Name: Luciferase complementatie Imaging Assay in Nicotiana benthamiana bladeren voor Transient bepalen eiwit-eiwit interactie Dynamics (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Leer luciferase-complementatie-imaging om eiwit-eiwitinteracties kwantitatief te detecteren in Nicotiana benthamiana bladeren. Deze methode biedt snelle, nauwkeurige resultaten voor signaaltransductieonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door de Natural Science Foundation van de oostelijke provincie Jiangsu (BK20140919), de nationale Natural Science Foundation van China (31470375), de prioriteit academische programma ontwikkeling van Jiangsu instellingen voor hogeronderwijs en de Qing Lan Project.

1. bereiding van planten (8 weken)
<ol><li>Zet 50 Nicotiana benthamiana zaden in een 1,5 mL microcentrifuge buis met 1 mL 5% NaClO en 0,1% Triton X-100 (V/V) oplossing en laat gedurende 5 minuten om de zaden te steriliseren.</li>
	<li>Spoel de zaden met steriel water 5 keer en schorten zaden in 200 µL van steriel water.</li>
	<li>Zorgvuldig plaats individuele zaden over het oppervlak van de MS-agar medium (1 L: 1 x Murashige & Skoog zouten, 10 g sacharose, pH 5,8 (KOH), 1% agar) met fijne tips en winkel middellange platen in 4 ° C voor 3 dagen om te synchroniseren van kiemkracht. Opmerking: Microbe om besmetting te voorkomen, deze stap uitvoeren op een schone bankje. Het is niet nodig om te schudden van de buis tijdens sterilisatie.</li>
	<li>Plaats van middellange platen onder normale groei omstandigheden (22 ° C, 80-90-µmolm-2s-1 witte lichtintensiteit) voor 10 dagen en breng de ontkiemde zaailingen in de bodem. Opmerking: Zorg ervoor dat het insluiten van zaailing wortels in de bodem en doen geen schade toebrengen aan de wortels. Bedek het dienblad met een transparante plastic cover's nachts om vochtigheid.</li>
	<li>Planten groeien in een beheerste groei kamer op een 16/8 uur licht/donker cyclus en 70% vochtigheid. 7-week-oude N. benthamiana planten zijn klaar voor Agrobacteriumtumefaciens infiltratie(Figuur 1). Opmerking: Water planten en plagen controle desgewenst planten om gezond te houden.</li>
</ol>2. Pre-steady expressie in N. Benthamiana bladeren (7-10 dagen)
<ol><li>Leveren 150 ng van plasmiden, (pEGAD-HA-LUC controle plasmide, lege vector en geconstrueerd plasmide voor LCI assay, in dit geval we gebruikten pCAMBIA1300-Nluc en pCAMBIA1300-Cluc voor plasmide bouw) in A. tumefaciens bevoegde cel van de stam GV3101 met een standaard electroporation methode.</li>
	<li>Cultuur A. tumefaciens Luria Bertani (LB) agar medium (1 L: 10 g NaCl, gistextract 5 g, 10 g trypton, 1,5% agar) met 50 µg/mL kanamycine en 50 µg/mL rifampicine bij 28 ° C gedurende 4 dagen. Opmerking: De keuze van de antibiotica hangt de vector en de stam van de A. tumefaciens gebruikt.</li>
	<li>Inoculeer een single A. tumefaciens kolonie van elke plaat in 3 mL vloeibare voedingsbodem LB met 50 µg/mL kanamycine en 50 µg/mL rifampicine en schudden bij 220 rpm bij 28 ° C gedurende 24 uur doorgeven van cultuur van de cel.</li>
	<li>Pipetteer 75 µL van de bacteriecultuur in 15 mL verse LB opgietvloeistof met 50 µg/mL kanamycine en 50 µg/mL rifampicine, verdunnen het met een factor 200. Cultuur de bacteriën bij 220 t/min bij 30 ° C gedurende ongeveer 8 h, totdat OD600 tussen 0.5 tot 1.0 is.</li>
	<li>Breng de vloeibare cultuur van A. tumefaciens in 15 mL centrifuge buizen en centrifugeer bij 4000 x g en 4 ° C gedurende 15 min. negeren het supernatant en Suspendeer de pellet in 15 mL transformatie oplossing te wassen pellet.</li>
	<li>Draai de buis bij 4000 x g en 4 ° C gedurende 15 minuten en verwijder het supernatant. De wassen stap nogmaals.</li>
	<li>Resuspendeer de pellet in 5 mL van de oplossing van de transformatie en houd gedurende 2 uur bij kamertemperatuur. Pas de dichtheid van A. tumefaciens pellet cellen met transformatie oplossing totdat de uiteindelijke concentratie van OD600 0,5 of mix twee steekproeven met gelijke volume voor testen gepaarde eiwitinteractie is.</li>
	<li>Zwevende cellen infiltreren in de 4th naar 7th bladeren met een naaldloze spuit van 1 mL (Figuur 1-B-C). Na de infiltratie, planten onmiddellijk te bedekken met een zwarte plastic cover en plaats de lade in duisternis voor 12u. Daarna groeien planten zoals gebruikelijk voor 2 tot 4 dagen voor het opsporen van LUC activiteiten. Opmerking: Kies gezonde bladeren van vergelijkbare grootte. De infiltratie van vier verschillende zones in één blad is prima.</li>
</ol>3. opsporen van Luciferase activiteit (één dag)
Opmerking: Er zijn twee manieren om luciferase activiteit te controleren. Een op imaging is gebaseerd, en de andere is voor het kwantitatief meten van luciferase activiteit.
<ol><li>
Imaging-methode
	<ol>
<li>Loskoppelen van een geïnfiltreerde blad en zet de hele bijsluiter op de drager van de MS-agar.</li>
		<li>Spray luciferine werkende buffer op het blad adaxial oppervlak met een 50 mL spray fles. Houd de materialen in het donker voor 5 min om quench de chlorofyl auto-fluorescentie.</li>
		<li>Gebruik een weinig licht gekoelde CCD imaging apparatuur (gekoeld tot-30 ° C) om te fotograferen (Figuur 2). De licht-geplaatst belichtingstijd is 50 ms en luminescentie detectie tijd is 1 min. Opmerking: Pas de parameters volgens de handleiding van de machine. Lagere temperaturen zullen de signaal-ruisverhouding om beeldkwaliteit te verbeteren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>U kunt ook meten luminescentie rechtstreeks met een commerciële luminometer.<ol>
<li>Zorgvuldig uitgesneden blad fragmenten (ongeveer 0,25 cm2) uit de infiltratie oppervlakte van de N. benthamiana bladeren en de schijf blad onderdompelen in 100 ÂµL van gedeïoniseerd water in een witte 96-wells-plaat (Figuur 3).</li>
		<li>Voeg 10 µL van luciferine werkende buffer en laat gedurende 5 minuten. Voer specifieke behandelingen om te bestuderen van de dynamiek van de interactie eiwit. Opmerking: Detecteren de luminescentie met een luminometer op verschillende tijdstippen te verkrijgen van de dynamiek van luciferase activiteit, die de kinetiek van eiwit-eiwitinteractie onder bepaalde behandeling hebben ondergaan vertegenwoordigen. Deze methode heeft voordelen voor het testen van een groot aantal eiwit paren tegelijk. Voor mensen zonder een commerciële luminometer, onderzoeken de luciferase eiwit abundanties door westelijke vlek, daarom verwijzen naar de LUC activiteit quantitively. Als licht niet noodzakelijkerwijs vereist is, net houden van de plaat in de luminometer en meten van luminescentie op verschillende tijdstippen. Overigens, zet de plaat in een kamer van de groei tijdens de detectie-kloof. Gebruik voor het verkrijgen van statistisch significante resultaten, ten minste drie replicaat-biologische organismen. Hoewel LUC activiteiten uit verschillende infiltratie zones variëren zal, stroken hun veranderende patronen na normalisatie.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Thines, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JAZ+repressor+proteins+are+targets+of+the+SCF%28COI1%29+complex+during+jasmonate+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">JAZ repressor proteins are targets of the SCF(COI1) complex during jasmonate signalling.</a> Nature. 448, 661-665 (2007).</li>
<li>Chini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+JAZ+family+of+repressors+is+the+missing+link+in+jasmonate+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The JAZ family of repressors is the missing link in jasmonate signalling.</a> Nature. 448, 666-671 (2007).</li>
<li>Jones, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Border+control--a+membrane-linked+interactome+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Border control--a membrane-linked interactome of Arabidopsis.</a> Science. 344, 711-716 (2014).</li>
<li>Arabidopsis Interactome Mapping Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+network+evolution+in+an+Arabidopsis+interactome+map%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Evidence for network evolution in an Arabidopsis interactome map.</a> Science. 333, 601-607 (2011).</li>
<li>Yazaki, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+transcription+factor+interactome+networks+using+HaloTag+protein+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mapping transcription factor interactome networks using HaloTag protein arrays.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 4238-4247 (2016).</li>
<li>Kenworthy, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+protein-protein+interactions+using+fluorescence+resonance+energy+transfer+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging protein-protein interactions using fluorescence resonance energy transfer microscopy.</a> Methods. 24, 289-296 (2001).</li>
<li>Walter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+protein+interactions+in+living+plant+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Plant J. 40, 428-438 (2004).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Firefly+luciferase+complementation+imaging+assay+for+protein-protein+interactions+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Firefly luciferase complementation imaging assay for protein-protein interactions in plants.</a> Plant Physiol. 146, 368-376 (2008).</li>
<li>Layton, C. J., Hellinga, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+protein-protein+interactions+by+thermal+stability+shift+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Quantitation of protein-protein interactions by thermal stability shift analysis.</a> Protein Sci. 20, 1439-1450 (2011).</li>
<li>Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliable+determination+of+binding+affinity+and+kinetics+using+surface+plasmon+resonance+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Reliable determination of binding affinity and kinetics using surface plasmon resonance biosensors.</a> Curr Opin Biotechnol. 8, 498-502 (1997).</li>
<li>Huang, X., Ouyang, X., Deng, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+repression+of+photomorphogenesis%3A+role+switching+of+COP%2FDET%2FFUS+in+light+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+plant+biology%22%5BJournal%5D)">Beyond repression of photomorphogenesis: role switching of COP/DET/FUS in light signaling.</a> Current opinion in plant biology. 21, 96-103 (2014).</li>
<li>Liu, B., Zuo, Z., Liu, H., Liu, X., Lin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+cryptochrome+1+interacts+with+SPA1+to+suppress+COP1+activity+in+response+to+blue+light%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis cryptochrome 1 interacts with SPA1 to suppress COP1 activity in response to blue light.</a> Genes Dev. 25, 1029-1034 (2011).</li>
<li>Lian, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue-light-dependent+interaction+of+cryptochrome+1+with+SPA1+defines+a+dynamic+signaling+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Blue-light-dependent interaction of cryptochrome 1 with SPA1 defines a dynamic signaling mechanism.</a> Genes Dev. 25, 1023-1028 (2011).</li>
<li>Zuo, Z., Liu, H., Liu, B., Liu, X., Lin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+light-dependent+interaction+of+CRY2+with+SPA1+regulates+COP1+activity+and+floral+initiation+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Blue light-dependent interaction of CRY2 with SPA1 regulates COP1 activity and floral initiation in Arabidopsis.</a> Curr Biol. 21, 841-847 (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het protocol hier beschreven is eenvoudig en reproduceerbare voor het bestuderen van in vivo eiwit-eiwitinteractie en bijzonder geschikt voor het opsporen van eiwit interactie dynamiek onder exogene behandeling. De belangrijkste stap in deze test is N. benthamiana infiltratie. Infiltratie om succes te verzekeren, moet de planten zeer gezond. Een andere belangrijke factor is wanneer luciferase activiteit controleren na infiltratie. Er is geen juiste antwoord voor deze vraag. Onderzoekers worden aangemoed...

Oog op de coördinatie van groei met zijn omgeving, planten geëvolueerd tot elegante signaalroutes om te voelen, transduce en te reageren op signalen van de signalering. Zoals de lopers in een estafette zijn eiwitten nodig spelers in signaaltransductie van planten. Het is algemeen erkend dat eiwit-eiwit interactie (PPI) een belangrijke rol voor mobiele communicatie speelt. Proteïne fosforylatie, acetylation en afbraak zijn allemaal afhankelijk van de fysieke interactie tussen een doel-eiwit en haar wijzigen enzymen. Bijvoorbeeld, Jasmonate ZIM-domein eiwit (JAZ) familie eiwitten interactie met transcriptiefactor MYC2 en onderdrukken zijn transcriptionele activiteit1,2. Gezien het belang van PPI onderzocht grootschalige eiwit interactomes in fabrieken geweest onlangs3,4,5. Deze interactome resultaten verder onthullen de complexe regelgeving netwerk dat coördineert voor diverse cellulaire functies.
Er zijn enkele gevestigde benaderingen voor de controle van de PPI. De bepaling van gist twee hybride (Y2H) is de meest gebruikte methode voor de detectie van de PPI. Y2H is gemakkelijk uit te voeren, en geschikt voor een snelle test onderzocht eiwitinteractie. Y2H wordt ook op grote schaal gebruikt voor de screening van de onbekende wisselwerking partners voor de specifieke eiwit-of-interest. Echter omdat Y2H is geheel uitgevoerd in gist, kan niet zij nadenken het echte scenario in plantaardige cellen en brengt hoge valse positieve tarieven. Een andere soortgelijke strategie is de bepaling van de pull-down. In het algemeen twee eiwitten zijn uitgedrukt en gezuiverd van Escherichia coli cellen en vervolgens gemengd en geïmmobiliseerd voor het opsporen van eiwitinteractie. Hoewel deze methode niet tijdrovend is, niet kan het verkrijgen in vivo interactie resultaten ofwel. Voor in vivo de doeleinden van de interactie is co-immunoprecipitation (co-IP) de meest populaire assay, die houdt van hoge kwaliteit-antistoffen tegen immunoprecipitate de eiwit-of-interest en de mogelijkheid van indirecte PPIs kan niet worden uitgesloten. Bovendien, als gevolg van de ingewikkelde experimentele procedures in co-IP variëren de resultaten meestal met individuele expertise.
Verslaggever gebaseerd reconstitutie testen verder sterk de opsporing van in vivo PPI. Deze methoden omvatten de firefly luciferase complementatie imaging (LCI) assay8, fluorescentie resonance energy transfer (FRET)6en bimolecular fluorescentie complementatie (BiFC)7. Hoewel deze drie benaderingen beter dan co-IP aan de directe in-vivo PPI, FRET en BiFC specifieke microscopen te detecteren signalen van de fluorescentie moeten en kunnen niet gemakkelijk kwantificeren van de intensiteit van de interactie. LCI maakt daarentegen gebruik van firefly luciferase, die gloeien zal na reageren met haar substraat luciferine. Nog belangrijker, kan PPI intensiteit worden bepaald uit de waarde van luciferase activiteit. LCI geeft dus niet alleen of de twee eiwitten interactie of niet, maar verstrekt ook informatie over de dynamiek van de interactie op een behandeling. Hoewel er enkele gevestigde methoden voor de controle van interactie dynamics (gebaseerd op oppervlakte plasmon resonantie of thermo-stabiliteit verschuivingen)9,10, betekent dit dat deze benaderingen gevoelige instrumenten of specifieke etikettering nodig. LCI is daarentegen eenvoudiger uit te voeren en te detecteren.
Het principe van LCI is dat de amino-terminal en carboxyl-terminal helften van luciferase (genaamd N-Luc of C-Luc, respectievelijk) waren gesmolten met EiwitA en B, en deze twee fusion eiwitten gelijktijdig werden uitgedrukt in plantencellen. Eiwit A communiceert met eiwit B, zal de twee helften van luciferase worden toegevoegd om een actieve luciferase enzym. Luciferase activiteit kan worden opgespoord met een luminometer of CCD-camera. Het is niet nodig voor het verkrijgen van stabiele transformants voor LCI; voorbijgaande expressie is genoeg om een kwalitatief hoogwaardige interactie resultaat te krijgen.
RING-type E3 ubiquitin ligase constitutieve photomorphogenic 1 (COP1) interageert met een horde van transcriptiefactoren en hun afbraak tot en met de 26S proteasoom11bevordert. Sommige van deze COP1-gerichte transcriptiefactoren zijn positieve regelgevers voor photomorphogenesis. In duisternis communiceert COP1 met suppressor van Phytochroom A-105 1 (SPA1), die COP1 E3 activiteit8verbetert. Na waarneming van licht, zal de researchdieren de COP1-SPA1 interactie vervolgens stabiliseren COP1 substraten12,13,14te COP1 activiteit remmen trekt. In het volgende voorbeeld illustreert de biologische betekenis van studeren PPI en het bepalen van de PPI dynamiek.

<table><tbody><tr><td>Transformatie oplossing</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM Morpholineethanesulfonic acid</td><td>VETEC</td><td>V900336&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>27.8 mM Glucose</td><td>VETEC</td><td>V900392</td><td></td></tr><tr><td>10 mM MgCl2&times;6H2O</td><td>VETEC</td><td>V900020&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>150 &mu;M Acetosyringone</td><td>ALDRICH</td><td>D134406&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>pH 5.7</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luciferine werkbuffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 mM Luciferine kaliumzout</td><td>GOLD BIOTECHNOLOGY</td><td>LUCK-100</td><td></td></tr><tr><td>0.025% Triton X-100</td><td>VETEC</td><td>V900502&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>H2O tot 10 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

luciferase complementatie imaging assay in nicotiana benthamiana bladeren voor transient bepalen eiwit-eiwit interactie dynamics

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Eiwit-eiwitinteractie zijn fundamentele mechanismen voor het doorgeven van signaaltransductie in meest cellulaire processen; Daarom zijn de identificatie van nieuwe eiwit-eiwit interactie pairs en eiwit interactie dynamiek controle van bijzonder belang voor het openbaren van hoe planten reageren op omgevingsfactoren en/of ontwikkelingsstoornissen signalen. Een overvloed aan benaderingen zijn ontwikkeld voor eiwit-eiwitinteractie, in vitro of in vivoonderzoeken. Onder hen is de onlangs opgerichte luciferase complementatie imaging (LCI) assay de eenvoudigste en snelste methode voor het aantonen van in vivo eiwit-eiwitinteractie. In deze test, is EiwitA of eiwit B gefuseerd met de amino-terminal of carboxyl-terminal helft van luciferase, respectievelijk. Wanneer EiwitA met eiwit B communiceert, zal de twee helften van luciferase worden toegevoegd om te vormen van een functionele en actieve luciferase enzym. Luciferase activiteit kan worden vastgelegd met een luminometer of CCD-camera. In vergelijking met andere benaderingen, toont de LCI assay eiwit-eiwitinteractie zowel kwalitatief als kwantitatief. Agrobacterium infiltratie in Nicotiana benthamiana bladeren is een veelgebruikt systeem voor voorbijgaande eiwit expressie. Met de combinatie van LCI en voorbijgaande expressie tonen deze benaderingen dat de fysieke interactie tussen COP1 en SPA1 geleidelijk was verminderd na de Jasmonaat behandeling.

Drie belangrijke stappen kunnen worden uitgekozen in dit luciferase complementatie protocol voor de studie van eiwit-eiwit interacties in vivo, met inbegrip van de plantengroei, tabak infiltratie en de luciferase assay. De meest cruciale stap in dit protocol is vloeibare A. tumefaciens infiltreren in de N. benthamiana bladeren (Figuur 1).
Hier is een voorbeeld van het nut ...

Dit manuscript beschrijft een gemakkelijke en snelle experimentele procedure voor het bepalen van de eiwit-eiwitinteractie gebaseerd op de meting van luciferase activiteit.

Luciferase complementatie Imaging Assay in Nicotiana benthamiana bladeren voor Transient bepalen eiwit-eiwit interactie Dynamics

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...

Het algemene doel van deze procedure is om eiwit-eiwit interacties kwantitatief te detecteren in een tijdelijk expressiesysteem. Deze maatregel kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in quan-signaaltransactievelden, zoals hoe we eiwit-eiwit richtingen kwantitatief kunnen monitoren na een chemische of omgevingsbehandeling. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een luminometer of een CCD-camera gebruikt om de luciferous activiteit te detecteren, die de intensiteit van de eiwit-eiwit richting vertegenwoordigt, zodat de resultaten nauwkeuriger zijn.Om deze procedure te beginnen, voeg je één milliliter van een oplossing toe die vijf procent natriumhypochloriet en nul punt één procent triton x honderd bevat aan een microcentrifugebuisje van één punt vijf milliliter die zaden bevat. Laat de oplossing vijf minuten rusten om de zaden te steriliseren. Was vervolgens de zaden vijf keer met steriel water.Suspendeer de gewassen zaden in tweehonderd microliter steriele water. Plaats met behulp van fijne punten zorgvuldig individuele zaden op het oppervlak van geplateerd MS-agarmedium. Bewaar de platen gedurende drie dagen bij vier graden Celsius om de kieming te synchroniseren.Houd hierna de medium platen tien dagen onder normale groeiomstandigheden. Breng de kiemkrachtende zaailingen over in de grond, zorg ervoor dat de wortels niet worden beschadigd. Bedek de lade met een doorzichtige plastic afdekking voor de nacht om de luchtvochtigheid te behouden.Laat planten zeven weken groeien in een gecontroleerde groeiruimte, wanneer ze klaar zijn voor agrobacterium tumefaciens infiltratie. Om te beginnen, lever je honderdvijftig nanogram plasmiden af aan de a-tumefaciens competente celstammen GV3101. Plaats de buisjes met de a-tumefaciens cultuur in een shaker en incubeer gedurende vier uur.Breng met behulp van een glas staaf de cultuur van de buisjes over naar LB-media. Cultuur a-tumefaciens en LB-agarmedium gedurende vier dagen bij 28 graden Celsius. Bereid vervolgens voor om een enkele a-tumefaciens kolonie van elke plaat in zijn eigen buisje te inoculeren met drie milliliter LB-vloeibaar medium.Schud gedurende 24 uur bij 280 RBM en 28 graden Celsius om de cultuur te propageren. Breng vervolgens 75 microliter van de bacteriecultuur over in 15 milliliter vers LB-vloeibaar medium dat 15 microgram per milliliter kanamycine en 50 microgram per milliliter rifampicine bevat. Cultuur de bacteriën bij 220 RPM en 30 graden Celsius gedurende ongeveer 8 uur tot OD600 tussen 0,5 en 1 ligt.Breng de cultuur vervolgens over naar centrifugeerbuisjes van 15 milliliter. Centrifugeer gedurende 15 minuten bij 4000 maal de zwaartekracht en vier graden Celsius. Gooi de supernatant weg en resuspendeer de pallet in 15 milliliter transformatieoplossing.Centrifugeer gedurende 15 minuten bij 4000 maal de zwaartekracht en vier graden Celsius. Herhaal vervolgens de suspensie- en centrifugatiestap nog een keer. Gooi de supernatant weg en resuspendeer de pallet in 5 milliliter transformatieoplossing.Laat de resuspendeerde pallet gedurende twee uur rusten bij kamertemperatuur in donkere omstandigheden. Voeg vervolgens transformatieoplossing toe aan de OD600 van 0,5 of combineer twee monsters met gelijk volume voor het testen van gepaarde eiwitinteracties. Gebruik een naald van een milliliter spuit om gesuspendeerde cellen in de vierde tot zevende bladeren te infiltreren.Bedek de planten vervolgens onmiddellijk gedurende 12 uur met een zwarte plastic afdekking. Ten eerste moeten planten zeer gezond zijn om succes te garanderen. Ten tweede, zorg ervoor dat u geen bladeren beschadigt tijdens het infiltratieproces.Houd de lade gedurende 12 uur in het donker. Laat de planten vervolgens 2 tot 4 dagen onder normale omstandigheden groeien voordat u de luciferase activiteit detecteert. Om de beeldvormingsmethode te beginnen, los een geïnfiltreerd blad los.Plaats het volledige blaadje op een plaat met MS-agarmedium. Spuit met behulp van een spuitfles van 50 milliliter luciferon werkbuffer op de adaxiale zijde van de bladeren. Houd het vervolgens 5 minuten in het donker om de autofluorescentie van chlorofyl te doven.Gebruik een laag licht gekoelde CCD-beeldvormingsapparaat gekoeld tot min dertig graden Celsius om afbeeldingen vast te leggen met een belichtingstijd van 50 milliseconden met een lichtvulling en een detectietijd voor luminescentie van 1 minuut. Snijd vervolgens bladfragmenten uit het infiltratiegebied van de N-benthamiana bladeren. Dompel de fragmenten onder in 100 microliter gedeïoniseerd water in de putjes van een 96-well witte plaat.Voeg tien microliter luciferon werkbuffer toe. Laat de plaat vijf minuten rusten. Voer vervolgens elke gewenste specifieke behandeling uit om eiwitinteractiedynamiek te bestuderen en meet de luminescentie direct met een commerciële luminometer.Hier wordt de demonstratie van luciferous activiteit getoond om COP 1 SPA 1 interacties te vertegenwoordigen. De luciferous activiteit, die wordt gedetecteerd door luminescentie, wordt geïmaged door een CCD-camera. COP 1 SPA 1 interacties lijken te resulteren in kopermutatie van functioneel luciferase.De luciferase activiteit onder Jasmijn 8 behandeling over tijd wordt vervolgens bepaald. COP 1 SPA 1 interacties, vertegenwoordigd door luciferase activiteit, lijken geleidelijk te verminderen in het donker. Behandeling met Jasmijn 8 vermindert deze interacties verder.Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in 1 week worden uitgevoerd, nadat de planten klaar zijn als deze goed wordt uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om gezonde planten te onderhouden. Infiltreer bladeren voorzichtig en sluit controles goed in.Nadat deze techniek is ontwikkeld, baant deze de weg voor onderzoekers op het gebied van signaaltransacties om eiwit-eiwit interactiedynamiek op een snelle manier te verkennen. Na het bekijken van deze video, zou je een goed begrip moeten hebben van hoe je tabaksplanten kweekt, agrobacterias in tabaksblade

luciferase-complementation-imaging-assay-nicotiana-benthamiana-leaves

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit artikel illustreert hoe goed gebruik van de BioRad Helios Gene Gun om plasmide DNA te introduceren in ui epidermale cellen en hoe om te testen voor eiwit-eiwit interacties in ui cellen op basis van het principe van de Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie...

Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie (BiFC) test voor eiwit-eiwit interactie in Onion cellen met behulp van de Helios Gene Gun

We hebben een techniek ontwikkeld om eiwit-eiwit interacties in planten te testen. Een geel fluorescerend eiwit (YFP) wordt opgesplitst in twee niet-overlappende fragmenten. Elk fragment is gekloond in-frame aan een gen van belang via de Gateway-systeem, waardoor de expressie van fusie-eiwitten. Reconstitutie van YFP-signaal treedt alleen op wanneer de lijkschouwing eiwitten met elkaar omgaan.

Detectie van eiwit interacties in Plant met behulp van een Gateway-compatibele Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie (BiFC) Systeem

This video demonstrates the split luciferase complementation assay to detect protein-protein interactions. In this assay, the proteins of interest are tagged to small and large fragments of the luciferase enzyme. When the proteins interact, the large and small fragments combine to form an active enzyme complex, which in the presence of a specific substrate, releases bright luminescence that can be measured.

Split Luciferase Complementation Assay to Identify Specific Protein-Protein Interactions

Voorbijgaande eiwitproductie in Nicotiana planten op basis van vacuüm infiltratie met Agrobacteriën uitvoeren lancering vectoren (tabak mozaïek virus-based) is een snelle en economische benadering van vaccin antigenen en therapeutische eiwitten te produceren. We vereenvoudigde de procedure en verbeterd doel accumulatie door het optimaliseren van de voorwaarden van bacteriën kweken, selecteren gastheer soorten, en co-introduceren van RNA-silencing onderdrukkers.

Optimalisatie en het gebruik van<em&gt; Agrobacterium</em&gt;-Gemedieerde Transient eiwitproductie in<em&gt; Nicotiana</em

Vorming van eiwitcomplexen in vivo kan worden gevisualiseerd door bimoleculaire fluorescentie complementatie. Interactie partners gefuseerd aan complementaire delen van fluorescente labels en tijdelijk tot expressie gebracht in tabaksbladeren, waardoor een opnieuw fluorescentiesignaal op nabijheid van de twee eiwitten.

Eiwit-eiwit interacties gevisualiseerd door Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie in Protoplasten en Bladeren Tabak

Op subcellulair niveau worden signaleringsgebeurtenissen dynamisch gemoduleerd door ontwikkelings- en omgevingssignalen. Hier beschrijven we een protocol dat het tabaks-transiente expressiesysteem gebruikt om dynamische eiwit-eiwitinteracties te monitoren en om de ruimtelijke organisatie van signaaltransductie in plantencellen bekend te maken.

Beeldvorming Ruimtelijke Reorganisatie van een MAPK signaalroute Met behulp van de Tabak Transient Expression System

Het hier gepresenteerde protocol is bedoeld om het optreden van heterologe interacties tussen Golgi-residente type III membraaneiwitten met cytoplasmatisch blootgestelde N- en/of C-termini in levende zoogdiercellen aan te tonen met behulp van de meest recente variant van de split luciferase complementatie assay.

Demonstratie van heterologe complexen gevormd door Golgi-Resident Type III membraaneiwitten met behulp van Split Luciferase Complementation Assay

We beschrijven hier een eenvoudige methode voor expressie, extractie en zuivering van recombinant menselijke IgG versmolten tot GFP in Nicotiana benthamiana. Dit protocol kan worden uitgebreid tot zuivering en visualisatie van tal van eiwitten die kolomchromatografie gebruiken. Bovendien is het protocol aanpasbaar aan het persoonlijke en virtuele college onderwijs laboratorium, het verstrekken van project-based exploratie.

Productie van IgG Fusion Proteins transiently uitgedrukt in Nicotiana benthamiana

Hier presenteren we een methode om de vorming van ternaire complexen tussen drie eiwitpartners te visualiseren met behulp van fluorescerende gelabelde eiwitten door biFC-gebaseerde FRET-FLIM-assay. Deze methode is waardevol voor het bestuderen van eiwit-eiwitinteractiecomplexen in vivo.

Bepaling van de tripartiete interactie tussen twee monomeren van een MADS-box transcriptiefactor en een calciumsensoreiwit door BiFC-FRET-FLIM-assay

Fluorescentieresonantie-energieoverdracht (FRET) is een beeldvormingstechniek voor het detecteren van eiwitinteracties in levende cellen. Hier wordt een FRET-protocol gepresenteerd om de associatie van histonmodificerende enzymen met transcriptiefactoren te bestuderen die ze rekruteren voor de doelpromotors voor epigenetische regulatie van genexpressie in plantenweefsels.

Onderzoek naar interacties tussen histonmodificerende enzymen en transcriptiefactoren in vivo door fluorescentieresonantie-energieoverdracht

Dit protocol beschrijft de selectie van optimale plasmodesmale markers voor confocale microscopie-gebaseerde analyses van eiwit gericht op plasmodesmata tijdens virus-plasmodesmata interacties of plasmodesmaal transport.

Confocale microscopieanalyse van eiwitsortering naar plasmodesmata in Nicotiana benthamiana

Leer luciferase-complementatie-imaging om eiwit-eiwitinteracties kwantitatief te detecteren in Nicotiana benthamiana bladeren. Deze methode biedt snelle, nauwkeurige resultaten voor signaaltransductieonderzoek.

Luciferase complementatie Imaging Assay in Nicotiana benthamiana bladeren voor Transient bepalen eiwit-eiwit interactie Dynamics (Video) | JoVE Journal

Luciferase complementatie Imaging Assay in Nicotiana benthamiana bladeren voor Transient bepalen eiwit-eiwit interactie Dynamics

Meer video's verkennen