Ruimtelijke en temporele controle van T cel activatie met behulp van een Photoactivatable-Agonist
April 25th, 2018
Dit protocol beschrijft een imaging gebaseerde methode om te activeren met behulp van photoactivatable peptide-MHC, waardoor nauwkeurige Spatio controle van T cel activatie van T-lymfocyten.
Het algemene doel van dit protocol is om het gebruik van fotoactiveerbaar peptide MHC te beschrijven om gepolariseerde signalering in T-lymfocyten te induceren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in signaaltransductie van immuuncellen, zoals hoe lymfocyten snelle lokale signalen transduceren en vervolgens gepolariseerde cellulaire reacties op die signalen opbouwen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze ruimtelijk-tijdelijke controle van T-celsignalering biedt.
Het doet dit door het precieze tijdstip en de locatie van T-celreceptoractivatie te fixeren. De procedure zal worden gedemonstreerd door Elisa Sanchez, een afstudeerstudent uit mijn laboratorium. Begin met het toevoegen van biotinyleren poly-L-lysine, of bio-PLL, verdund één op 500 in gedistilleerd gedeïoniseerd water, aan een acht-kamerige bedekt glazen deksel.
Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Na de incubatie, was met gedistilleerd gedeïoniseerd water en droog vervolgens twee uur bij kamertemperatuur. Blokkeer bio-PLL beklede oppervlakken met blokkeringsbuffer bestaande uit HEPES-gebufferd zoutoplossing met 2% BSA gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
Na de incubatie, verwijder de blokkeringsbuffer van de bio-PLL-gecoate oppervlakken zonder de putjes te laten drogen. Voeg vervolgens streptavidin toe en incubeer bij vier graden Celsius. Na een uur, was de gecoate oppervlakken in HBS.
Vul en draai de putjes van de kamerslide vier tot vijf keer om HBS uit de putjes te verwijderen. Laat de putjes niet drogen. Voeg de specifieke biotinyleren fotoactiveerbare peptide major histocompatibility complex liganden en adhesiemoleculen voor CD4-positieve T-cellen of CD8-positieve cellen toe aan de bio-PLL-gecoate oppervlakken.
Bescherm tegen licht en incubeer gedurende één uur bij kamertemperatuur. Na de incubatie, was zoals eerder en laat in HBS tot het klaar is om te zaaien. Voeg tenslotte 200.000 CD4-positieve of CD8-positieve T-cellen toe die het juiste TCR tot expressie brengen in de juiste putjes en laat de cellen aanhechten bij 37 graden Celsius gedurende 15 minuten.
Zodra de cellen zich hebben gehecht en zich op het oppervlak hebben verspreid, zijn ze klaar voor fotoactivering en beeldvorming. Gebruik een omgekeerde totale interne reflectiefluorescentiemicroscoop uitgerust met een UV-compatibele 150X objectieflens voor beeldverwerving. Bewaak sondes in zowel het groene als het rode kanaal met behulp van 488 nanometer en 561 nanometer excitatielasers, respectievelijk.
Na het plaatsen van de kamerslide met de T-cellen, pas de microscoopinstellingen aan om TIRF- of epifluorescentie-verlichting te verkrijgen, indien nodig. In Live-modus, selecteer een veld met cellen die de fluorescente sondes van belang tot expressie brengen. Bepaal micronschaalgebieden voor fotoactivering onder individuele cellen met behulp van softwarebesturing.
Begin vervolgens met de verwerving. Typisch zijn 80 tijdstippen vereist met een interval van vijf seconden tussen elk. Dit laat tijd voor sequentiële 488 nanometer en 563 nanometer belichtingen in het geval van dubbelkleurexperimenten.
Vervolgens, na het verwerven van 10 tijdstippen, fotoactiveer de geselecteerde gebieden door de digitale diafragma-sluiter gedurende één tot 1,5 seconden te openen. Nadat de time-lapse voltooid is, selecteer een nieuw veld met cellen en herhaal het proces. Begin door de fluorescentie-intensiteit van een achtergrondgebied buiten de cel te bepalen die wordt gebruikt voor achtergrondcorrectie.
Teken een micron-grote vierkante regio buiten de cel en maak een masker. Om de fluorescentie-intensiteit te bepalen, klik op Analyseren, Maskerstatistieken. Selecteer Gemiddelde fluorescentie-intensiteit en exporteer de waarden.
Bepaal de fluorescentie-intensiteit binnen het fotogeactiveerde gebied voor elk tijdstip. Selecteer Masker om het fotogeactiveerde gebied te markeren. Om de fluorescentie-intensiteit te bepalen, klik op Analyseren, Maskerstatistieken.
Selecteer Gemiddelde fluorescentie-intensiteit en exporteer de waarden. Verkrijg de X- en Y-coördinaten van het centrum van het fotogeactiveerde gebied door Masker te selecteren om het fotogeactiveerde gebied te markeren. Zodra het gebied van fotoactivering is gemarkeerd, selecteer Analyseren, Maskerstatistieken, Centrum van Gebied en Exporteer de waarden.
Bepaal de X- en Y-coördinaten van de fluorescente sonde van belang. Selecteer Handmatig Deeltje Volgen en klik op de fluorescente sonde van belang over tijd. Zodra alle tijdstippen zijn gevolgd, selecteer Analyseren, Maskerstatistieken, Centrum van Gebied en Exporteer de waarden.
T-cellen werden bevestigd aan bedekt glazen deksel bevattende fotoactiveerbaar MCC-IEFK. C1-GFP, een sonde voor de lipide tweede boodschapper DAG, werd geïmagerd met behulp van TIRF-microscopie en RFP-Tubulin in epifluorescentiemodus. Lokale fotoactivering van het oppervlak onder de T-cel induceert de accumulatie van DAG in de bestraalde zone.
Dit wordt binnen enkele seconden gevolgd door de heroriëntatie van het centrosoom naar hetzelfde gebied. C1-GFP-accumulatie kan worden gekwantificeerd door de genormaliseerde fluorescentie-intensiteit na achtergrondcorrectie bij het centrum van het fotogeactiveerde gebied te berekenen over tijd. Centrosoom-heroriëntatie als reactie op fotoactivering kan worden gekwantificeerd door de afstand tussen het centrosoom en het centrum van het fotogeactiveerde gebied als functie van de tijd te berekenen.
Eenmaal beheerst, kan deze techniek in minder dan een dag worden uitgevoerd als deze correct wordt uitgevoerd. We genereren doorgaans 15 tot 20 time-lapse films voor analyse in deze tijd. Deze aanpak heeft de weg geëffend voor onderzoekers om de precieze kinetiek en polarisatie van activerende signalering in T-cellen te onderzoeken.
Het werd ook aangepast om remmende signalering in natuurlijke killercellen te bestuderen. Als gevolg hiervan hebben we nu een beter begrip van hoe communicatieve immuuncel-celinteracties worden samengesteld en ontbonden.</
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit protocol beschrijft een beeldvormingsgebaseerde methode om T-lymfocyten te activeren met behulp van fotoactiveerbaar peptide-MHC, waardoor nauwkeurige ruimtelijk-tijdelijke controle van T-celactivering mogelijk wordt. Deze techniek stelt onderzoekers in staat om te onderzoeken hoe lymfocyten snelle gelokaliseerde signalen transduceren en gepolariseerde cellulaire reacties opbouwen.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Immunologie
- Celsignalering
- Neurowetenschappen
Achtergrond
- Het begrijpen van T-celactivering is cruciaal voor onderzoek naar immuunrespons.
- Fotoactiveerbaar peptide-MHC biedt een nieuwe aanpak om T-celsignalering te bestuderen.
- Deze methode maakt onderzoek naar ruimtelijk-tijdelijke dynamica in immuuncellen mogelijk.
- Gepolariseerde signalering in T-lymfocyten is essentieel voor effectieve immuunresponsen.
Doel van het onderzoek
- Om een methode te beschrijven voor het induceren van gepolariseerde signalering in T-lymfocyten.
- Om de mechanismen van snelle gelokaliseerde signaaltransductie in immuuncellen te onderzoeken.
- Om een gedetailleerd protocol voor onderzoekers te bieden om het onderzoek te repliceren.
Gebruikte methoden
- Gebruik van gebiotineerde poly-L-lysine (bio-PLL) in een gekamerd dekglas.
- Toepassing van fotoactiveerbaar peptide-MHC voor T-celactivering.
- Beeldvormingstechnieken om T-celreacties te monitoren.
- Demonstratie van de procedure door een afstudeerstudent.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle activering van T-lymfocyten met nauwkeurige ruimtelijke controle.
- Gedemonstreerde gepolariseerde signalering als reactie op gelokaliseerde stimuli.
- Inzichten verschaft in de dynamica van T-celreceptoractivering.
- Mogelijkheid geboden voor verder onderzoek naar signaaltransductie in immuuncellen.
Conclusies
- Het protocol biedt een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van T-celactivering.
- Ruimtelijk-tijdelijke controle versterkt het begrip van immuunresponsen.
- Deze methode kan leiden tot vorderingen in immunologisch onderzoek.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This protocol enables precise spatiotemporal control of T cell receptor activation, addressing a critical need in immunology and immunotherapy research to dissect rapid, polarized signaling events. By linking TCR stimulation to downstream cytoskeletal reorganization, it provides a mechanistic de-risking tool for target validation in T cell–engaging therapies. The approach supports predictive confidence in early discovery by enabling quantitative, high-resolution monitoring of signal transduction dynamics relevant to biologic and small‑molecule immunomodulator development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by enabling localized TCR activation to clarify signaling pathways leading to immunological synapse formation.
- Operational Value: Supports functional target validation through polarized response readouts such as DAG accumulation and centrosome reorientation.
- Predictive Value: Enhances confidence in target selection by revealing kinetic and spatial parameters of signal transduction critical for immunomodulator efficacy.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated T cell–pMHC interaction systems for downstream compound or antibody screening with controlled activation timing.
- Quantitative Outputs: Enables standardized measurement of fluorescence intensity changes in lipid probes (e.g., C1-GFP) and organelle repositioning as functional readouts.
- Scalability & Reuse: Compatible with genetic and pharmacological perturbations, allowing platform reuse across target classes and perturbation strategies.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models immunological synapse formation, a key process in T cell–mediated immunity relevant to autoimmune, infectious, and oncology indications.
- Translational Continuity: Bridges early signaling events to functional outcomes, supporting risk-adjusted advancement decisions in preclinical models.
- Mechanistic De-risking: Clarifies causality between TCR engagement and cytoskeletal polarization, reducing ambiguity in mechanism-of-action studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis testing in target validation and enabling assay development for immunomodulator screening prior to lead identification.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating TCR activation as an independent variable to probe downstream signaling nodes and pathway dependencies.
- Screening: Delivers assay readiness through reproducible, light-controlled activation and quantifiable fluorescent readouts compatible with automation-friendly imaging.
- Analytics: Generates quantitative dependent variable measurements (e.g., normalized fluorescence intensity, centrosome displacement) that enable condition comparison and signal dynamics modeling.
- Translational Research: Connects molecular initiation events to cellular polarization, aligning with biomarker-linked functional assays in preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for spatiotemporal control applicable across TCR–pMHC pairs and immune cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in early TCR signaling events.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via precise light-controlled activation and quantifiable TIRF‑based readouts.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early assessment of signal fidelity and polarization capacity of immunomodulators.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by linking target engagement to functional synapse formation, a predictor of therapeutic efficacy.
Implementation Considerations
- Requires expertise in T cell culture, fluorescent probe transfection, and total internal reflection fluorescence microscopy.
- Depends on UV-compatible optics, photoactivatable pMHC reagents, and dual‑color imaging infrastructure.
- Necessitates standardization of photoactivation timing, region selection, and background correction across users and sites.
- Involves adaptation considerations for different TCR specificities, fluorescent probes, and immune cell subtypes (e.g., NK cells).
- Practical limitations include phototoxicity risks from UV exposure and the need for rapid image acquisition to capture subsecond signaling dynamics.
