitsluitingssysteem in het plasmamembraan. De oscillerende pH-microelektrode in combinatie met whole cell patch clamping is een nieuwe benadering om de protonflux te bestuderen die wordt gemedieerde door de natrium-protonwisselaar-activiteit.
Toepassing van deze methoden overwint enkele van de belangrijkste beperkingen van de meestal gebruikte technieken om de natrium-protonwisselaar-activiteit te meten, zoals matige gevoeligheid en tijdsresolutie en een andere goede controle van de intracellulaire omgeving. Ik zal een demonstratie van de methoden geven samen met mijn medewerker, Dr. Victor Babich. Dr. Matthew Henry zal de verteller zijn.
We gaan een toepassing van deze methode demonstreren door de activiteit van de natrium-protonwisselaar isovormen drie te meten, die een belangrijke regulator is van de opname van zout in water over het darm- en nierepithelium. De proton-selectieve microelektroden voor de meting van de protonconcentratie worden vervaardigd uit standaard borosilicaatglasbuizen. Borosilicaatglaselektroden met een externe diameter van 1,2 millimeter en zonder gloeidraad worden getrokken met een verticale puller, met behulp van een conventioneel dubbel pull-protocol.
Een pijpjespunt met een diameter van twee tot drie micrometer wordt verkregen. De pipetten worden in een pothouder geplaatst met de pijpjespunt naar boven. Vervolgens wordt een mengsel bereid om de pipetten te siliconiseren.
Het wordt in een pot gegoten en de deksel wordt goed gesloten. Pipetten worden gedurende 24 tot 48 uur geïncubeerd met het siliconisatiemengsel. Wees voorzichtig, zorg ervoor dat u het mengsel bereidt en de pipetten siliconiseert bij kamertemperatuur in een goed geventileerde chemische afzuigkap.
Vul de pijp terug met de juiste ion-selectieve hars en plaats hem voorzichtig verticaal in een pothouder met de pijpjespunt naar beneden. Om voor te bereiden op patch clamping, begint u met het trekken van patch clamping pipetten uit dunwandige borosilicaatglas met een externe diameter van twee millimeter en een interne diameter van 1,4 millimeter in een verticale puller met behulp van een conventioneel dubbel pull-protocol. Gebruik een microforge gemonteerd op een trap van een omgekeerde microscoop om een brede pijpjespunt te maken.
Plaats de pijp dicht bij de dikke platinadraad van de microforge. Schakel de verwarming in met een voetschakelaar die de stroom aan en uit schakelt. Verhit het glas met een laag smeltpunt dat het midden van de dikke platinadraad van de microforge bedekt en beweeg vervolgens de pijpjespunt dicht bij het gesmolten zachte glas.
Het verwarmen beweegt de platinadraad iets naar het centrum. De platinadraad keert terug naar de oorspronkelijke positie en de pijpjespunt breekt. Herhaal de procedure tot de gewenste puntdiameter is verkregen en breng ten slotte warmte toe om de punt glad te maken.
Pijpjespuntjes hebben een diameter van 10 micrometer na het polijsten met de microforge. Het gebruik van de dikke platinadraad is een voordeel omdat er weinig uitzetting is nadat de stroom is ingeschakeld en minder mogelijkheid is om de draad en pijp te oververhitten met overmatige stroom. Nadat de cellen zijn gedissocieerd met behulp van trypsine en trypsinisatie is geblokkeerd, worden de cellen op een schuddende schuier gehouden om de vorming van klonten te voorkomen.
Dit wordt gedurende maximaal twee uur na trypsinisatie gedaan. De elektrofysiologische opstelling bestaat uit een temperatuurregelaar om de temperatuur van de oplossing in het perfusiesysteem te regelen. Alle experimenten worden uitgevoerd bij ongeveer 37 graden Celsius.
En een optische filterswitcher om het filterwiel voor fluorescentiebeeldvorming te regelen. Een perfusiesysteemklepcontroller om de opening en sluiting van de perfusiesysteemkleppen te regelen. En de temperatuurregelaar om de temperatuur van de opnamekamer te regelen.
Een oscilloscoop om golfvormen te observeren en een patch clamp-versterker. Een computer die deze Capmeter-software draait. En een elektrometers om het ion-selectieve microelektrodesignaal te registreren.
En een differentiële versterker om het signaal van de elektrometers te versterken. De elektrofysiologische opstelling is ook uitgerust met een omgekeerde microscoop met trapcontroller, twee micro-manipulatoren met controllers gepositioneerd aan de linker- en rechterkant van de microscoop, het perfusiesysteem met inline oplossingsverwarming. Nadat de ion-selectieve microelektrodepijp is gemonteerd op de micromanipulator, vult u de patch clamping-pijp terug met de intracellulaire oplossing.
Zorg ervoor dat de oplossing de punt van de pijp bereikt. Het kan enkele zachte tikken vereisen om luchtbellen in de punt van de pijp te elimineren. Monteer vervolgens de patch clamping-pijp op de hoofdtrap van de elektrofysiologische opstelling.
Breng voorzichtig gezond uitziende cellen over naar de opnamekamer gevuld met een gedefinieerd volume badoplossing. Het
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit manuscript beschrijft de toepassingen van protonselectieve elektroden en patchclamp-methoden om de activiteit van protontransportsystemen te meten. Deze methoden bieden een verbeterde gevoeligheid en controle over de intracellulaire omgeving in vergelijking met traditionele technieken.
Belangrijkste studieonderdelen
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Elektrofysiologie
- Ionentransportmechanismen
Achtergrond
- Protonentransportsystemen zijn cruciaal voor diverse cellulaire processen.
- Traditionele methoden voor het bestuderen van protonentransport kennen vaak beperkingen.
- Verbeterde technieken kunnen het begrip van ionendynamiek vergroten.
- Patch clamping maakt nauwkeurige metingen van ionenstromen mogelijk.
Doel van de studie
- Het meten van protonenstromen gegenereerd door de natrium-waterstofuitwisselaar (NHE).
- Het aantonen van de effectiviteit van gecombineerde methoden bij het bestuderen van ionentransport.
- Het verkrijgen van inzicht in de elektrochemische gradiënten over celmembranen.
Gebruikte methoden
- Giant patches in combinatie met ionselectieve microelektroden.
- Whole-cell patchclamp-registratie.
- Protonselectieve microelektrode voor het meten van de protonflux.
- Oscillerende beweging van de microelektrode om spanningsverschillen te registreren.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle meting van protonenstromen nabij het celmembraan.
- Demonstratie van NHE-activiteit via geregistreerde spanningsverschillen.
- Verbeterd begrip van protongradiënten in cellulaire omgevingen.
- Validatie van de effectiviteit van de gecombineerde methode in elektrofysiologische studies.
Conclusies
- Protonselectieve elektroden en patch clamping zijn effectief voor het bestuderen van protonentransport.
- Deze methoden bieden een betere gevoeligheid en controle dan traditionele technieken.
- Verder onderzoek kan de toepassingen van deze methoden in de neurowetenschappen uitbreiden.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Leidinggevenden
Kwantitatieve meting van de activiteit van elektroneutrale transporters, zoals NHE3, is essentieel voor het verminderen van risico's bij vroege hypothesen over ionentransport en het verduidelijken van mechanistische drijvers in de membraanbiologie. De integratie van H+-selectieve elektroden met whole-cell patch clamping maakt hooggevoelige, tijdopgeloste analyse van transporterfuncties mogelijk, wat bijdraagt aan de voorspellende zekerheid bij targetvalidatie en mechanistische studies. Deze benadering pakt langdurige beperkingen in gevoeligheid en intracellulaire controle aan, wat een directe impact heeft op beslissingspunten in de ontdekkingsfase en portfoliotriage.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt directe analyse van transporterfuncties en regulatiemechanismen aan de membraaninterface mogelijk.
- Ondersteunt mechanische risicovermindering door de impact van intracellulaire modulatoren op de NHE3-activiteit te kwantificeren.
- Faciliteert functionele targetvalidatie door nauwkeurige meting van de ionenstroom als reactie op moleculaire interventies.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Biedt een gevalideerde, kwantitatieve uitlezing van de transporteractiviteit die geschikt is voor assay-standaardisatie.
- Verbetert de reproduceerbaarheid en gevoeligheid in vergelijking met traditionele radioactieve of fluorescentie-assays.
- Maakt robuuste screening mogelijk van modulatoren die de regulatie en activiteit van de transporter beïnvloeden.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Stemt metingen van de transporteractiviteit af op ziekte-relevante systemen, zoals intestinale en renale epithelia.
- Ondersteunt de ontwikkeling van translationele biomarkers door moleculaire regulatie te koppelen aan functionele read-outs.
- Faciliteert continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie van interventies gericht op transporters.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode slaat een brug tussen vroege ontdekking en preklinisch onderzoek door hypothese-gestuurde analyse van transporterfuncties en regulatoire pathways mogelijk te maken.
- Discovery Biology: Kwantificeert door transporteiwitten gemedieerde ionenflux om pathway-regulatie en biologische relevantie te verduidelijken.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve resultaten voor assay-ontwikkeling en evaluatie van verbindingen.
- Analytics: Biedt spanningsgebaseerde metingen die directe vergelijking van transporteiwitactiviteit onder variërende intracellulaire condities mogelijk maken.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt de moleculaire regulatie van transporteiwitten met functionele uitkomsten in ziekterelevante modellen.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar platform voor mechanistische studies over diverse transporteiwitfamilies en celtypen.
Operationele impact & impact op de onderneming
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen bij de validatie van transporter-doelwitten en mechanistische studies.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie, reproduceerbaarheid en sensitiviteit van assays voor ionentransportmetingen.
- Strategische waarde: Ondersteunt geïnformeerde go/no-go-beslissingen en vermindert biologische risico's in een laat stadium bij programma's die gericht zijn op transporters.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van transporter-doelwitten en regelgevende trajecten mogelijk.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in elektrofysiologie en de vervaardiging van micro-elektroden.
- Vereist gespecialiseerde instrumentatie, waaronder patchclamp-versterkers en ionselectieve elektroden.
- Noodzaak van strikte standaardisatie tussen teams voor reproduceerbare metingen.
- Aanpassing kan nodig zijn voor verschillende transporter-isovormen of cellsystemen.
- Praktische beperkingen omvatten de technische complexiteit en doorvoercapaciteit in vergelijking met high-content screening.
