Preconditionering de luchtwegen van muizen met bleomycine verhoogt de efficiëntie van Orthotopic long kanker cel Engraftment
28 juni 2018
Beschrijven we een methode om engraftment van de orthotopic van longkanker kankercellen in de longen lymfkliertest aanzienlijk te verbeteren door preconditionering van de luchtwegen met blessure. Deze benadering kan ook worden toegepast om te studeren stromale interacties binnen de longen communicatie, gemetastaseerde verspreiding, long kanker co morbiditeit en efficiënter genereren patiënt afgeleid xenografts.
Het algemene doel van deze procedure is om de efficiëntie van het transplanteren van tumor-initiërende longkankercellen in de luchtwegen van muizen te verhogen. Deze methode kan helpen bij het opzetten van nieuwe preklinische modellen om belangrijke vragen in de kankerbiologie te beantwoorden, inclusief de oorzaken van geneesmiddelresistentie en de relatie tussen fibrose en longkanker. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de transplantatie-efficiëntie van tumor-initiërende cellen in de longen van een verscheidenheid aan muisstammen verhoogt.
De implicaties van deze techniek strekken zich uit naar therapie, omdat het ons in staat stelt om een grotere verscheidenheid aan menselijke longkankersubtypen te modelleren, die bekend staan om verschillende klinische reacties op behandeling. Voor dit protocol moeten de muizen eerst worden geïnjecteerd met bleomycine. Vervolgens, na 14 dagen, worden de tumorcellen geïnjecteerd.
De procedure voor beide injecties is zeer vergelijkbaar en wordt hier beschreven. Twee uur voorafgaand aan de injectie, ontdooi de bleomycine-voorraad op ijs en verdun deze tot de werkconcentratie. Houd het op ijs.
Voor een celbolus, laat een celsuspensie bereiden zoals beschreven in het tekstprotocol. De proceduretijd voor elke muis is samen ongeveer 10 minuten. Zorg ervoor om de juiste anesthesie te bevestigen met een teenprik en breng vetzalf aan op de ogen.
Op dit moment, als de muis donker haar heeft, scheer dan het hele ribgebied zowel dorsaal als ventraal zodat het correct kan worden geïmageed. Plaats vervolgens de muis op het intubatieplatform door deze met de voortanden vast te zetten met de rug tegen het platform. Als een celbolus moet worden geïnjecteerd, suspendeer deze nu opnieuw met zachte trituratie.
Verlicht nu het bovenste deel van de borst, open de mond en trek voorzichtig de tong eruit met behulp van platte pincetten. Bereid een IV-katheter voor de luchtpijp voor door de naald te verwijderen, plaats deze vervolgens over de luchtpijopening. Breng vervolgens de katheter in de luchtpijp tot de bovenkant van de katheter dicht bij de voortanden is en verlicht het interieur van de katheter om de plaatsing te bevestigen.
Spuit vervolgens de 50 microliter vers gemaakte bleomycine of celsuspensie rechtstreeks in de katheter. Wacht een paar seconden totdat het gehele volume door de katheter is gereisd. Verwijder vervolgens de katheter en gooi deze weg in 10%bleach.
Als de muis de vloeistof niet inademt, bewaak zorgvuldig zijn ademhaling en pas de katheterpositie aan. Als de muis stopt met ademen, verwijder onmiddellijk de katheter en laat de muis ademen voordat u de katheter opnieuw inbrengt. Na het verwijderen van de katheter, ga door met de procedure om vijf behandelde muizen te hebben, nog steeds onder narcose, en klaar om te beeldvormen.
Voor herstel, plaats de muis in rugligging op een IACUC goedgekeurde verwarmingsmat in een herstelkooi en bewaak het totdat het volledig is hersteld. Twee of drie minuten na het injecteren van de cellen, injecteer 100 microliter luciferine retro-orbitaal, met behulp van een insulinenaald. Wissel het oog dat wordt gebruikt voor injectie bij elke beeldvormingssessie af.
Nadat u minstens twee minuten heeft gewacht, plaats u maximaal vijf muizen in een dier bioluminescentie imager, in de sternale rugliggingspositie en verwerft u een dorsale foto met behulp van luminescentie-instellingen. Pas de resolutie- en gevoeligheidsinstellingen onder het bedieningspaneel aan om de luminescentie van de cellen te meten. Voor de meeste toepassingen, begin met drie minuten, stel de binning op medium, stel de f/stop op een, stel het veld van zicht op d en stel de subjecthoogte op 1,5.
Als de injectie succesvol was, wordt een signaal gedetecteerd in het bovenste borstgebied in een long of beide longen. Als cellen geclusterd zijn bij de ingang van de luchtpijp, was de injectie niet succesvol. Na het nemen van de dorsale foto, draai de muizen om en verwerf een ventrale foto en pas de instelling aan zoals nodig.
Na het beeldvormen, ga verder met de postoperatieve zorg zoals beschreven in het tekstprotocol. Herhaal vervolgens dit beeldvormingsprotocol drie dagen na implantatie en wekelijks daarna. Gebruik een bioluminescentie-analysesoftware om de beelden te analyseren.
Laad eerst alle geschikte beelden in de serie. Deze sectie is gedetailleerd voor één softwarepakket. Vervolgens, voor elke muis, in de eerste afbeelding van de serie, maak een vierkant gebied van interesse en plaats het over het bovenste borstgebied dat het hele longgebied bedekt.
Gebruik vervolgens een rechtermuisklik om toegang te krijgen tot de kopieer alle gebieden van interesse-functie en gebruik dit hulpmiddel om dezelfde gebieden van interesse toe te passen op elke afbeelding in de groep. Pas vervolgens binnen elke afbeelding de posities van de vierkanten aan om het bovenste deel van de borst van elke muis te bedekken. Doe dit voor zowel de ventrale als dorsale weergaven.
Selecteer nu in de linkerbovenhoek van het afbeeldingsvenster de fotonenfunctie. Selecteer vervolgens de meetoptie. De gegevens van de gebieden van interesse worden vervolgens weergegeven in een uitvoertabel als totale flux.
Analyseer deze gegevens zoals nodig. Wanneer immuungecompromitteerde, atymische muizen werden behandeld met bleomycine. Voorafgaand aan celbolus-implantatie, werd transitoire fibrose waargenomen op dag 14 bij met bleomycine behandelde muizen, maar niet bij met voertuig behandelde muizen.
Vervolgens werden cellen van de gevestigde menselijke longkankercellijn, H2030, intratracheeel in de longen van deze muizen afgeleverd. Na 35 dagen hadden met bleomycine behandelde muizen een hoge longtumorbelasting. Bij met voertuig behandelde dieren werden echter geen tumoren gedetecteerd.
De longtumorbelasting werd bevestigd met behulp van histologie. Longen voorbehandeld met voertuig hadden geen aanwijzingen van tumorknobbels, terwijl bleomycine voorbehandelde longen grote tumorknobbels hadden. Na het transplanteren van een metastatische H2030
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode om de aanplant van longkankercellen in muizenlongen te verbeteren door de luchtwegen vooraf voor te bereiden door verwonding. Deze techniek kan het onderzoek naar stromale interacties, metastatische verspreiding en longkanker comorbiditeiten vergemakkelijken.
Belangrijke studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Oncologie
- Translationeel Onderzoek
- Preklinische Modellen
Achtergrond
- Het transplanteren van tumor-initiërende longkankercellen in muizen is cruciaal voor het bestuderen van kankerbiologie.
- Begrip van medicijnresistentie en de relatie tussen fibrose en longkanker is essentieel.
- Verschillende subtypen van menselijke longkanker reageren variabel op behandelingen.
- Huidige modellen vertegenwoordigen deze variaties mogelijk niet adequaat.
Doel van de studie
- Om de efficiëntie van longkankerceltransplantatie in muizen te verbeteren.
- Om preklinische modellen te vestigen die belangrijke vragen in de kankerbiologie kunnen beantwoorden.
- Om een breder scala aan menselijke longkankersubtypen te modelleren.
Gebruikte methoden
- Muizen worden geïnjecteerd met bleomycine om luchtwegverwonding te induceren.
- Na 14 dagen worden tumorcellen in de luchtwegen geïnjecteerd.
- De aanplant efficiëntie wordt beoordeeld over verschillende muizenstammen.
- Analyse van stromale interacties en metastatisch gedrag wordt uitgevoerd.
Belangrijkste resultaten
- De methode verhoogt aanzienlijk de transplantatie-efficiëntie van tumor-initiërende cellen.
- Het maakt het mogelijk om diverse longkankersubtypen te modelleren.
- Inzichten in de relatie tussen longkanker en fibrose worden verkregen.
- Mogelijke implicaties voor therapie en het begrijpen van medicijnresistentie worden gehighlight.
Conclusies
- Deze techniek verbetert het onderzoek naar longkankerbiologie in preklinische modellen.
- Het biedt een platform voor het onderzoeken van therapeutische reacties in verschillende longkankersubtypen.
- Toekomstige studies kunnen deze methode gebruiken om nieuwe behandelingsstrategieën te verkennen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Establishing physiologically relevant orthotopic lung cancer models remains a bottleneck in preclinical oncology due to low engraftment efficiency. This method addresses a critical discovery-stage challenge by enhancing tumor cell take rates through airway preconditioning, enabling more reliable assessment of tumorigenic capacity. Improved model fidelity supports better go/no-go decisions in target validation and lead identification by reducing biological noise and increasing predictive confidence in downstream therapeutic screening.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in physiologically relevant lung microenvironment.
- Operational Value: Increases engraftment efficiency from 0-17% to 71-100%, reducing animal use and experimental variability.
- Strategic Value: Supports target de-risking by allowing consistent tumorigenic capacity assessment across mouse strains and tumor origins.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable bioluminescent readouts for longitudinal tumor burden monitoring.
- Operational Value: Standardizes orthotopic engraftment procedure across diverse murine models and cell sources.
- Strategic Value: Facilitates scalable screening of therapeutic agents in models that recapitulate lung-specific stromal interactions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models metastatic dissemination to distant organs, enabling study of clinically relevant disease progression.
- Operational Value: Works with limiting cell numbers, supporting preclinical testing of patient-derived xenografts and rare biospecimens.
- Strategic Value: Enhances preclinical continuity by linking fibrosis modulation to lung cancer outgrowth and therapeutic response.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, particularly for lung cancer programs where stromal context influences drug response.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on fibrosis-cancer interactions and stromal-mediated tumorigenicity.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative tumor take metrics essential for assay validation and compound prioritization.
- Analytics: Provides longitudinal bioluminescence and histological endpoints for comparative analysis of treatment effects.
- Translational Research: Models lung-to-organ metastasis, enabling evaluation of anti-metastatic strategies in vivo.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for engrafting diverse lung cancer subtypes across strains, reducing model development time.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in tumorigenicity assays by reducing false-negative engraftment rates.
- Operational Value: Requires only 10-20 minutes per cage of five mice, supporting high-throughput model generation.
- Strategic Value: Enables risk-adjusted advancement by improving model reliability in preclinical efficacy studies.
- Portfolio Impact: Supports prioritization of lung cancer targets with enhanced preclinical validation in orthotopic settings.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine intubation and intratracheal injection techniques.
- Necessitates biosafety precautions for bleomycin handling, including use of a biohazard hood and proper waste disposal.
- Depends on access to bioluminescence imaging infrastructure for longitudinal engraftment monitoring.
- Requires standardization of bleomycin dosing and 14-day injury-to-engraftment interval across sites.
- Limited to immunocompromised or syngeneic models where engraftment is measurable; not applicable to immunocompetent syngeneic models without adaptation.
