Name: Ruimtelijke en temporele controle van T cel activatie met behulp van een Photoactivatable-Agonist (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Leer een beeldvormingsmethode om T-lymfocyten te activeren met behulp van fotoactiveerbare peptide-MHC. Deze techniek biedt ruimtelijke en temporele controle over T-celactivatie en helpt onderzoekers bij het bestuderen van gepolariseerde signaaloverdracht in immuuncellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken de leden van de lab Huse voor advies en hulp. Ondersteund door de Amerikaanse National Institutes of Health (R01-AI087644 naar M.H.) en P30-CA008748 aan Memorial Sloan-Kettering Cancer Center.

1. bereiding van stimulerend glazen oppervlakken
<ol><li>Jas acht-well chambered dekglaasje met biotinyleerd poly-L-lysine (Bio-PLL) verdund 1:500 in gedestilleerd, gedeïoniseerd water (ddH2van O). Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (RT).</li>
	<li>Wassen met H2O.</li>
	<li>Droog voor 2 h op RT.</li>
	<li>Blok Bio-PLL gecoate oppervlakken met een blokkeerbuffer (HEPES-gebufferde zoutoplossing [10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl], met 2% BSA) voor 30 min op RT.<ol>
<li>Los 5 mg poly-L-lysine hydrobromide in 1 mL 10 mM NaPO4, pH 8,5.</li>
		<li>Voeg 125 μmol (0.55 mg) van de NHS-Biotine (uit een voorraad van 100 mg/mL in DMSO) en controleer de pH van de reactie. Als de pH lager dan 8,5 is, voeg 2 l 4 N NaOH te verhogen naar tussen pH 8,5 en 9.5.</li>
		<li>Vortex gedurende 30 minuten.</li>
		<li>De reactie met 50 μl van 100 mM glycine opgelost in 20 mM Tris pH 8,0 doven.</li>
		<li>Draaien op volle kracht gedurende 10 minuten en het supernatant overbrengen in een nieuwe buis. Opmerking: Bio-PLL kwaliteit wordt meestal vergeleken met eerdere voorbereidingen door coating seriële tweevoudige verdunningen van het materiaal op een 96-Wells-ELISA-plaat en kwantificeren van biotine inhoud na incubatie met alkalische fosfatase combinatie daar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Buffer met blokkerend verwijderen. Laat geen putten te drogen. Voeg daar (100 µg/mL in blokkeerbuffer). Incubeer gedurende 1 uur bij 4 ° C.</li>
	<li>Wassen in de HBS. Vul in en omkeren kamer dia wells 4 - 5 keer, het verwijderen van HBS uit de putten. Laat geen putten te drogen.</li>
	<li>Voeg de biotinyleerd pMHC liganden en celadhesie-moleculen naar de oppervlakte. Opmerking: MCC en eicellen kunnen worden photocaged door toevoeging van ortho-nitrobenzyl gebaseerd bescherming groepen (bijvoorbeeld nitrophenylethyl (NFE) of nitroveratryloxycarbonyl (NVOC)) aan de ε-amino groep van belangrijke lysines (K12 in MCC, K7 in eicellen). Photocaged MCC en eicellen kunnen worden verkregen van commerciële leveranciers. Na reconstitutie in waterige buffer, zijn ze refolded in bacterially uitgedrukt-E-k en H2-Kb met behulp van vastgestelde benaderingen11,12.</li>
	<li>Validatie van de MCC of eicellen peptide photoactivatable<ol>
<li>Decage NVOC-beschermd peptiden door UV bestralen met een handbediende UV-lamp (Zie Tabel of Materials) voor 20 min op RT.</li>
		<li>Pulse 1.0 x 105 APCs met 1 µM van nonstimulatory peptide (negatieve controle, bijvoorbeeld Hb), bestraalde photoactivatable peptide, peptide van bestraalde photoactivatable, en agonist peptide (positieve controle, bijvoorbeeld, MCC) voor 1 h overnachting bij 37 ° C.</li>
		<li>Ter stimulering van T cellen uiten de 5C. C7/2B4/en TCR, CH12 of CH27 B cellen gebruiken. Om te stimuleren OT1 T-cellen, door RMA-s of EL4 thymoom cellen te gebruiken.</li>
		<li>Meng de gepulste APCs met een gelijk aantal T-cellen in 96-Wells ronde bodem platen op een eindvolume van 200 µL. Incubeer bij 37 ° C gedurende 12-24 uur.</li>
		<li>Herstellen van het supernatant van elk putje en IL-2 door ELISA met streptavidine-horseradish peroxidase colorimetrische detectie te analyseren. Opmerking: Bevestiging van de caging status van alle peptiden door electrospray massaspectrometrie voorafgaand aan uiteinde naar MHC complexen, wordt sterk aanbevolen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Het uitvoeren van de vouwen en zuivering van MHC om te minimaliseren van de blootstelling aan licht. Bijvoorbeeld, wikkel vouwen reacties in aluminiumfolie en gel filtratie chromatografie verrichten met de UV-lamp uit. Opmerking: Het is gevonden dat photoactivatable MCC-ik-Ek en eicellen - H2-Kb induceren UV onafhankelijke T-cel activatie bij hoge dichtheid, mogelijk als gevolg van onvolledige functionele kooien. Vandaar, de photoactivatable pMHC wordt verdund in een 10-30 x overmaat van nonstimulatory pMHC (b.v. -Ek met de peptide64-76 hemoglobine (Hb)) tijdens de stap van immobilisatie. Dit verbetert de signaal / ruisverhouding van de latere imaging experiment.</li>
	<li>Te photoactivate CD4+ T cellen, collectief gebruik een mengsel van biotinyleerd Hb-ik-Ek (3 µg/mL), biotinyleerd photoactivatable MCC-ik-Ek (0,1 µg/mL) en biotinyleerd antilichaam tegen de klasse ik MHC H2-Kk (0,5 µg / mL). het antilichaam van de anti-H2-Kk moedigt 5 C. C7/2B4/en T-cellen, die express H2-Kk, te verspreiden op het glazen oppervlak zonder activering ondergaan.</li>
	<li>Voor CD8+ T cellen, gebruik een mengsel van H2-Db rekening houdend met de peptide KAVYDFATL biotinyleerd (1 µg/mL), biotinyleerd photoactivatable eicellen-H2-Kb (0,1 µg/mL), en het extracellulaire domein van de adhesie molecuul ICAM-1 (2 µg Mo/mL geproduceerd door insecten cel cultuur13). De ICAM-1 moedigt nauwe contact vorming door de integrine LFA1 op het celoppervlak van de T.</li>
	<li>Toepassing van alle eiwitten mengsels in de blokkeerbuffer, gevolgd door incubatie gedurende 1 h op RT of ten minste 2 uur bij 4 ° C. Opmerking: Het moleculaire dichtheid op oppervlakken van dit soort worden ~ 8000 per µm2 geweest vooraf bepaalde6. Gezien het feit dat photoactivatable pMHC ~1/30 vertegenwoordigt zullenth van het biotinyleerd-eiwit op het oppervlak, de dichtheid ~ 267 moleculen per µm2, vóór decaging.</li>
	<li>Wassen zoals in stap 1.6 en verlaten in HBS tot klaar voor gebruik.</li>
	<li>Toevoegen van 200.000 CD4+ of CD8+ T cellen uiten de juiste TCR in elk putje en toestaan cellen te houden bij 37 ° C gedurende 15 minuten. Zodra de cellen hebt aangesloten op en verspreid op het oppervlak, ze zijn klaar voor photoactivation en beeldbewerking. Opmerking: Retrovirale transductie van effector T cellen met fluorescerende imaging sondes in detail buitenaf6,7wordt beschreven. Calcium signalering kan ook worden bestudeerd met behulp van untransduced T-cellen geladen met de calcium-gevoelige kleurstof Fluo-4-6. De kleurstof ratiometric Fura-2 wordt afgeraden omdat het vereist excitatie in de UV-reeks, die ook induceert decaging van de photoactivatable pMHC.</li>
</ol>2. de Beeldacquisitie
<ol><li>Gebruik een omgekeerde TIRF Microscoop uitgerust met een objectief van UV compatibel 150 X voor Beeldacquisitie. UV bestralen gebruiker gedefinieerde regio's met een digitale membraan systeem gekoppeld aan een 100 W kwik lamp (HBO). Directe UV-licht van deze lamp op het monster met behulp van een 400 nm lange pass spiegel.</li>
	<li>Gebruik de software van de analyse van de afbeelding voor gelokaliseerde photoactivation en time-lapse overname. In de meeste experimenten, controleren sondes in de groene en rode kanalen met behulp van 488 nm en 561 nm excitatie lasers, respectievelijk. Laserlicht is gericht op het monster met behulp van een dual-Bandfilter dichroïde spiegel die ook in het UV-bereik doorgeeft (om decaging). Zie de Tabel van materialen en Figuur 6 voor aanvullende informatie over de configuratie van de Microscoop.</li>
	<li>Na het mounten van de dia van de kamer met de T-cellen, instellingen aanpassen zodat verkrijgen van TIRF of epifluorescence verlichting, als dit nodig is. In de live-modus, selecteert u een veld van cellen die zijn uiting van de fluorescerende probe(s) van belang. Micron-schaal gebieden voor photoactivation onder de individuele cellen met behulp van softwarecontrole vast.</li>
	<li>Time-lapse overname beginnen. Doorgaans 80 timepoints worden overgenomen, met een interval van 5 s tussen elk punt van de tijd. Dit laat meer dan genoeg tijd voor sequentiële 488 nm en 563 nm posities, in het geval van dubbele kleur experimenten.</li>
	<li>Na 10 timepoints, photoactivate de geselecteerde regio's door het openen van het digitale middenrif sluitertijd voor 1-1.5 s.</li>
	<li>Nadat de time-lapse voltooid is, selecteert u een nieuw veld van cellen en herhaal het proces.</li>
</ol>3. de gegevensanalyse
Opmerking: Vertaalde photoactivation van geïmmobiliseerdet liganden maakt een welomschreven, stationaire stimulerend gebied dat kan worden gebruikt voor de kwantitatieve analyse van de reacties en cytoskeletal remodelleert evenementen signalering. Analyse protocollen zijn gewoonlijk kwantificeren van de intensiteit van de fluorescentie in het bestraalde gebied of met behulp van de bestraalde regio als een positionele eindpunt voor afstandsmetingen (bv. voor de beoordeling van de polarisatie van het centrosoom aan de bestraalde regio). Beide protocollen van de analyse worden hieronder beschreven. Diverse interactieve afbeelding analyse programma's kunnen worden gebruikt om intensiteit en afstandsmeting, die vervolgens uitgevoerd voor extra verwerking en analyse worden kunnen te maken.
<ol><li>
Intensiteit van de fluorescentie
	<ol>
<li>Het bepalen van de intensiteit van de fluorescentie (FI) van een gebied op de achtergrond buiten de cel (FIb). Dit zal worden gebruikt voor achtergrondcorrectie.<ol>
<li>Teken een micron middelgrote vierkante regio buiten de cel en maak een masker. Om te bepalen van de intensiteit van de fluorescentie, klik op de Analyze | Maskeren van statistieken. Selecteer Bedoel fluorescentie intensiteit en de waarden worden geëxporteerd. Opmerking: Procedurele details (bijvoorbeeld 3.1.1.1) verwijzen naar Slidebook software (Zie Tabel van materialen). Uitvoering van dit protocol, met behulp van andere softwarepakketten (bv., FIJI) zal er iets anders uitzien.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Bepaal de FI binnen de photoactivated regio voor elk punt van de tijd.<ol>
<li>Selecteer masker wil de regio die photoactivated was. Om te bepalen van de intensiteit van de fluorescentie, klik op de Analyze | Maskeren van statistieken. Selecteer Bedoel fluorescentie intensiteit en de waarden worden geëxporteerd.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Aftrekken van de achtergrond FI van de meetwaarden van de FI binnen de regio. Vervolgens het normaliseren van de gecorrigeerde FI metingen door te delen door het gemiddelde, achtergrond verbeterd FI van de eerste 9 frames voor photoactivation. ΔF/F = ((FI-FIb)/mean(FI1-9)-FI-b)). Opmerking: Grafiek ΔF/F als functie van de tijd.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Afstand
	<ol>
<li>Verkrijgen van de x- en y-coördinaten van het middelpunt van de photoactivated-regio.<ol>
<li>Om de x en y coördinaten van het middelpunt van de regio photoactivated, selecteer masker wil de regio die photoactivated was. Zodra de regio van photoactivation wordt gemarkeerd, selecteert u analyseren | Maskeren van statistieken | Centrum voor gebied en de waarden worden geëxporteerd.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Bepalen van de x- en y-coördinaten voor de fluorescente sonde van belang voor elk punt van de tijd. Dit wordt meestal bereikt door handmatige of geautomatiseerde deeltje bijhouden.<ol>
<li>Om te bepalen van de x- en y-coördinaten van de fluorescente sonde van belang, selecteer Handleiding Particle volgen en klik op de fluorescente sonde van belang na verloop van tijd. Zodra alle tijdstippen zijn bijgehouden, selecteer analyseren | Maskeren van statistieken | Centrum voor gebied en de waarden worden geëxporteerd.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Berekenen van de afstand tussen de fluorescente proteïne van belang en het centrum van de photoactivated-regio voor elk punt van de tijd met behulp van de vergelijking: afstand = √ ((x2- x1)2+ (y2-y1)2), waarin x2 en y zijn2 de coördinaten van de fluorescente proteïne van belang en x1 en y1 zijn de coördinaten van het middelpunt van de photoactivated-regio.</li>
		<li>Grafiek de afstand als een functie van de tijd.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Dustin, M. L., Chakraborty, A. K., Shaw, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+structure+and+function+of+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.Perspect.Biol%22%5BJournal%5D)">Understanding the structure and function of the immunological synapse.</a> Cold Spring Harb.Perspect.Biol. 2, a002311(2010).</li>
<li>Liu, X., Huse, M. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/chapter/10.1007/978-3-319-14463-4_11">Immunological Synapse Formation: Cell Polarity During T Cell-APC Interaction.</a> Cell Polarity 1. , 247-275 (2015).</li>
<li>Bunnell, S. C., Kapoor, V., Trible, R. P., Zhang, W., Samelson, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+actin+polymerization+drives+T+cell+receptor-induced+spreading%3A+A+role+for+the+signal+transduction+adaptor+LAT%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Dynamic actin polymerization drives T cell receptor-induced spreading: A role for the signal transduction adaptor LAT.</a> Immunity. 14, 315-329 (2001).</li>
<li>Dustin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+Function+of+the+Immunological+Synapse+from+Studies+with+Supported+Planar+Bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Current+topics+in+microbiology+and+immunology%22%5BJournal%5D)">Insights into Function of the Immunological Synapse from Studies with Supported Planar Bilayers.</a> Current topics in microbiology and immunology. 340, (2010).</li>
<li>Chauveau, A., Le Floc'h, A., Bantilan, N. S., Koretzky, G. a, Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diacylglycerol+kinase+%CE%B1+establishes+T+cell+polarity+by+shaping+diacylglycerol+accumulation+at+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Signal%22%5BJournal%5D)">Diacylglycerol kinase α establishes T cell polarity by shaping diacylglycerol accumulation at the immunological synapse.</a> Sci. Signal. 7, ra82(2014).</li>
<li>Huse, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+Temporal+Dynamics+of+T+Cell+Receptor+Signaling+with+a+Photoactivatable+Agonist%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Spatial and Temporal Dynamics of T Cell Receptor Signaling with a Photoactivatable Agonist.</a> Immunity. 27, 76-88 (2007).</li>
<li>Quann, E. J., Merino, E., Furuta, T., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+diacylglycerol+drives+the+polarization+of+the+microtubule-organizing+center+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Localized diacylglycerol drives the polarization of the microtubule-organizing center in T cells.</a> Nat Immunol. 10, 627-635 (2009).</li>
<li>Basu, R., Chen, Y., Quann, E. J., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+variable+hinge+region+of+novel+PKCs+determines+localization+to+distinct+regions+of+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The variable hinge region of novel PKCs determines localization to distinct regions of the immunological synapse.</a> PLoS One. 9, 1-8 (2014).</li>
<li>Liu, X., Kapoor, T. M., Chen, J. K., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diacylglycerol+promotes+centrosome+polarization+in+T+cells+via+reciprocal+localization+of+dynein+and+myosin+II%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Diacylglycerol promotes centrosome polarization in T cells via reciprocal localization of dynein and myosin II.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 11976-11981 (2013).</li>
<li>Quann, E. J., Liu, X., Altan-Bonnet, G., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cascade+of+protein+kinase+C+isozymes+promotes+cytoskeletal+polarization+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">A cascade of protein kinase C isozymes promotes cytoskeletal polarization in T cells.</a> Nat. Immunol. 12, 647-654 (2011).</li>
<li>Boniface, J. J., Reich, Z., Lyons, D. S., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamics+of+T+cell+receptor+binding+to+peptide-MHC%3A+evidence+for+a+general+mechanism+of+molecular+scanning%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Thermodynamics of T cell receptor binding to peptide-MHC: evidence for a general mechanism of molecular scanning.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 11446-11451 (1999).</li>
<li>Garboczi, D. N., Hung, D. T., Wiley, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HLA-A2-peptide+complexes%3A+refolding+and+crystallization+of+molecules+expressed+in+Escherichia+coli+and+complexed+with+single+antigenic+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">HLA-A2-peptide complexes: refolding and crystallization of molecules expressed in Escherichia coli and complexed with single antigenic peptides.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 3429-3433 (1992).</li>
<li>Huse, M., Lillemeier, B. F., Kuhns, M. S., Chen, D. S., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cells+use+two+directionally+distinct+pathways+for+cytokine+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">T cells use two directionally distinct pathways for cytokine secretion.</a> Nat. Immunol. 7, 247-255 (2006).</li>
<li>Abeyweera, T. P., Merino, E., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+signaling+blocks+activating+receptor+clustering+and+induces+cytoskeletal+retraction+in+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Inhibitory signaling blocks activating receptor clustering and induces cytoskeletal retraction in natural killer cells.</a> J. Cell Biol. 192, 675-690 (2011).</li>
<li>Nguyen Duc, T., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Generalizable+Platform+for+the+Photoactivation+of+Cell+Surface+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">A Generalizable Platform for the Photoactivation of Cell Surface Receptors.</a> ACS Chem. Biol. 10, 2435-2440 (2015).</li>
<li>Airan, R. D., Thompson, K. R., Fenno, L. E., Bernstein, H., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporally+precise+in+vivo+control+of+intracellular+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Temporally precise in vivo control of intracellular signalling.</a> Nature. 458, 1025-1029 (2009).</li>
<li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+chemokine+receptor+signal+and+T-cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of chemokine receptor signal and T-cell migration.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 111, 6371-6376 (2014).</li>
<li>Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+control+of+cell+signalling+using+a+light-switchable+protein+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction.</a> Nature. 461, 997-1001 (2009).</li>
<li>Guntas, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+an+improved+light-induced+dimer+%28iLID%29+for+controlling+the+localization+and+activity+of+signaling+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Engineering an improved light-induced dimer (iLID) for controlling the localization and activity of signaling proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 112-117 (2015).</li>
<li>Wu, Y. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+photoactivatable+Rac+controls+the+motility+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded photoactivatable Rac controls the motility of living cells.</a> Nature. 461, 104-108 (2009).</li>
<li>Pathak, G. P., Vrana, J. D., Tucker, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+cell+function+using+engineered+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+cell%2Funder+auspices+Eur.+Cell+Biol.+Organ%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of cell function using engineered photoreceptors.</a> Biol. cell/under auspices Eur. Cell Biol. Organ. 105, 59-72 (2014).</li>
<li>Grusch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatio-temporally+precise+activation+of+engineered+receptor+tyrosine+kinases+by+light%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Spatio-temporally precise activation of engineered receptor tyrosine kinases by light.</a> EMBO J. 33, 1713-1726 (2014).</li>
<li>Yi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrosome+repositioning+in+T+cells+is+biphasic+and+driven+by+microtubule+end-on+capture-shrinkage%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Centrosome repositioning in T cells is biphasic and driven by microtubule end-on capture-shrinkage.</a> J. Cell Biol. 202, 779-792 (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In de afgelopen jaren heeft licht ontpopt als een uitstekend hulpmiddel voor spatiotemporally gecontroleerde activering van cellulaire processen. Verschillende methoden zijn ontwikkeld, elk met de bijbehorende voordelen en nadelen. Het systeem hier beschreven, die is gebaseerd op de decaging van geïmmobiliseerdet, extracellulaire ligand, is bij uitstek geschikt voor de analyse van snelle, subcellular, gepolariseerde signalering reacties. Deze aanpak is vereffend te onderzoeken IS vorming in T cellen zoals hierboven besch...

T-lymfocyten (T-cellen) spelen een centrale rol in de cellulaire immuniteit door de erkenning van de antigene peptiden in het kader van het celoppervlak MHC weergegeven. Antigeen erkenning, dat is bemiddeld door de TCR, drijft de differentiatie van naïeve T cellen en bevordert de levering van de cytolytische en communicatieve antwoorden van effector populaties. TCR betrokkenheid induceert ook dramatische veranderingen in cellulaire architectuur. Binnen enkele minuten de T-cellen gloms op de kant van de antigeen-presenteren cel (APC), vormen een gepolariseerde interface genoemd de immunologische synapse (IS)1,2. Het IS potentiates T cel effector reacties doordat de directionele release van cytokines of, in het geval van cytotoxische T-lymfocyten (CTL's), lytische eiwitten die de APC vernietigen.
TCR betrokkenheid door pMHC induceert de snelle fosforylatie van meerdere stroomafwaartse adapter moleculen, met inbegrip van de Linker voor de activering van T-cellen (LAT), die uiteindelijk bevordert robuuste remodelleren van de synaptische cytoskelet2. Corticale filamenteuze actine (F-actine) T cel verspreiden over het oppervlak van de APC-stations, en vervolgens moet omzetten naar een ringvormige structuur gekenmerkt door ophoping van de F-actine onderaan de IS periferie en de uitputting van het centrum. F-actine ring vorming is het strak gekoppeld aan de heroriëntering van het organiserende centrum van microtubuli (MTOC, ook wel de centrosoom in T-cellen) naar een positie net onder het midden van de interface. Beide gebeurtenissen zich voordoen binnen enkele minuten van de eerste antigeen erkenning en stellen de architecturale context waarin de activering van de daaropvolgende gebeurtenissen en effector reacties optreden.
Studeren IS vorming, hebben verschillende labs benaderingen waarbij de APC is vervangen door een glazen oppervlak, dat geïmmobiliseerdet TCR liganden bevat of ondersteunt een lipide dubbelgelaagde dat zelf de liganden3,4 bevatontwikkeld. T-cellen vormen IS-achtige contacten op deze oppervlakken die image kunnen worden gemaakt door de totale interne reflectie fluorescentie Microscoop (TIRF) of confocale microscopie, waardoor hoge resolutie studies van vroege T-cel activatie en IS vorming.
Hoewel deze benaderingen hebben toegestaan voor uitstekende visualisatie van het volledig geassembleerde IS, plaatsvindt veel van de signalering volgende TCR:pMHC afbinding binnen seconden, complicerende inspanningen om te bepalen van de volgorde van de gebeurtenissen na de activering van de TCR nauwkeurig . Om dit probleem te omzeilen, een photoactivation aanpak ontwikkeld, waarin photoactivatable pMHC wordt gebruikt om spatio controle over TCR activering5,6,7. In dit systeem, zijn T-cellen gekoppeld aan glazen oppervlakken met photoactivatable pMHC thats niet-stimulerend voor de TCR totdat bestraald met ultraviolet (UV) licht. UV bestraling van een regio van de micron grootte van het oppervlak onder de T cel verwijdert het creëren van een stimulerend zone die kan worden herkend door de T-cel photocage. Daaropvolgende signalering gebeurtenissen en cytoskeletal remodeling worden vervolgens gecontroleerd met behulp van genetisch gecodeerde fluorescerende verslaggevers. Twee versies van de photoactivatable van antigene peptides, nachtvlinder cytochroom c88-103 (MCC) en ovoalbumine257-264 (OVA), die worden gepresenteerd in het kader van de klasse II MHC-Ek en de klasse ik MHC H2-Kb, respectievelijk, zijn geweest ontwikkeld (Figuur 1). Dit maakt de analyse van beide CD4+ T cellen specifiek voor MCC-ik-Ek (uiting van de 5 C. C7, 2B4, of en TCRs) en CD8+ T cellen specifiek voor eicellen-H2-Kb (uiten de OT1 TCR).
In het afgelopen decennium, is de TCR photoactivation en imaging aanpak gebruikt om de precieze kinetiek van vroege TCR signalering stappen, en ook om te identificeren van de moleculaire pathways bestuur gepolariseerde cytoskeletal remodelleert5, 6 , 7 , 8 , 9 , 10. de bepaling was bijvoorbeeld instrumentaal bij het bepalen van die centrosoom heroriëntatie naar de APC wordt gemedieerd door een gelokaliseerde verloop van het lipide tweede boodschapper diacylglycerol gecentreerd op de IS. Verwacht wordt dat deze methode zal waardevol zijn voor toepassingen die hoge resolutie beeldvormende analyse van T-cel functie vereisen.

<table><tbody><tr><td>Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass</td><td>Thermofischer Scientific</td><td>155361</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine hydrobromide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td>Zal Biotinyleerde Poly-L-Lysine moeten maken</td></tr><tr><td>EZ-Link NHS-Biotin</td><td>Thermofischer Scientific</td><td>20217</td><td>Zal Biotinyleerde Poly-L-Lysine moeten maken</td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>Thermofischer Scientific</td><td>434301</td><td></td></tr><tr><td>BirA-500: BirA biotin-protein ligase standard reaction kit</td><td>Avidity</td><td>BirA500</td><td>Zal worden gebruikt om eiwitten te biotinyleren</td></tr><tr><td>Biotinyleerde Hb I-EK&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Voor eiwitvouwing, zie referentie 6. Voor biotinylering, gebruik BirA kit</td></tr><tr><td>Biotinyleerde NPE-MCC I-EK&nbsp;</td><td>Anaspec</td><td></td><td>Aangepaste NPE-MCC (H-ANERADLIAYL-K(Nvoc)-QATK-OH) kan worden gekocht bij Anaspec</td></tr><tr><td>Biotinyleerde &alpha;H2-Kk antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>553591</td><td></td></tr><tr><td>Biotinyleerde NPE-OVA H2-Kb</td><td>Anaspec</td><td></td><td>Aangepaste NPE-OVA (H-SIINFE-K(Nvoc)-L-OH) kan worden gekocht bij Anaspec</td></tr><tr><td>Biotinyleerde KAVY H2-Db&nbsp;</td><td>Anaspec</td><td></td><td>Aangepast gesynthetiseerd eiwit (KAVYDFATL) kan worden gekocht bij Anaspec</td></tr><tr><td>Biotinyleerde ICAM1&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Voor eiwitvouwing, zie referentie in protocol. Voor biotinylering, gebruik BirA kit</td></tr><tr><td>Hand held UV lamp</td><td>UVP</td><td>UVGL-25</td><td>Lamp wordt &lt; 1 cm van het monster gehouden.&nbsp; 30 s van 365 licht is voldoende voor detecteerbare decaging, 20 min voor kwantitatieve decaging.</td></tr><tr><td>Olympus IX-81 OMAC TIRF system.</td><td>Olympus</td><td></td><td>Aanvullende informatie over het beeldvormingssysteem is te vinden in Figuur 6</td></tr><tr><td>Mosaic digital diaphragm</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slidebook software</td><td>Intelligent Imaging Innovations</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ruimtelijke en temporele controle van t cel activatie met behulp van een photoactivatable-agonist

Spatial and Temporal Control of T Cell Activation Using a Photoactivatable Agonist

T-lymfocyten zich bezighouden met het snelle, gepolariseerde signalering, die zich voordoen binnen enkele minuten na activering van de TCR. Dit induceert de vorming van de immunologische SYNAPS, een stereotiepe cel-cel-knooppunt dat regelt van T cel activatie en gerichte doelen effector reacties. Deze processen effectief studeren, is een imaging aanpak die is aangepast voor het vastleggen van snelle, gepolariseerde antwoorden nodig. Dit protocol beschrijft een dergelijk systeem, dat gebaseerd is op een photoactivatable peptide-major histocompatibility complex (pMHC) dat is niet-stimulerend totdat het wordt blootgesteld aan ultraviolet licht. Gerichte decaging van dit reagens tijdens videomicroscopy experimenten kan nauwkeurige Spatio controle van TCR activering en hoge resolutie controle van latere cellulaire reacties door de totale interne reflectie (TIRF) imaging. Deze aanpak is ook compatibel met genetische en farmacologische perturbation strategieën. Dit zorgt voor de vergadering van welomschreven moleculaire trajecten die link TCR signalering tot de vorming van de gepolariseerde cytoskeletal structuren die ten grondslag liggen aan de immunologische synaps.

De photoactivation en imaging aanpak zorgt voor observatie en facile kwantificering van snelle, gepolariseerde signalering antwoorden. Ter illustratie van de mogelijkheden, gereproduceerd hier is een experiment dat onderzoekt de spatio correlatie tussen TCR-geïnduceerde DAG accumulatie en centrosoom heroriëntatie. 5C. Waren retrovirally getransduceerde C7 T cel ontploffing met twee fluorescerende verslaggevers: een DAG biosensor met de tandem C1 domeinen van proteïne kinase C-θ gekoppeld ...

Dit protocol beschrijft een imaging gebaseerde methode om te activeren met behulp van photoactivatable peptide-MHC, waardoor nauwkeurige Spatio controle van T cel activatie van T-lymfocyten.

Ruimtelijke en temporele controle van T cel activatie met behulp van een Photoactivatable-Agonist

T lymphocytes engage in rapid, polarized signaling, occurring within minutes following TCR activation. This induces formation of the immunological ...

Het algemene doel van dit protocol is om het gebruik van fotoactiveerbaar peptide MHC te beschrijven om gepolariseerde signalering in T-lymfocyten te induceren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in signaaltransductie van immuuncellen, zoals hoe lymfocyten snelle lokale signalen transduceren en vervolgens gepolariseerde cellulaire reacties op die signalen opbouwen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze ruimtelijk-tijdelijke controle van T-celsignalering biedt.Het doet dit door het precieze tijdstip en de locatie van T-celreceptoractivatie te fixeren. De procedure zal worden gedemonstreerd door Elisa Sanchez, een afstudeerstudent uit mijn laboratorium. Begin met het toevoegen van biotinyleren poly-L-lysine, of bio-PLL, verdund één op 500 in gedistilleerd gedeïoniseerd water, aan een acht-kamerige bedekt glazen deksel.Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Na de incubatie, was met gedistilleerd gedeïoniseerd water en droog vervolgens twee uur bij kamertemperatuur. Blokkeer bio-PLL beklede oppervlakken met blokkeringsbuffer bestaande uit HEPES-gebufferd zoutoplossing met 2% BSA gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.Na de incubatie, verwijder de blokkeringsbuffer van de bio-PLL-gecoate oppervlakken zonder de putjes te laten drogen. Voeg vervolgens streptavidin toe en incubeer bij vier graden Celsius. Na een uur, was de gecoate oppervlakken in HBS.Vul en draai de putjes van de kamerslide vier tot vijf keer om HBS uit de putjes te verwijderen. Laat de putjes niet drogen. Voeg de specifieke biotinyleren fotoactiveerbare peptide major histocompatibility complex liganden en adhesiemoleculen voor CD4-positieve T-cellen of CD8-positieve cellen toe aan de bio-PLL-gecoate oppervlakken.Bescherm tegen licht en incubeer gedurende één uur bij kamertemperatuur. Na de incubatie, was zoals eerder en laat in HBS tot het klaar is om te zaaien. Voeg tenslotte 200.000 CD4-positieve of CD8-positieve T-cellen toe die het juiste TCR tot expressie brengen in de juiste putjes en laat de cellen aanhechten bij 37 graden Celsius gedurende 15 minuten.Zodra de cellen zich hebben gehecht en zich op het oppervlak hebben verspreid, zijn ze klaar voor fotoactivering en beeldvorming. Gebruik een omgekeerde totale interne reflectiefluorescentiemicroscoop uitgerust met een UV-compatibele 150X objectieflens voor beeldverwerving. Bewaak sondes in zowel het groene als het rode kanaal met behulp van 488 nanometer en 561 nanometer excitatielasers, respectievelijk.Na het plaatsen van de kamerslide met de T-cellen, pas de microscoopinstellingen aan om TIRF- of epifluorescentie-verlichting te verkrijgen, indien nodig. In Live-modus, selecteer een veld met cellen die de fluorescente sondes van belang tot expressie brengen. Bepaal micronschaalgebieden voor fotoactivering onder individuele cellen met behulp van softwarebesturing.Begin vervolgens met de verwerving. Typisch zijn 80 tijdstippen vereist met een interval van vijf seconden tussen elk. Dit laat tijd voor sequentiële 488 nanometer en 563 nanometer belichtingen in het geval van dubbelkleurexperimenten.Vervolgens, na het verwerven van 10 tijdstippen, fotoactiveer de geselecteerde gebieden door de digitale diafragma-sluiter gedurende één tot 1,5 seconden te openen. Nadat de time-lapse voltooid is, selecteer een nieuw veld met cellen en herhaal het proces. Begin door de fluorescentie-intensiteit van een achtergrondgebied buiten de cel te bepalen die wordt gebruikt voor achtergrondcorrectie.Teken een micron-grote vierkante regio buiten de cel en maak een masker. Om de fluorescentie-intensiteit te bepalen, klik op Analyseren, Maskerstatistieken. Selecteer Gemiddelde fluorescentie-intensiteit en exporteer de waarden.Bepaal de fluorescentie-intensiteit binnen het fotogeactiveerde gebied voor elk tijdstip. Selecteer Masker om het fotogeactiveerde gebied te markeren. Om de fluorescentie-intensiteit te bepalen, klik op Analyseren, Maskerstatistieken.Selecteer Gemiddelde fluorescentie-intensiteit en exporteer de waarden. Verkrijg de X- en Y-coördinaten van het centrum van het fotogeactiveerde gebied door Masker te selecteren om het fotogeactiveerde gebied te markeren. Zodra het gebied van fotoactivering is gemarkeerd, selecteer Analyseren, Maskerstatistieken, Centrum van Gebied en Exporteer de waarden.Bepaal de X- en Y-coördinaten van de fluorescente sonde van belang. Selecteer Handmatig Deeltje Volgen en klik op de fluorescente sonde van belang over tijd. Zodra alle tijdstippen zijn gevolgd, selecteer Analyseren, Maskerstatistieken, Centrum van Gebied en Exporteer de waarden.T-cellen werden bevestigd aan bedekt glazen deksel bevattende fotoactiveerbaar MCC-IEFK. C1-GFP, een sonde voor de lipide tweede boodschapper DAG, werd geïmagerd met behulp van TIRF-microscopie en RFP-Tubulin in epifluorescentiemodus. Lokale fotoactivering van het oppervlak onder de T-cel induceert de accumulatie van DAG in de bestraalde zone.Dit wordt binnen enkele seconden gevolgd door de heroriëntatie van het centrosoom naar hetzelfde gebied. C1-GFP-accumulatie kan worden gekwantificeerd door de genormaliseerde fluorescentie-intensiteit na achtergrondcorrectie bij het centrum van het fotogeactiveerde gebied te berekenen over tijd. Centrosoom-heroriëntatie als reactie op fotoactivering kan worden gekwantificeerd door de afstand tussen het centrosoom en het centrum van het fotogeactiveerde gebied als functie van de tijd te berekenen.Eenmaal beheerst, kan deze techniek in minder dan een dag worden uitgevoerd als deze correct wordt uitgevoerd. We genereren doorgaans 15 tot 20 time-lapse films voor analyse in deze tijd. Deze aanpak heeft de weg geëffend voor onderzoekers om de precieze kinetiek en polarisatie van activerende signalering in T-cellen te onderzoeken.Het werd ook aangepast om remmende signalering in natuurlijke killercellen te bestuderen. Als gevolg hiervan hebben we nu een beter begrip van hoe communicatieve immuuncel-celinteracties worden samengesteld en ontbonden.</

spatial-temporal-control-t-cell-activation-using-photoactivatable

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Werkwijze voor tijdruimtelijke controle kleine GTPase activiteit licht beschreven. Deze methode is gebaseerd op rapamycine-geïnduceerde FKBP-FRB heterodimerisatie en foto-kooien systemen. Optimalisatie van het licht-bestraling kan de ruimtelijk-tijdelijk bestuurd activering van kleine GTPases op het subcellulaire niveau.

Spatio-temporele Manipulatie van kleine GTPase activiteit bij subcellulaire niveau en op de tijdschaal van seconden in levende cellen

De compartimentering van eiwitten, hetzij binnen het plasma membraan of in de intracellulaire locaties is een regulerend mechanisme die sterk kunnen beïnvloeden signalering resultaten, vandaar dat te begrijpen signalering is het van belang het bestuderen van de ruimtelijke en temporele gedrag van de betrokken eiwitten. We beschrijven hier een TIRF microscopie gebaseerde systeem om signaaltransductie in T-cellen te bestuderen, maar is breed toepasbaar.

Een TIRF Microscopie Techniek voor Real-time, gelijktijdige beeldvorming van de TCR en de bijbehorende signaaleiwitten

This video demonstrates a method of decaging a photoactivatable peptide-major histocompatibility complex using UV irradiation. The decaging process exposes the native peptide sequence, enabling precise T cell activation.

Evaluation of Controlled T Cell Activation with a Photoactivatable Peptide MHC

We beschrijven een live-cell imaging methode die inzicht geeft in eiwitdynamica tijdens de T-cel activatie proces. We tonen de totale gebruiksduur van de T-cel verspreiding assay, confocale microscopie en beeldanalyse te geven kwantitatieve resultaten volgen signalering complexvorming in T-cel activatie.

Real-time Live beeldvorming van T-cel signaleringscomplex Vorming

Hier wordt een procedure gepresenteerd om selectief een neuronaal eiwit te activeren met een korte lichtpuls door genetisch een foto-reactieve onnatuurlijke aminozuur te coderen in een doelneuronaal eiwit dat tot expressie wordt gebracht in neuronen in cultuur of in vivo.

Optische controle van een neuronaal proteïne met behulp van een genetisch gecodeerde Onnatuurlijke aminozuren in neuronen

In dit protocol was gekooide proteïne kinase A (PKA), een Cellulaire signaaltransductie bioeffector, geïmmobiliseerd op een oppervlak van nanoparticle, microinjected in het cytosol en geactiveerd door de upconverted UV-licht van nabij-infrarood (NIR) bestraling, inducerende stroomafwaarts stress vezel desintegratie in het cytosol.

Een geïntegreerd systeem op afstand trigger intracellulaire signaaltransductie door Kinase Upconversion Nanoparticle-gemedieerde Photoactivation

Hier presenteren we een protocol te analyseren van cel naar cel overdracht van oscillerende informatie door optogenetic control en live monitoring van genexpressie. Deze aanpak biedt een uniek platform om te testen een functionele betekenis van dynamische gen expressie programma's in meercellige systemen.

Een Optogenetic methode te controleren en analyseren van gen expressiepatronen in cel-naar-cel interacties

Dit protocol beschrijft het gebruik van één keten MHC klasse I complexen te onderzoeken van de moleculaire interacties in menselijke CD8 + T cel activatie: generatie van gemanipuleerde antigeen presentatie van cellen uiten van één keten bouwt, cultuur van menselijke CD8 + T cel kloon en T-cel activatie experimenten.

Gebruik van één keten MHC technologie te onderzoeken van Co-agonisme in menselijke CD8 + T cel activatie

Dit protocol beschrijft de generatie van gemengde lymfkliertest beenmerg chimaeren met spontane auto-immune germinal centra, in welke autoreactieve lymfocyten een photoactivatable groen fluorescent proteïne (PA-GFP) verslaggever dragen. Dit biedt de mogelijkheid om de cellulaire verbindingsplaats in weefsels met stroomafwaartse moleculaire en functionele analyses.

Individuele autoreactieve Germinal Centers door Photoactivation in een gemengd chimeer Model van Autoimmunity ondervragen

Dit protocol beschrijft de toepassing van een gemanipuleerd blauw-licht-geactiveerd allosterisch schakelaar (LightR) domein voor omkeerbare spatiotemporele controle van eiwitactiviteit. Door gebruik te maken van Src-tyrosinekinase als model, biedt deze studie een uitgebreid protocol voor het ontwikkelen en karakteriseren van lichtgereguleerde Src (LightR-Src). Het demonstreert de veelzijdigheid van deze aanpak in alle enzymklassen.

Spatiotemporele controle van eiwitactiviteit door optogenetische allosterische regulatie

Dit protocol beschrijft de essentiële stappen voor de kweek van primaire T-cellen, waaronder hun isolatie, activatie, expansie en tijdelijke transfectie door mRNA-elektroporatie. Daarnaast worden een workflow en antilichaampanel voorgesteld voor flowcytometrische analyse van fenotype, activatiemarkers, levensvatbaarheid en chimere antigeenreceptor (CAR)-expressie.

Isolatie, cultivatie en tijdelijke transfectie van primaire menselijke T-cellen om chimerische antigeenreceptoren (CAR) T-cellen te genereren

Leer een beeldvormingsmethode om T-lymfocyten te activeren met behulp van fotoactiveerbare peptide-MHC. Deze techniek biedt ruimtelijke en temporele controle over T-celactivatie en helpt onderzoekers bij het bestuderen van gepolariseerde signaaloverdracht in immuuncellen.

Ruimtelijke en temporele controle van T cel activatie met behulp van een Photoactivatable-Agonist

Meer video's verkennen