Name: Toepassing van electrofysiologie meting op het bestuderen van de activiteit van Electro-neutrale Transporters (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: Leer hoe je elektrofysiologische metingen toepast om de activiteit van elektro-neutrale transporters te bestuderen met behulp van patch clamping en proton-selectieve micro-elektrodes. Deze methode biedt verbeterde gevoeligheid voor ionfluxen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs bedank Eric Fishback (Des Moines University, Des Moines, Iowa, VSA) voor zijn hulp bij het fotograferen en bewerken van de video. De PS120 fibroblast-achtige cellen stabiel uiting van NHE3-wt of NHE3-YRK werden vriendelijk geleverd door Dr. Mark Donowitz (Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD, USA).

Let op: Twee versterkers zijn verplicht voor het vastleggen van de activiteit van electroneutral vervoerders door een naar zichzelf verwijzen ISE in combinatie met klemmen, een patch klem versterker aan het handhaven van de cel in de configuratie van een geheel-cel en een hoge impendence versterker (patch elektrometer) om vast te leggen van de vervoerder activiteit via de ISE (zie tabel van materialen). De patch klem versterker is rechtstreeks verbonden aan de verwerving van bestuur terminal. De elektrometer is aangesloten op de differentiële versterker gebruikt om te filteren en het signaal versterken. De differentiële versterker is verbonden aan de verwerving van bestuur terminal. Capmeter, klem Patchsoftware die cel capaciteit, controleert in eerdere studies20 is gebruikt (zie tabel van materialen). De opname-kamer en perfusie-oplossingen worden gehandhaafd bij 37 ° C.
1. bereiding van pipetten ISEs
<ol><li>Trek de pipetten van borosilicaatglas haarvaten naar een buitendiameter van 1.2 mm (Zie Tabel van materialen) met behulp van het pipet trekker2 .</li>
	<li>Pools de Pipetteer met behulp van de microforge. De diameter van het uiteinde van de pipet moet 2-3 µm.</li>
	<li>Plaats de pipetten in een pot holder voor pipetten met het uiteinde van de pipet naar boven (Zie Tabel van materialen). Let op: Voer stappen 1.4-1.6 in een goed geventileerde chemische zuurkast.</li>
	<li>Meng het mengsel van de siliconization die uit 1 druppel (~ 150 µL bestaat) van de BIB (dimethylamino) dimethyl silane en 10 druppels van tetrachloorkoolstof (Zie Tabel van materialen).</li>
	<li>Giet het siliconization mengsel in de pot en sluit het deksel strak.</li>
	<li>Incubeer de pot met het mengsel van de siliconization voor 24-48 h in een chemische zuurkast bij kamertemperatuur totdat het mengsel is volledig verdampt.</li>
	<li>Aanvulling funderingsput de pipet met de juiste ion-selectieve hars maken een kolom met ongeveer 2-4 mm. Opmerking: Waterstof ionophore ik cocktail B waarvan opname NHE activiteit kan worden (Zie Tabel van materialen).</li>
	<li>Tik op het uiteinde van de pipet voor het distribueren van de ion-selectieve hars tot aan de vingertop en leg de pipet verticaal in de houder van de pot met het pipet topje naar beneden.</li>
	<li>Checkunder de ontleden Microscoop dat de hars cocktail heeft bereikt het einde van de tip. Indien nodig, toepassing positieve druk om te duwen de hars tot het einde.</li>
	<li>Aanvulling funderingsput de helft-pipet met de passende oplossing (~ 100 μl). Hier, gebruik 100 mM KCl en 10 mM HEPES bij pH 7.0 als ionophore ik cocktail B.</li>
	<li>De ISE verbinden met de elektrometer en plaats het uiteinde van de ISE in de bad-oplossing gebruikt voor opnemen. Nul de elektrometer.</li>
	<li>Test de H+-selectieve ISE reactie door het veranderen van de pH van de oplossing van het bad. De gemiddelde H+-selectieve ISE reactie is ~ 58 mV per pH-eenheid.</li>
	<li>Periodiek evalueren de ISE reactie op kalibratie.</li>
</ol>2. voorbereiding van de Patch-Clamp Pipettes voor opname
Opmerking: De methode beschreven door Donald Hilgemann in zijn artikel op één-kanaals opname21 wordt aanbevolen.
<ol><li>Trek de pipetten voor gigantische patch van borosilicaatglas haarvaten (2.0 mmOD / 1.5 mm ID) op de pipet trekker2,22,23.</li>
	<li>Gebruik een microforge gemonteerd op het podium van een omgekeerde Microscoop te maken een breed pipette uiteinde (10-22 μm)23. Smelt een kraal (~ 0,5 mL) van zachte glas op de dikke platina-draad van de microforge. Opmerking: Een relatief dikke platina-draad is vereist (~0.5 mm) tot het fabriceren van gigantische patch pipetten.</li>
	<li>Plaats de pipet patch dicht bij de zachte glazen kraal en volledige warmte worden toegepast totdat de tip begint te wijken. De platina-draad zal iets bewegen in de richting de centerduring Verwarming.</li>
	<li>Uitschakelen van de warmte, in en druk het uiteinde van de pipet het onthard glazen kraal. De koeling draad zal intrekken en breken van het uiteinde van de pipet.</li>
	<li>Opnieuw de hitte het pipet puntje glad te maken een pipet-tip van de gewenste diameter. De diameter van het uiteinde is afhankelijk van de grootte van de cel die moet worden versteld (8-10 μm in deze studie).</li>
</ol>3. voorbereiding van de cellen
<ol><li>Opwarmen van fosfaat buffer zoutoplossing (PBS) zonder Ca2 + en Mg2 +, trypsine-EDTA-oplossing en groeimedium aan bij 37 ° C.</li>
	<li>Wassen cellen tweemaal met PBS. 1 mL van de buffer voor 35 mm diameter cel cultuur plaat gebruiken.</li>
	<li>Voeg 0,5 mL trypsine naar de cellen voor 35 mm diameter cel cultuur plaat. Opmerking: Wanneer cellen beginnen aan ronde-up, schud de plaat als u wilt de cellen los te koppelen.</li>
	<li>Stop de trypsine actie door toevoeging van 5 mL (bedrag voor 35 mm diameter cel cultuur plaat) volledige groeimedium aangevuld met 10% foetale runderserum. Opmerking: De reactietijd in trypsine is celtype afhankelijk.</li>
	<li>Plaats de cellen op een shaker met rockende om te voorkomen dat de vorming van klonten.</li>
	<li>Cellen gebruiken voor maximaal 2 uur na trypsinebehandeling. Opmerking: De tijd kan variëren afhankelijk van de cellijn.</li>
</ol>4. voorbereiding van een Intra-pipet perfusie systeem
<ol><li>Knippen van een passende omvang van kwarts buis (150 µm OD / 75 µm ID) ter voorbereiding van de intra-pipet perfusie-lijn.</li>
	<li>Één kant van de buis kwarts invoegen in een 200 µL pipette uiteinde. Lijm de quartz-buis op de tip, en snijd het einde van het uiteinde met een scherp scheermesje.</li>
	<li>De lijn van de perfusie (kwarts buis gelijmd tot aan de vingertop) verbinden met een klein stukje silicium buis die als een reservoir voor de intra-pipet perfusie oplossing dienen zou.</li>
	<li>De Siliconen slang verbinden met een injectiespuit positieve druk maken.</li>
	<li>Invoegen het vrije uiteinde van de buis van de quartz via de polyethyleen buis van de houder van de Pipet van de perfusie port (Zie Tabel van materialen).</li>
	<li>De regel van de perfusie met de pipet-oplossing te evalueren.</li>
</ol>5. bereiding van de oplossingen
<ol><li>Bereid een zwaar gebufferde pipet-oplossing voor het opnemen van NHE (115 mM kalium aspartaat (Kawasaki Advanced Safety), 1 mM EGTA, 0.5 mM MgCl2, 10 mM Mg-ATP, 12.5 mM HEPES, 12.5 mM buizen, 12.5 mM MOPS en 12,5 mM MES, pH 6.0 aangepast met asparaginezuur). Opmerking: De voorraad Pipetteer oplossing en filter voorbereiden. Mg-ATP toevoegen voordat u gaat opnemen.</li>
	<li>Bereid de oplossing van een vers Bad telkens (140 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2en 0.1 mM Tris-HCl pH 8.2).</li>
</ol>6. opnemen van Transporter activiteit
<ol><li>Handhaven de kamer opnemen en alle oplossingen bij 37 ° C, omdat de vervoerder activiteit is afhankelijk van de temperatuur.</li>
	<li>Plaats de cellen in de zaal van de opname. Wacht totdat zij naar de bodem van de kamer dalen maar ze niet laat hechten aan de kamer.</li>
	<li>Kies een gewenste cel. Meet de diameter van de cel met de oogbeschadigingen en/of micrometer. Kies cellen met dezelfde diameter. Opmerking: In het algemeen een grote cel zal hebben meer cellulaire oppervlakte en eventueel meer vervoerders uitgedrukt op het plasmamembraan, dus ook met meer activiteit van de vervoerder. Dit is echter niet per se correct, zoals vervoerder activiteit is afhankelijk van de specifieke vervoerder en het celtype bestudeerde.</li>
	<li>De ion-selectieve micro-elektrode pipet om de micromanipulator te monteren, aanvulling funderingsput de pipet patch-klemmen met de intracellulaire oplossing, zorg ervoor dat de oplossing bereikt de punt van de pipet2. Opmerking: Het zou kunnen vereisen verschillende zachte kranen te elimineren van de bubbels in het uiteinde van de pipet.</li>
	<li>Monteer de patch-klemmen pipet naar de hoofd fase van de elektrofysiologie2,22,23instellen. Opmerking: Het is belangrijk om te houden van het hoofd stadium over een hoek van 45 graden aan de horizontale as, aangezien hierdoor een ingang hoek voor de pipet die geschikt is voor de vorming van een zeer bestendig zegel.</li>
	<li>Een kleine positieve druk uitoefenen (~ 5 cm H2O) om de patch pipet te verminderen de kans op het blokkeren van de tip en plaats deze in de oplossing van het bad.</li>
	<li>Stop de patch klem pipet verplaatsen zodra het puntje ligt van de cel.</li>
	<li>De positieve druk te verlichten, terwijl Pipetteer de cel raakt en toepassen van lichte onderdruk (~ 5 cm H2O) te verkrijgen een > 1000 MΩ (een Giga-ohm) zegel op de celmembraan met de patch Pipetteer23.</li>
	<li>Plaats de pipet patch met de cel in de dezelfde brandvlak als de ISE en verplaatsen van de Pipet van de patch met de cel in de nabijheid van de ISE (~ 5-10 µm)2,5 maar te voorkomen waardoor de cel contact opnemen met de ISE (figuur 1A).</li>
	<li>Verzekeren dat het bedrijf potentiële 0 mV.</li>
	<li>Scheuren van de zegel met reeks korte zuigpijpen de geheel-cel-configuratie te verkrijgen.</li>
	<li>Beweeg de ISE (of patch klem pipet) langzaam van links-rechts of omhoog / omlaag om de activiteiten van de vervoerder (figuur 1B) te leggen.</li>
	<li>Het opnemen van ten minste 5-8 toppen (Figuur 1 c, van A naar B).</li>
	<li>Toepassing blokgolf verstoringen tijdens de opname te waken over de kwaliteit van het zegel en de capaciteit van de celmembraan (Figuur 1).</li>
	<li>Schatten van de flux H+ (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq1.jpg">) uit het verschil in concentratie van gratis H+ tussen het celoppervlak en de bulk-oplossing (ΔH+) <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq2.jpg"> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq3v2.jpg"> Opmerking: <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq4.jpg"> en <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq5.jpg"> zijn H+ en buffer diffusie coëfficiënten respectievelijk BT is de totale buffer concentratie, KD is de dissociatieconstante van de buffer, r is de cel straal en <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq6.jpg"> bepaalt de stationaire toestand verandering in de concentratie van afhankelijke H+ voor een kleine verandering in vrije H+. H+ geeft een gratis proton in oplossing. Om ze consistent met eerdere studies, H+ poeders worden geconverteerd naar elektrofysiologische flux eenheden door het berekenen van de huidige equivalenten ten opzichte van de lichtstromen (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq1.jpg">/faraday) in pA3,,5].</li>
	<li>Normaliseren van de proton-flux aan het celoppervlak die kan worden berekend uit de grootte van de cel of de capaciteit van het membraan.</li>
</ol>

<ol><li>Rives, M. L., Javitch, J. A., Wickenden, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potentiating+SLC+transporter+activity%3A+Emerging+drug+discovery+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Potentiating SLC transporter activity: Emerging drug discovery opportunities.</a> Biochem Pharmacol. , (2017).</li>
<li>Kang, T. M., Markin, V. S., Hilgemann, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+fluxes+in+giant+excised+cardiac+membrane+patches+detected+and+quantified+with+ion-selective+microelectrodes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ion fluxes in giant excised cardiac membrane patches detected and quantified with ion-selective microelectrodes.</a> J Gen Physiol. 121 (4), 325-347 (2003).</li>
<li>Babich, V., Vadnagara, K., Di Sole, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biophysical+and+molecular+basis+of+intracellular+pH+sensing+by+Na%2B%2FH%2B+exchanger-3%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">The biophysical and molecular basis of intracellular pH sensing by Na+/H+ exchanger-3.</a> FASEB J. 27 (11), 4646-4658 (2013).</li>
<li>Fuster, D., Moe, O. W., Hilgemann, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steady-state+function+of+the+ubiquitous+mammalian+Na%2FH+exchanger+%28NHE1%29+in+relation+to+dimer+coupling+models+with+2Na%2F2H+stoichiometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Steady-state function of the ubiquitous mammalian Na/H exchanger (NHE1) in relation to dimer coupling models with 2Na/2H stoichiometry.</a> J Gen Physiol. 132 (4), 465-480 (2008).</li>
<li>Fuster, D., Moe, O. W., Hilgemann, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid-+and+mechanosensitivities+of+sodium%2Fhydrogen+exchangers+analyzed+by+electrical+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Lipid- and mechanosensitivities of sodium/hydrogen exchangers analyzed by electrical methods.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (28), 10482-10487 (2004).</li>
<li>Forster, I. C., Virkki, L., Bossi, E., Murer, H., Biber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrogenic+kinetics+of+a+mammalian+intestinal+type+IIb+Na%28%2B%29%2FP%28i%29+cotransporter%5BTitle%5D)+AND+%22J+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">Electrogenic kinetics of a mammalian intestinal type IIb Na(+)/P(i) cotransporter.</a> J Membr Biol. 212 (3), 177-190 (2006).</li>
<li>Smith, P. J., Trimarchi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+measurement+of+hydrogen+and+potassium+ion+flux+from+single+cells+and+epithelial+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Noninvasive measurement of hydrogen and potassium ion flux from single cells and epithelial structures.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 280 (1), C1-C11 (2001).</li>
<li>Parker, M. D., Musa-Aziz, R., Boron, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+extracellular%2C+ion-selective+microelectrodes+to+study+the+function+of+heterologously+expressed+transporters+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">The use of extracellular, ion-selective microelectrodes to study the function of heterologously expressed transporters in Xenopus oocytes.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 296 (5), C1243(2009).</li>
<li>Smith, P. J. S., Sanger, R. H., Messerli, M. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSmith%2C+PJS+%22Electrochemical+Methods+for+Neuroscience%22">Electrochemical Methods for Neuroscience</a>. Michael, A. C., Borland, L. M. , CRC Press/Taylor & Francis. 373-406 (2007).</li>
<li>Orlowski, J., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+the+mammalian+sodium%2Fproton+exchanger+SLC9+gene+family%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Diversity of the mammalian sodium/proton exchanger SLC9 gene family.</a> Pflugers Arch. 447 (5), 549-565 (2004).</li>
<li>Brett, C. L., Donowitz, M., Rao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+origins+of+eukaryotic+sodium%2Fproton+exchangers%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Evolutionary origins of eukaryotic sodium/proton exchangers.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 288 (2), C223-C239 (2005).</li>
<li>Bobulescu, I. A., Di Sole, F., Moe, O. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%2B%2FH%2B+exchangers%3A+physiology+and+link+to+hypertension+and+organ+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Nephrol+Hypertens%22%5BJournal%5D)">Na+/H+ exchangers: physiology and link to hypertension and organ ischemia.</a> Curr Opin Nephrol Hypertens. 14 (5), 485-494 (2005).</li>
<li>Donowitz, M., Ming Tse, C., Fuster, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLC9%2FNHE+gene+family%2C+a+plasma+membrane+and+organellar+family+of+Na%28%2B%29%2FH%28%2B%29+exchangers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Aspects+Med%22%5BJournal%5D)">SLC9/NHE gene family, a plasma membrane and organellar family of Na(+)/H(+) exchangers.</a> Mol Aspects Med. 34 (2-3), 236-251 (2013).</li>
<li>Zachos, N. C., Tse, M., Donowitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+physiology+of+intestinal+Na%2B%2FH%2B+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Molecular physiology of intestinal Na+/H+ exchange.</a> Annu Rev Physiol. 67, 411-443 (2005).</li>
<li>Girardi, A. C., Di Sole, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+mechanisms+of+the+Na%2B%2FH%2B+exchanger-3+regulation+in+organ+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Deciphering the mechanisms of the Na+/H+ exchanger-3 regulation in organ dysfunction.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 302 (11), C1569-C1587 (2012).</li>
<li>Bobulescu, I. A., Moe, O. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%2B%2FH%2B+exchangers+in+renal+regulation+of+acid-base+balance%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Na+/H+ exchangers in renal regulation of acid-base balance.</a> Semin Nephrol. 26 (5), 334-344 (2006).</li>
<li>Hilgemann, D. W., Feng, S., Nasuhoglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complex+and+intriguing+lives+of+PIP2+with+ion+channels+and+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+STKE%22%5BJournal%5D)">The complex and intriguing lives of PIP2 with ion channels and transporters.</a> Sci STKE. (111), re19(2001).</li>
<li>Mohan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NHE3+activity+is+dependent+on+direct+phosphoinositide+binding+at+the+N+terminus+of+its+intracellular+cytosolic+region%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">NHE3 activity is dependent on direct phosphoinositide binding at the N terminus of its intracellular cytosolic region.</a> J Biol Chem. 285 (45), 34566-34578 (2010).</li>
<li>Alexander, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+surface+charge+dictates+the+structure+and+function+of+the+epithelial+Na%2B%2FH%2B+exchanger%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Membrane surface charge dictates the structure and function of the epithelial Na+/H+ exchanger.</a> EMBO J. 30 (4), 679-691 (2011).</li>
<li>Wang, T. M., Hilgemann, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca-dependent+nonsecretory+vesicle+fusion+in+a+secretory+cell%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ca-dependent nonsecretory vesicle fusion in a secretory cell.</a> J Gen Physiol. 132 (1), 51-65 (2008).</li>
<li>Hilgemann, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHilgemann%2C+DW+%22Single-Channel+Recording%22">Single-Channel Recording</a>. Sakmann, B., Neher, E. , Plenum Press. 307-328 (1995).</li>
<li>Hilgemann, D. W., Lu, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+membrane+patches%3A+improvements+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Giant membrane patches: improvements and applications.</a> Methods Enzymol. 293, 267-280 (1998).</li>
<li>Matsuoka, S., Takeuchi, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMatsuoka%2C+S+%22Patch+Clamp+Techniques%22">Patch Clamp Techniques</a>. Okada, Y. , Springer. 207-218 (2012).</li>
<li>Pouyssegur, J., Sardet, C., Franchi, A., L'Allemain, G., Paris, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+specific+mutation+abolishing+Na%2B%2FH%2B+antiport+activity+in+hamster+fibroblasts+precludes+growth+at+neutral+and+acidic+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A specific mutation abolishing Na+/H+ antiport activity in hamster fibroblasts precludes growth at neutral and acidic pH.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (15), 4833-4837 (1984).</li>
<li>Ogden, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVoipio%2C+J+%22Microelectrode+Techniques+-+The+Plymouth+Workshop+Handbook%22">Microelectrode Techniques - The Plymouth Workshop Handbook</a>. , The Company of Biologists Ltd. 275-316 (1994).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen conflicten van belang om te vermelden.

Ondanks de cruciale functies van vervoerders zijn de methoden beschikbaar voor het bestuderen van hun activiteit inefficiënt en ontoereikend. Een beperking is dat de beschikbare methoden ion verkeer gemedieerd door vervoerder activiteit zonder rekening van schommelingen in de samenstelling van het intracellulair ion tijdens het experiment4te meten. De onderhavige methode zorgt voor nauwkeurige controle van extracellulaire en intracellulaire ion composities en biedt een krachtig hulpmiddel voor het...

Transport van ionen en opgeloste stoffen over het plasma-membraan is essentieel voor de overleving van de cellen en dus van organismen1. Selectieve transport van ionen en opgeloste stoffen wordt bereikt door een scala aan gespecialiseerde kanaal en vervoerder eiwitten. Mutaties in deze eiwitten vaak resulteren in een verscheidenheid van klinische omstandigheden, waardoor kanaal en vervoerder eiwitten doelwit voor farmacologische behandeling1. Inzicht in de mechanismen die ten grondslag liggen aan kanaal en vervoerder functie en verordening wordt echter vaak beperkt door de benaderingen ter studie van hun activiteit2,3,4.
Specifiek, vervoerders kunnen worden grofweg onderverdeeld in twee grote groepen afhankelijk van of ze de transmembrane potentieel van cel tijdens het transport van opgeloste stoffen wijzigen: de veranderen electrogenic ion vervoerders [bv -natriumfosfaat Co vervoerder 2a (NaPi2a), natrium-calcium exchanger (NCX), enz.] of de transporteurs electroneutral-ion niet-wijzigen [bijvoorbeeld natrium-proton exchanger (NHE), natriumchloride co vervoerder, NaPi2c, enz.]. De activiteiten van beide klassen van transporteurs zijn bestudeerd uitgebreid met opname van radioactieve isotopen en membraan-permeant fluorescerende kleurstoffen2. Beide benaderingen schatten de activiteit van transporteurs door het meten van veranderingen in de concentratie van de bulk van specifieke cytoplasmatische ionen, en beide methoden hebben beperkingen, zoals matige gevoeligheid en de resolutie van de tijd en onvoldoende controle van de intracellulaire milieu. Inderdaad, de activiteit van veel vervoerders is afhankelijk van de cytoplasmatische concentratie van de uitgevoerd ionen (bijvoorbeeld NHE3, NCX), en veranderingen in deze ion concentraties worden verwacht om te spelen een belangrijke rol bij het reguleren van de vervoerder activiteit2 , 3 , 5. nauwkeurige meting van deze regulerende mechanismen is beperkt met behulp van de klassieke methoden.
Deze beperkingen wilt opheffen, worden patch klem methoden gebruikt voor het bestuderen van de vervoerder activiteit2,6. In het bijzonder hebben de naar zichzelf verwijzen ion-Ionselectieve electroden (ISEs)7,8 in combinatie met de patch klemmen systeem onlangs de meting van electroneutral transporter activiteit3,4 , 5. ISEs zijn gebaseerd op het feit dat de vervoerder activiteit maakt een ion-verloop in de nabijheid van de celmembraan. Een ISE omhoog te bewegen en buiten de celmembraan in een repetitieve, registreert oscillerende mode een spanningsverschil (µV). Ion flux waarden met behulp van een kalibratie-methode die van toepassing de eerste wet van Fick van diffusie2,9 iskunnen verschillen van de spanning worden omgezet. Terwijl ISEs worden gebruikt om te ontdekken de flux van ionen verplaatsen van cellen, de patch klem methode in beide geheel-cel of binnenstebuiten configuraties wordt gebruikt voor het bepalen van de samenstelling van de potentiële en intracellulaire ion membraan. Bovendien kan de toepassing van de gigantische patch-clamp techniek wijziging van de intracellulaire samenstelling van niet alleen de ionen, maar ook lipiden en eiwitten3,5.
Kortom vergeleken de veelzijdigheid van de patch klem methode met dat van andere methoden om te studeren vervoerder activiteit patch klemmen geschikt geboekt voor het overwinnen van de gemeenschappelijke beperkingen van deze andere methoden. De combinatie van zichzelf verwijzende ISEs en patch-clamp technieken biedt de unieke mogelijkheid om het meten van de activiteit van electroneutral vervoerders in een strak gecontroleerde experimentele omgeving en te ontdekken roman biofysische en moleculaire eigenschappen van de celmembraan vervoer3,4,5. Deze aanpak is met succes gebruikt voor het bestuderen van de activiteit van de NHE. De zoogdieren NHE eiwit familie katalyseert de uitwisseling electroneutral netto van extracellulaire natrium (Na+) voor de intracellulaire proton (H+)10,11 met behulp van een innerlijke nb+ verloop. Bij zoogdieren bevat de NHE eiwit familie 11 verwante proteïnen (NHE1-9 en NHA1-2) en een sperma-specifieke NHE10,12,13.
NHEs (familie SLC9a) zijn overal te vinden in de meeste levende organismen van eenvoudige prokaryoten aan hogere eukaryoten en zijn betrokken bij een scala aan vitale cel functies10,11, met inbegrip van controle op de cel zoutgehalte verdediging in prokaryoten, zuur-base homeostase en cel volume onderhouden en reguleren van de absorptie van zout en water in verschillende gespecialiseerde epithelen10,12,14,15. De belangrijkste biologische rol van NHEs en de betekenis van hun functies zijn vastgesteld door middel van verschillende studies; echter hebben weinig studies onderzocht de biofysische en moleculaire eigenschappen van zoogdieren afkomstig NHEs vanwege de methodologische beperkingen4. Onlangs, de toepassing van zichzelf verwijzende ISEs tijdens het geheel-cel patch klemmen heeft geopenbaard nieuwe moleculaire mechanismen van NHE isoforms geregeld door veranderingen in de intracellulaire concentraties van ionen, eiwitten en fosfolipiden3, 4.
Met name het protocol waarin dit manuscript schetst de methodes en benaderingen voor de studie van de activiteit en regulering van NHE isovorm 3 (NHE3), een belangrijke speler in de absorptie van nb+, Cl-, HCO3- en vloeistof in de borstel grens membraan van nier- en intestinale epithelen14,16. Nieuw inzicht in de verschillen in de gevoeligheid van NHE3 activiteit aan intracellulaire phosphoinositides (phosphatidylinositide 4,5-difosfaat [PI (4,5) P2] en phosphatidylinositide 3,4,5-trifosfaat [PI(3,4,5]P3]) is gemeld. Cel vervoer eiwitten, zoals kanalen en vervoerders, worden geregeld door phosphoinositides17en NHE3 direct bindt zowel PI (4,5) P2 en P3 PI (3,4,5)18. Op basis van de huidige literatuur, ofwel phosphoinositide zou relevant kunnen zijn voor de fysiologische of pathofysiologische regulering van NHE35,18,19. Onze bevindingen ondersteunen aparte rollen voor PI (4,5) P2 en P3 van de PI (3,4,5) in de regulatie van NHE3 activiteit. Dit onderscheid werd mogelijk door de toepassing van ISE technieken in combinatie met geheel-cel patch klem opname. Deze techniek biedt ook controle over de inhoud phosphoinositide cellulaire via de intracellulaire perfusie van verschillende phosphoinositides tijdens de meting van NHE3 activiteit.

<table><tbody><tr><td>Patch clamp versterker</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dual Channel Differentieel Electrometer (HiZ-223)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-1650</td><td></td></tr><tr><td>Differentiële versterker (DP-301)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0044</td><td></td></tr><tr><td>Patch Clamp Software gebaseerd op MatLab</td><td>MatLab met acquisitie toolbox</td><td></td><td>De capmeter software wordt aanbevolen</td></tr><tr><td>ThermoClamp-1 Temperatuurregelsysteem</td><td>&nbsp;AutoMate Scientific</td><td>03-11-LL</td><td>Inline verwarming</td></tr><tr><td>Single-Channel Temperatuurregelaar (TC-324C)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-2400</td><td></td></tr><tr><td>Single-Barrel Standaard Borosilicaat Glasbuis</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B120F-3&nbsp;&nbsp;</td><td>Gebaten voor ion selectieve elektroden</td></tr><tr><td>Micropipet Opslagpot</td><td>World Precision Instruments</td><td>E212</td><td></td></tr><tr><td>Bis(dimethylamino)dimethylsilaan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14755-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Koolstoftetrachloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>319961-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Waterstof ionofoor I - cocktail B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>95293</td><td></td></tr><tr><td>Dunwand Borosilicaatbuis</td><td>&nbsp;Sutter Instrument</td><td>B200-156-15</td><td>Gebaten voor patch clamp pijpje&nbsp;</td></tr><tr><td>Zacht glas (Corning 8161 Patch Glas)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0815</td><td></td></tr><tr><td>Silica Capillaire buis (150um OD/75um ID)</td><td>Molex (Polymicro Technologies)</td><td>106815-0018</td><td>Gebaten voor intra-pijpje perfusie systeem</td></tr><tr><td>Kaliumchloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Kalium aspartaat&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6558</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4880</td><td></td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Zoutzuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>Apyrase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6535</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatidylinositol(4,5) bisfosfaat diC8</td><td>Echelon Biosciences</td><td>P-4508</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatidylinositol 3,4,5-trisfosfaat diC8</td><td>Echelon Biosciences</td><td>P-3908</td><td></td></tr></tbody></table>

toepassing van electrofysiologie meting op het bestuderen van de activiteit van electro-neutrale transporters

Application of Electrophysiology Measurement to Study the Activity of Electro-Neutral Transporters

Het transport van ionen via celmembranen zorgt voor het fijne controle van ion inhoud binnen en buiten de cel die onontbeerlijk is voor de overleving van de cel. Deze vervoer mechanismen zijn gemedieerd door de activiteiten van gespecialiseerde vervoerder eiwitten. Specifiek, pH dynamics fijn worden gecontroleerd door plasmamembraan proton (H+) extrusie systemen, zoals de nb+/H+ warmtewisselaar (NHE) eiwit familie. Ondanks uitgebreide inspanningen om te bestuderen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de verordening NHE, is ons huidige begrip van de biofysische en moleculaire eigenschappen van de familie NHE ontoereikend vanwege de beperkte beschikbaarheid van methoden om te meten effectief NHE activiteit . In dit manuscript, gebruikten we H+-Ionselectieve electroden tijdens geheel-cel patch klemmen opname voor het meten van NHE-geïnduceerde H+ flux. Wij hebben voorgesteld deze aanpak te overwinnen sommige beperkingen van meestal gebruikte methoden voor het meten van NHE activiteit, zoals opname van radioactieve en fluorescerende membraan permeants. Meten van NHE activiteiten met behulp van de beschreven methode maakt hoge gevoeligheid en tijd resolutie en een efficiëntere controle op intracellulaire concentraties van de H+ . H+-Ionselectieve electroden zijn gebaseerd op het feit dat de vervoerder activiteit maakt een ion-verloop in de nabijheid van de celmembraan. Een H+-selectieve elektrode tot verplaatsen en weg van het celmembraan in een repetitieve, oscillerende manier registreert een spanningsverschil die is afhankelijk van H+ flux. Terwijl H+-Ionselectieve electroden worden gebruikt voor het detecteren van H+ flux verhuizen van de cel, de patch klem methode in het geheel-cel-configuratie moet worden gebruikt voor de samenstelling van het intracellulair ion. Toepassing van de reus patch-clamp techniek staat bovendien, wijziging van de intracellulaire samenstelling van niet alleen de ionen, maar ook de lipiden. De activiteit van de vervoerder van NHE isovorm 3 (NHE3) werd gemeten met behulp van deze technische aanpak te bestuderen van de moleculaire basis van de verordening van de NHE3 door phosphoinositides.

Een naar zichzelf verwijzen ISE tijdens geheel-cel patch klem opname werd toegepast om te bestuderen van de regulering van de activiteit van de NHE3 door phosphoinositides. PS120 cellen van de fibroblast-achtige24, die de uitdrukking van endogene plasmamembraan NHEs, werden gebruikt. NHE3 wild-type (NHE3-wt) of NHE3 mutanten die geen binding phosphoinositides [tyrosine 501, 503 arginine en lysine 505 werden vervangen door alanine, Y501A/R503A/K505A (NHE3-YRK)] stab...

Dit manuscript beschrijft de toepassingen van proton-Ionselectieve electroden en patch klemmen van methoden voor het meten van de activiteit van proton vervoerssystemen. Deze methoden zijn sommige beperkingen van technieken gebruikt bij het bestuderen van proton vervoersactiviteit, zoals matige gevoeligheid, resolutie van de tijd en onvoldoende intracellulaire milieu controle.

Toepassing van electrofysiologie meting op het bestuderen van de activiteit van Electro-neutrale Transporters

The transport of ions through cell membranes ensures the fine control of ion content within and outside the cell that is indispensable for cell survival. ...

De methode van reusachtige patches in combinatie met ion-selectieve microelektroden is een veelzijdige methode die wordt gebruikt om ionenfluxen te detecteren en te kwantificeren. Specifiek wordt het gebruikt om de protonfluxen te meten die worden gegenereerd door de activiteit van de elektro-neutrale ionentransporter, de natrium-waterstofwisselaar of NHE, die wordt uitgedrukt op het celmembraan. De natrium-waterstofwisselaar genereert een gradiënt van protonen in de nabijheid van het plasmamembraan, hier aangegeven als een oranje ring.Deze gradiënt van protonen over het celmembraan wordt gemeten door whole cell patch clamp-opname in combinatie met een techniek die een proton-selectieve microelektrode gebruikt. De proton-selectieve microelektrode wordt dicht bij het celoppervlak bewogen, waar het de flux van protonen meet die uit de cellen stromen, hier weergegeven in positie A. En weg van het celoppervlak, waar het de vrije protonconcentratie meet die aanwezig is in de oplossing, aangegeven door positie B. En dan, terug naar positie A, dicht bij het celmembraan, in een herhaalde, oscillerende beweging. Het spanningsverschil van A naar B wordt geregistreerd en is afhankelijk van de

application-electrophysiology-measurement-to-study-activity-electro

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Er zijn technische obstakels voor het meten van de huidige flux via meerdere ion kanalen tegelijk, en later onderscheiden welk deel van de transmembraan huidige is te wijten aan elk kanaal type. Om aan deze behoefte, deze methode biedt een manier om de IV curve van een kanaal typen met behulp van specifieke frequentie componenten te genereren.

Recapitulatie van een Ion Channel IV curve met behulp van frequentie-componenten

We beschrijven een methode om de activiteit van K+-countertransporterende P-type ATPasen te kwantificeren door heterologe expressie van de enzymen in Xenopus oöcyten en het meten van Rb+ of Li+ opname in individuele cellen door middel van atomaire absorptie spectrofotometrie. De methode is een gevoelige en veilige alternatief voor radio-isotoop flux experimenten waardoor complexe kinetische studies worden vergemakkelijkt.

Meten kationtransport van Na, K en H, K-ATPase in<em&gt; Xenopus</em&gt; Eicellen door atomaire absorptiespectrometrie: Een alternatief voor Radio-isotopen Assays

Hier presenteren we een elektrofysiologische methode gebaseerd op vaste drager membranen met de nadruk op de toepassing daarvan voor de karakterisering van elektrogene membraan transporters.

Inleiding tot de vaste Ondersteunde Membrane Gebaseerd Electrofysiologie

Gesloten-lus protocollen worden steeds gebruikelijker in de moderne elektrofysiologie. We presenteren een eenvoudige, veelzijdige en goedkope manier om complexe elektrofysiologische protocollen uit te voeren in corticale piramidale neuronen in vitro, met behulp van een desktopcomputer en een digitale acquisitiekaart.

Real-time Electrofysiologie: Met behulp van Closed-loop protocollen bij Probe Neuronale Dynamics and Beyond

Het eerste deel van dit artikel laat zien hoe mutante cellijnen te selecteren zijn die vesiculaire Na+/H+ uitwisselaars in hun plasmamembraan tot expressie brengen. Het tweede deel biedt protocollen gebaseerd op intracellulaire pH-metingen en snelle ionopname, die worden gebruikt om de ionselectiviteit en de kinetische parameters van deze uitwisselaars te bepalen.

Functionele karakterisatie van Na<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup&gt; Warmtewisselaars van intracellulaire compartimenten met Proton-doden Selectie om ze te uiten op het plasmamembraan

Transporters in celmembranen maken differentiële segregatie van ionen over celmembranen of cellagen mogelijk en spelen een cruciale rol tijdens weefselfysiologie, herstel en pathologie. We beschrijven de ion-selectieve zelfrefererende micro-elektrode die de meting van specifieke ionfluxen bij enkele cellen en weefsels in vivo mogelijk maakt.

Meting van de extracellulaire Ion Flux gebruik van de Ion-selectieve Zelf referencing micro-elektrode Techniek

We demonstreren de fabricage, kalibratie en eigenschappen van twee soorten ionen-selectieve micro-elektroden (dubbel-gerand en concentrisch) voor het meten van ionenconcentraties in hersenweefsel. Deze worden vervolgens gebruikt in de muis hippocampale plak voorbereiding om te laten zien dat exciterende activiteit zowel extracellulaire kalium- als natriumconcentraties verandert.

Dubbelloops en concentrische micro-elektroden voor het meten van extracellulaire Ion Signalen in hersenweefsel

In elektrofysiologische metingen stoort de aanwezigheid van een potentiële verspreiding de nauwkeurige meting van het omgekeerde potentieel door een wijziging van de potentiële elektrode. Met behulp van een micro-agar zoutbrug, is de impact van de potentiële verspreiding geminimaliseerd, waardoor een nauwkeuriger meting van substraat omzet aantallen gereconstitueerde recombinante membraaneiwitten.

Een Micro-agar zout Bridge-elektrode voor het analyseren van de Proton Verwerkingsfrequentie van recombinante membraaneiwitten

Nanobodies zijn belangrijke hulpmiddelen in de structurele biologie en vormen een groot potentieel voor de ontwikkeling van therapieën. De selectie van nanobodies met remmende eigenschappen kan echter een uitdaging zijn. Hier demonstreren we het gebruik van solid-supported-membrane (SSM)-gebaseerde elektrofysiologie voor de classificatie van remmende en niet-remmende nanobodies gericht op elektrogene membraantransporters.

Selectie van transporter-gerichte remmende nanobodies door solid-supported-membrane (SSM)-gebaseerde elektrofysiologie

Het huidige protocol benadrukt de toepassing van western blotting-techniek om de functies en activiteiten van neuronale K-Cl co-transporter KCC2 te bestuderen. Het protocol beschrijft het onderzoek naar KCC2-fosforylering op kinaseregelplaatsen Thr906/1007 via western blotting. Ook aanvullende methoden om KCC2-activiteit te bevestigen worden kort gemarkeerd in deze tekst.

Studie van de functies en activiteiten van Neuronale K-Cl Co-Transporter KCC2 met behulp van Western Blotting

Voor het bestuderen van reacties van exciteerbare cellen in vitro, beschrijft het protocol optische monitoring van veranderingen in het genereren van actiepotentiaal als gevolg van elektroporatie op een eenvoudig exciteerbaar celmodel van genetisch gemanipuleerde tet-on spiking HEK-cellen, evenals veranderingen in transmembraanspanning met geautomatiseerde extractie van relevante parameters.

Monitoring van door elektroporatie geïnduceerde veranderingen in het genereren van actiepotentieel in genetisch gemanipuleerde Tet-On Spiking HEK-cellen

Leer hoe je elektrofysiologische metingen toepast om de activiteit van elektro-neutrale transporters te bestuderen met behulp van patch clamping en proton-selectieve micro-elektrodes. Deze methode biedt verbeterde gevoeligheid voor ionfluxen.

Toepassing van electrofysiologie meting op het bestuderen van de activiteit van Electro-neutrale Transporters

Meer video's verkennen