Name: Achterste Semicircular Canal aanpak voor binnenoor Gene levering in neonatale muis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 52 s
Description: Leer de achterste semicirculaire kanaalbenadering voor efficiëte gentherapie in het binnenoor van neonatale muizen. Deze betrouwbare methode maakt volledige perfusie van het binnenoor mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door fondsen van het NIDCD divisie van intramurale onderzoek /NIH (DC000082-02 tot W.W.C.), alsook DC000081 aan geavanceerde imaging core. We zijn dankbaar voor het NIDCD dier faciliteit personeel voor de zorg voor onze dieren.

Alle dierlijke procedures werden goedgekeurd door het Animal Care en gebruik Comité bij het National Institute on doofheid en andere communicatie stoornissen (NIDCD ASP1378-15).
1. procedure Setup en voorbereiding
<ol><li>Steriliseren alle instrumenten in ethyleenoxide in het begin van het experiment. Reinig instrumenten met behulp van de kraal sterilisatie tussen dieren.</li>
	<li>Laden van de oplossing met virale gentherapie in een micropipet op de micro-injector. De virale vector gebruikt in deze studie was AAV2/8-whirlin (1 x 1013 genoom kopieën per milliliter, zie de inhoudsopgave materialen). Opmerking: Doorgaans 1.1 µL totaalvolume wordt geladen in de micropipet.</li>
</ol>2. anesthesie
Opmerking: De spanning van de muis gebruikt in deze studie is de whirler-muis. Homozygoot mutanten (Whrnwi/wi) zowel heterozygoot nestgenoten (Whrn+/ wi) werden gebruikt.
<ol><li>Plaats de moeder in een aparte kooi (Los van het nest).</li>
	<li>Plaats de kooi met het nest (P0 - P5 pups) op een recirculatie warmte pad (set bij 37,5 ° C) de muizen om warm te houden.</li>
	<li>Knip uit het gedeelte van de duim van een latex handschoen, en plaats een pup in het.</li>
	<li>Plaats de pup in latex handschoen duim in een emmer van ijs voor ~ 2 min.</li>
	<li>Plaats de narcose pup op een groot plein commerciële kunststof bevriezen pack met een 4 "x 4" gaas tussen de pup en het pack van oppervlak.</li>
	<li>Vul een heavy-duty latex handschoen met crushed ijs en plaats de handschoen ijs rond de pup.</li>
	<li>Controleer als de pup voldoende is verdoofd door het volledig ontbreken van een reactie op verschillende stimuli (met inbegrip van een stevige teen snuifje). Laat de pup op de ice pack voor de duur van de operatie (ongeveer 5-10 min). Opmerking: We raden aan het verlaten van de pups op de ice pack voor niet meer dan 15 min tijdens de operatie.</li>
</ol>3. de chirurgische benadering (Figuur 1)
<ol><li>Reinig de huid achter het oor met een veeg van jodium en een alcohol doekje zodra het dier wordt verdoofd.</li>
	<li>Maken van een postauricular incisie ~ 2 mm achter het oor met behulp van de micro-schaar, en verdeel de musculus sternocleidomastoideus met micro-schaar.</li>
	<li>Identificeer de nervus facialis en de ' bulla '. De ' bulla ' kraakbeenachtige en semi-transparante is op deze leeftijd en het ligt mediaal op de nervus facialis. De stapedial slagader kan worden gezien door de ' bulla ' op deze leeftijd, dat een nuttige mijlpaal is.</li>
	<li>Volg de nervus facialis superiorly en posteriorly te vinden van het posterieure semicircular kanaal (PSCC). Verwijder de spiervezels en het zachte weefsel overliggende het posterieure semicircular-kanaal met behulp van de micro-schaar. Opmerking: De PSCC is kraakbeenachtige op deze leeftijd.</li>
	<li>Doordringen de PSCC met behulp van een glas micropipet (~ 10 micrometer in diameter) op de micro-injector.</li>
	<li>Virale gentherapie injecteren in het binnenoor. Opmerking: Doorgaans 20 injecties van 49 in totaal nL van de gentherapie worden geleverd in de achterste semicircular kanaal meer dan ~ 40 s (totale volume ~ 1 µL). De virale titer gebruikt was 1 x 1013 genoom kopieën per mL.</li>
	<li>Sluit de insnijding van de huid met behulp van een 5-0 polyglactin hechtdraad.</li>
</ol>4. de postoperatieve zorg
<ol><li>Plaats de pup op een opwarming pad om te herstellen van een normale lichaamstemperatuur tijdens het herstel van anesthesie met constante handmatige stimulatie/rollen met gehandschoende menselijke vingers.</li>
	<li>Zodra de pup wakker is, plaats het terug in zijn kooi.</li>
	<li>Elke pup met een wattenstaafje dat is blootgesteld aan de kooi beddengoed strelen. Opmerking: Het doel hiervan is dat de muizen ruiken zoals ze deden vóór de operatie, die vergroot u de kans van de moeder opnieuw haar nest na chirurgie aanvaarding. Indien mogelijk, kan urine van de moeder worden verzameld en wreef over de pups met behulp van een wattenstaafje om te verder verlagen de kans op afwijzing.</li>
	<li>Toepassing van minerale olie op de Moederdag neus te desensibiliseren haar8, en opnieuw de moeder in hun kooi.</li>
</ol>

<ol><li>Chien, W. W., Monzack, E. L., McDougald, D. S., Cunningham, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+for+sensorineural+hearing+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Ear+Hear%22%5BJournal%5D)">Gene therapy for sensorineural hearing loss.</a> Ear Hear. 36, 1-7 (2015).</li>
<li>Askew, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tmc+gene+therapy+restores+auditory+function+in+deaf+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Tmc gene therapy restores auditory function in deaf mice.</a> Sci Transl Med. 7, 295(2015).</li>
<li>Akil, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+hearing+in+the+VGLUT3+knockout+mouse+using+virally+mediated+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Restoration of hearing in the VGLUT3 knockout mouse using virally mediated gene therapy.</a> Neuron. 75, 283-293 (2012).</li>
<li>Pan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+restores+auditory+and+vestibular+function+in+a+mouse+model+of+Usher+syndrome+type+1c%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Gene therapy restores auditory and vestibular function in a mouse model of Usher syndrome type 1c.</a> Nat Biotechnol. 35, 264-272 (2017).</li>
<li>Isgrig, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Therapy+Restores+Balance+and+Auditory+Functions+in+a+Mouse+Model+of+Usher+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Gene Therapy Restores Balance and Auditory Functions in a Mouse Model of Usher Syndrome.</a> Mol Ther. 25, 780-791 (2017).</li>
<li>Lentz, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+hearing+and+vestibular+function+by+antisense+oligonucleotides+in+a+mouse+model+of+human+deafness%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Rescue of hearing and vestibular function by antisense oligonucleotides in a mouse model of human deafness.</a> Nat Med. 19, 345-350 (2013).</li>
<li>Shibata, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Interference+Prevents+Autosomal-Dominant+Hearing+Loss%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA Interference Prevents Autosomal-Dominant Hearing Loss.</a> Am J Hum Genet. 98, 1101-1113 (2016).</li>
<li>Van Sluyters, R. C., Obernier, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+care+and+use+of+mammals+in+neuroscience+and+behavioral+research%5BTitle%5D)+AND+%22Contemp+Top+Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the care and use of mammals in neuroscience and behavioral research.</a> Contemp Top Lab Anim. 43, 48(2004).</li>
<li>Chien, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Therapy+Restores+Hair+Cell+Stereocilia+Morphology+in+Inner+Ears+of+Deaf+Whirler+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Gene Therapy Restores Hair Cell Stereocilia Morphology in Inner Ears of Deaf Whirler Mice.</a> Mol Ther. 24, 17-25 (2016).</li>
<li>Hirose, K., Hartsock, J. J., Johnson, S., Santi, P., Salt, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+lipopolysaccharide+compromises+the+blood-labyrinth+barrier+and+increases+entry+of+serum+fluorescein+into+the+perilymph%5BTitle%5D)+AND+%22J+Assoc+Res+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Systemic lipopolysaccharide compromises the blood-labyrinth barrier and increases entry of serum fluorescein into the perilymph.</a> J Assoc Res Otolaryngol. 15, 707-719 (2014).</li>
<li>Okada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+targeting+mouse+vestibule+using+adenovirus+and+adeno-associated+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Otol+Neurotol%22%5BJournal%5D)">Gene transfer targeting mouse vestibule using adenovirus and adeno-associated virus vectors.</a> Otol Neurotol. 33, 655-659 (2012).</li>
<li>Suzuki, J., Hashimoto, K., Xiao, R., Vandenberghe, L. H., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+gene+therapy+with+ancestral+AAV+in+adult+mice%3A+complete+transduction+of+inner+hair+cells+without+cochlear+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Cochlear gene therapy with ancestral AAV in adult mice: complete transduction of inner hair cells without cochlear dysfunction.</a> Sci Rep. 7, 45524(2017).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen relevante informatie te maken.

Verschillende chirurgische benaderingen zijn beschreven voor toegang tot knaagdier inner oren. Cochleostomy en ronde venster benaderingen zijn meestal gebruikt voor toegang tot het slakkenhuis, terwijl de achterste semicircular canal en de endolymphatic sac benaderingen doorgaans gebruikt worden voor toegang tot de vestibulaire organen1. In een recente studie toonden we dat posterieure semicircular canal injecties van virale gentherapie in hoge efficiëntie van Haarcel signaaltransductie in zowel d...

De therapie van het gen van de innerlijke oor is een zich snel ontwikkelende gebied van onderzoek. Deze is vereffend in verschillende modellen van de dieren te bestrijden ototoxiciteit, lawaai trauma, erfelijke hoorzitting verlies1. Verschillende recente studies hebben aangetoond functionele herstel van gehoor en evenwicht functies in mutant muizen na binnenoor gene therapie levering2,3,4,5,6, 7. een van de belangrijkste factoren bij het bepalen van het succes van de therapie van het gen van de innerlijke oor is de chirurgische aanpak gebruikt voor toegang tot het binnenoor. In het ideale geval de chirurgische benadering zou zijn gemakkelijk uit te voeren, de anatomische bezienswaardigheden zou consistent zijn en gemakkelijk te identificeren, en de resulterende transductie van gerichte celtypes hoog zou zijn.
In een recente studie toonden we dat toen virale gentherapie werd geïnjecteerd door het posterieure semicircular-kanaal van de mutant muis van whirler (een model van verlies van het gehoor en vestibulair dysfunctie), efficiënte transductie van sensorische haarcellen werd gezien in de vestibulaire ook organen zoals in het slakkenhuis5. De hoge efficiëntie van sensorische Haarcel transductie geleid tot verbetering van de auditieve en vestibulaire functies in deze mutant muizen.
In dit artikel beschrijven we in detail de achterste semicircular canal aanpak voor toegang tot het binnenoor neonatale muis.

<table><tbody><tr><td>Operatiemicroscoop</td><td>Zeiss</td><td></td><td>OPMI Pico ENT-microscoop. Andere dissectiemicroscopen zouden ook werken.</td></tr><tr><td>Micro-forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10, 11295-51</td><td>#5 en #55 Dumont</td></tr><tr><td>Micro-schaar</td><td>Fine Science Tools</td><td>15002-08</td><td></td></tr><tr><td>Nanoliter2000 micro-injector</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Verwarmingskussen</td><td>Mastex</td><td>Model 500/600</td><td></td></tr><tr><td>5-0 vicryl hechtdraad</td><td>Ethicon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AAV8-whirlin</td><td>Vector Biolabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glazen pipet</td><td>Sutter Instruments</td><td>B100-75-10</td><td>Boorsilicaatglas</td></tr></tbody></table>

achterste semicircular canal aanpak voor binnenoor gene levering in neonatale muis

Posterior Semicircular Canal Approach for Inner Ear Gene Delivery in Neonatal Mouse

De therapie van het gen van de innerlijke oor biedt grote belofte als een mogelijke behandeling van gehoorverlies en duizeligheid. Een van de kritische determinanten van het succes van de therapie van het gen van de innerlijke oor is een leveringsmethode die tot consistente transductie efficiëntie van gerichte celtypes leidt terwijl het minimaliseren van verlies van het gehoor te vinden. In deze studie beschrijven we de achterste semicircular canal-benadering als een levensvatbare methode voor binnenoor gene levering in neonatale muizen. We laten zien dat gene levering door het posterieure semicircular-kanaal vermag perfuse het gehele binnenoor. De anatomische identificatie van het posterieure semicircular kanaal, alsmede minimale manipulatie van het bot van de temporale vereist, maken dit chirurgische aanpak een aantrekkelijke optie voor binnenoor gene levering.

Injectie van gentherapie in neonatale whirler muizen door het posterieure semicircular-kanaal AAV8-whirlin resulteerde in de whirlin expressie (groen) in utricular haarcellen (Figuur 2), met de algehele efficiëntie van de infectie van 53,1% (SD 38,1, n = 28)5 . Getransduceerde haarcellen had langwerpige stereocilia (rood) in vergelijking met de haarcellen van contralaterale niet-ingespoten oren (5.35 ± 2.11 µm vs. 3,20 ± 0.34 µm, respe...

In deze studie beschrijven we de achterste semicircular canal-benadering als een betrouwbare methode voor binnenoor gene levering in neonatale muizen. We laten zien dat gene levering door het posterieure semicircular-kanaal vermag perfuse het gehele binnenoor.

Achterste Semicircular Canal aanpak voor binnenoor Gene levering in neonatale muis

Inner ear gene therapy offers great promise as a potential treatment for hearing loss and dizziness. One of the critical determinants of the success of ...

Het algemene doel van deze procedure is om toegang te krijgen tot het binnenoor van de muis voor genoverdracht. Deze methode kan helpen bij het efficiënt leveren van gentherapie aan het binnenoor van de muis. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat het betrouwbaar en gemakkelijk te leren is.Over het algemeen zullen mensen die nieuw zijn in deze methode het moeilijk vinden vanwege de kleine omvang van het binnenoor van de muis. Met oefening kan de meeste mensen echter binnen tien minuten een chirurgische dissectie voltooien. Begin de procedure met steriele instrumenten en zet de bead-sterilisator aan om instrumenten tussen dieren schoon te maken.Laad het therapeutische virus in een micropipet van tien micron in diameter die is bevestigd aan een micro-injector. De virale vector die in onze experimenten is gebruikt, is AAV28-whirlin met een titer van een maal tien tot de 13 genoomkopieën per milliliter. Voor deze video werd methyleenblauwkleurstof gebruikt voor gemakkelijker zichtbaarheid.Reinig de huid achter het oor met drie betadine scrubs gevolgd door een alcoholdoekje. Gebruik vervolgens microschaar om een postauriculaire snede van ongeveer twee millimeter achter he

posterior-semicircular-canal-approach-for-inner-ear-gene-delivery

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

De muis binnenoor is een placode-afgeleide zintuig waarvan het ontwikkelings-programma wordt uitgewerkt tijdens de dracht. We definiëren...

Gene Transfer naar de ontwikkelingslanden Mouse binnenoor door<em&gt; In Vivo</em&gt; Elektroporatie

Source: Kozin, E. D., et.al. Direct Visualization of the Murine Dorsal Cochlear Nucleus for Optogenetic Stimulation of the Auditory Pathway. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates virus-mediated gene transfer into the mouse dorsal cochlear nucleus (DCN) to enable light-induced auditory stimulation. A viral vector encoding opsin, a light-sensitive ion channel, is injected into the DCN following a craniotomy and cerebellar aspiration for direct access. The expressed opsins allow neurons to be...

Virus-Mediated Gene Transfer Into the Mouse Dorsal Cochlear Nucleus for Light-Induced Auditory Stimulation

This video showcases canalostomy, a procedure that allows local drug delivery into the inner ear of a mouse through the semicircular canal with minimal damage to hearing and vestibular function. This method enables the inoculation of viral vectors, pharmaceuticals, and small molecules into the mouse's inner ear.

Canalostomy for Local Drug Delivery into the Inner Ear of an Adult Mouse

Source: Akil, O., et al., Surgical Method for Virally Mediated Gene Delivery to the Mouse Inner Ear through the Round Window Membrane. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates the procedure of delivering a therapeutic gene into the inner ear of a mouse pup with genetically induced hearing loss. Using an adeno-associated viral (AAV) vector, the gene is injected through the round window membrane, allowing viral particles to enter hair cells, restore glutamate transporter production, and...

Viral Vector-Based Gene Therapy for Hearing Restoration in a Mouse Model

De beschreven postauriculaire chirurgische benadering maakt een snelle en directe toediening mogelijk in de scala tympani van de muizencochlea, terwijl bloedverlies en sterfte bij dieren wordt geminimaliseerd. Deze methode kan worden gebruikt voor cochleaire therapie met behulp van moleculaire, farmacologische en virale toediening aan postnatale muizen via het ronde venmembraan.

Chirurgische methode voor viraal gemedieerde Gene Levering aan de Mouse Inner Ear door het ronde venster membraan

We presenteren een methode die de isolatie en kweek van cochleaire explantaten van het binnenoor van embryonale muizen beschrijft. We demonstreren ook een methode voor genoverdracht naar cochleaire explantaten via vierkantgolfelektroporatie. De in vitro explantaatkweek gekoppeld aan de genoverdrachtstechniek stelt onderzoekers in staat om de effecten van het veranderen van genexpressie tijdens de ontwikkeling te bestuderen.

Cultuur van embryonale Mouse Cochlear Explantaten en Gene Transfer door elektroporatie

Het doel van dit protocol is om een chirurgische benadering te schetsen om directe toegang te bieden tot de dorsale cochleare nucleus in een muismodel.

Directe visualisatie van het Muizen Dorsale Cochlear Nucleus voor optogenetische Stimulatie van de Auditieve Pathway

Twee microchirurgiebenaderingen voor lokale medicijntoediening aan het binnenoor worden hier beschreven en vergeleken in termen van impact op gehoorparameters, cochleaire cytoarchitectuur en expressie van inflammatoire markers.

Een vergelijkende studie van Drug Delivery Methoden Gericht op de Mouse Inner Ear: Bullostomy Versus Transtympanic Injection

Het doel van dit protocol is om de voorbereiding, de cultuur, de behandeling en het immunostaining van neonatale muizencochleaire explantanten aan te tonen. De techniek kan gebruikt worden als een in vitro screening tool bij het horen onderzoek.

Neonatale Murine Cochlear Explantietechniek als een<em&gt; In Vitro</em&gt; Screening Tool in Hearing Research

Een chirurgische methode te beheren van drugs aan het binnenoor van een niet-menselijke primaten, de gemeenschappelijke Hapalomys (Callithrix jacchus), rapporteren we via het membraan van het ronde venster.

Een chirurgische ingreep voor de administratie van Drugs aan het binnenoor in een niet-menselijke primaten gemeenschappelijk Hapalomys (Callithrix jacchus)

Hier beschrijven we canalostomy procedure waarmee lokale drug levering tot de inner oren van volwassen en neonatale muizen door het semicircular kanaal met minimale schade aan gehoorbescherming en vestibulaire functie. Deze methode kan worden gebruikt om te enten virale vectoren, farmaceutische producten en kleine moleculen in het binnenoor muis.

Canalostomy als een chirurgische benadering van lokale Drug Delivery tot de Inner oren van volwassen en neonatale muizen

Leer de achterste semicirculaire kanaalbenadering voor efficiëte gentherapie in het binnenoor van neonatale muizen. Deze betrouwbare methode maakt volledige perfusie van het binnenoor mogelijk.

Achterste Semicircular Canal aanpak voor binnenoor Gene levering in neonatale muis

Meer video's verkennen