Name: Oprichting van een extracellulaire zure pH cultuur systeem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Leer een in vitro zure pH-cultuurmethode voor oncologisch onderzoek met DMEM en natriumbicarbonaat. Deze techniek onthult mechanismen van tumorprogressie in zure micro-omgevingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken de leden van de afdeling of genoom Science en laboratorium voor systeembiologie en geneeskunde, RCAST, de Universiteit van Tokio. Wij bedanken met name Dr. H. Aburatani, Dr. T. Kodama, (LSBM, RCAST, The University of Tokyo), Dr. K. Tomizuka, Dr. T. Yoshida, en Dr. A. Kunisato (Mizuho Securities Kirin Co., Ltd.) voor nuttige discussies en steun. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Grant-in-Aid voor jonge wetenschapper (A) (26710005), to, Grant-in-Aid voor wetenschappelijkonderzoek op innovatieve gebieden (26116711 en 16 H 01567, to), en Grant-in-Aid voor uitdagend Verkennend onderzoek (16K 14605, to) van het ministerie van onderwijs, cultuur, sport, wetenschap en technologie van Japan, de Takeda Science Foundation (to), de Stichting Kobayashi van kankeronderzoek (to) en het Project voor kankeronderzoek en Therapeutische Evolution (P-maken) en de praktische onderzoek voor innovatieve kankerbestrijding van Japan Agentschap voor medisch onderzoek en ontwikkeling, AMED (to).

1. bereiding van zure kweekmedium
<ol><li>
Voorbereiding van de controle (pH 7.4) en lage-pH (pH 6.8) kweekmedium
	<ol>
<li>Los 4,75 g poeder van de DMEM zonder L-glutamine in 500 mL water.</li>
		<li>Bereid 0.33 M NaHCO3 -oplossing in een druk-strakke fles. Let op: Het is belangrijk om het gebruik van een strakke fles van druk omdat NaHCO3 stoot CO2 gas verwarmd als thermisch ontleed.</li>
		<li>Autoclaaf het medium en oplossing. Toestaan dat deze buffers afkoelen tot 25 ° C.</li>
		<li>Voeg 5 mL van 200 mM L-glutamine, penicilline-streptomycine, 5 mL en 50 mL foetale runderserum tot 500 mL van DMEM zonder bicarbonaat.</li>
		<li>Voeg voor controle (pH 7.4) medium, 2.4 mL 0.33 M NaHCO3 oplossing per 100 mL DMEM zonder bicarbonaat. Toevoegen voor lage-pH (pH 6.8) medium, 0,6 mL 0.33 M NaHCO3 oplossing per 100 mL DMEM zonder bicarbonaat.</li>
		<li>Controleer de middellange pH na 24 uur incubatie bij 37 ° C minder dan 5% CO2. Nota: Het bedrag van NaHCO3 oplossing moet worden aangepast afhankelijk van de middellange pH, die afhankelijk van het CO2 -gehalte van de incubator en luchtdruk verschillen kan. Ideaal, voor de eerste keer, het is beter om te meten de middellange pH met verschillende concentraties van de bicarbonaat om te bepalen van de juiste hoeveelheid NaHCO3 oplossing toe te voegen aan DMEM.<ol>
<li>Verzamel kweekmedium onmiddellijk na het verwijderen van de cultuur-schotel uit de incubator van CO2 en meten van de pH met behulp van een pH-meter. Houd de kalibrator bij 37 ° C met behulp van een waterbad, indien nodig. Wordt de middelgrote pH driemaal onafhankelijk. Opmerking: NaHCO3 oplossing moet worden bewaard bij 4 ° C en elke media moet vers worden bereid. Verkrijgbare producten die kunnen worden gebruikt in deze studie staan in Tabel van materialen.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Lactaat-geïnduceerde of HCl-geïnduceerde kweekmedium zure voorbereiden
	<ol>
<li>74 µL van lactaat oplossing of 125 µL van 1 M HCl toevoegen aan 100 mL controle voedingsbodem (bereid in stap 1.1.5).</li>
		<li>Controleer de middellange pH na 24 uur incubatie bij 37 ° C minder dan 5% CO2. Nota: Het bedrag van lactaat of HCl-oplossing moet ook worden aangepast volgens de middellange pH, die afhankelijk van het CO2 -gehalte in de incubator en luchtdruk verschillen kan. In het ideale geval is het beter om te meten de middellange pH met seriële lactaat of HCl concentratie te bepalen van het passende bedrag voor aan te passen aan de gewenste pH van het medium.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. oogsten en het behandelen van cellen
<ol><li>Start cultiveren van cellen bij 37 ° C minder dan 5% CO2 ten minste 1 week vóór het uitvoeren van experimenten. Opmerking: De cellijnen die is gebruikt in deze studie staan in Tabel van materialen.</li>
	<li>Passage cellen wanneer ze 70-90% confluentie bereiken. De cellen worden confluente niet toegestaan. Het medium elke 2-3 dagen tijdens dagelijkse teelt wijzigen.</li>
	<li>Het wassen van de cellen door toevoeging van 5 mL PBS. De PBS gecombineerd en ontkoppelen enzym zoals 1 mL trypsine toe te voegen.</li>
	<li>Incubeer bij 37 ° C totdat de cellen worden afgerond en beginnen om los te maken.</li>
	<li>Voeg 5 mL gestolde voedingsbodem aan de vrijstaande cellen en enzym deactiveren. De celsuspensie overbrengen in een tube van 15 mL en centrifuge voor 3 min op 300 x g. Aspirate het supernatant en resuspendeer de cellen met kweekmedium.</li>
	<li>Met behulp van een hemocytometer en Trypan-blauw levensvatbare cellen te tellen.</li>
	<li>Zaad 5.0 x 105 cellen/putje van een 10-cm schotel in 10 mL van medium. Incubeer de cellen gedurende 24 uur bij 37 ° C minder dan 5% CO2.</li>
	<li>Gecombineerd het kweekmedium, wassen van de cellen met 5 mL PBS en voeg 10 mL van de zure kweekmedium bereid in sectie 1. Incubeer de cellen gedurende 24 uur bij 37 ° C minder dan 5% CO2.</li>
</ol>3. RNA isolatie
<ol><li>Gecombineerd kweekmedium en wassen van cellen met 5 mL PBS. Breek de cellen door RNA extractie reagens toe te voegen (Zie Tabellen van materialen).</li>
	<li>Schraap de schotel kort, dan verwijderen van het RNA extractie reagens met een pipet en storten de RNA extractie reagens/cel lysate in een 1,5 mL-buis. Laat bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.</li>
	<li>Voeg 250 µL chloroform en de buis goed schudden voor ongeveer 15 s. verlof bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten en centrifuge op ≥8, 000 x g gedurende 5 minuten.</li>
	<li>Verwijder voorzichtig de waterige fase met behulp van een precisiepipet. Laat achter een aantal van de waterige fase. Plaats in een andere 1,5 mL-buis.</li>
	<li>550 µL isopropanol toevoegen aan de waterfase en meng voorzichtig. Laat bij kamertemperatuur voor 5 min. Centrifuge met maximale snelheid (≥20-, 000 x g) gedurende 20 minuten bij 4 ° C.</li>
	<li>Giet af het isopropanol en voeg 1 mL 75% ethanol in DEPC behandeld water. Meng voorzichtig. Centrifugeer bij 8.000 x g gedurende 5 min.</li>
	<li>Pipetteer af de ethanol en laat die de pellets drogen.</li>
	<li>Voeg dat ongeveer 15-25 µL (afhankelijk van de opbrengst) van DEPC water getrakteerd op de RNA-pellet. Meng grondig.</li>
	<li>Meten van de concentratie van geïsoleerde RNA door het meten van de OD op 260 nm met behulp van een spectrofotometer.</li>
</ol>4. cDNA synthese
<ol><li>De volgende onderdelen in een PCR reactiebuis combineren: maximaal 5 µg totaal RNA, 1 µL Oligo dT (50 µM) of willekeurige Primer Mix (60 µM), 1 µL 10 mM dNTP en nuclease-gratis water tot een totaal volume van 14 µL.</li>
	<li>Meng en kort centrifugeren de onderdelen met behulp van een kleine benchtop centrifuge (~ 5 s). Denatureren van het monster RNA/primer gedurende 5 minuten bij 65 ° C. Kort draaien (~ 5 s) met behulp van een kleine benchtop centrifugeren en het monster snel op ijs voor minstens 1 min.</li>
	<li>De volgende onderdelen toe te voegen: 4 µL 5 x Reverse transcriptie buffer, 1 µL Reverse-Transcriptase (200 U/µL), 1 µL RNase remmer (40 U/µL). Opmerking: Voorbeelden van commercieel beschikbare kits zijn weergegeven in Tabel van materialen
</li>
	<li>Dop van de tube, meng, en kort centrifugeren dan de inhoud met behulp van een kleine benchtop centrifuge (~ 5 s). Incubeer de gecombineerde reactiemengsel bij 50-55 ° C gedurende 10 minuten.</li>
	<li>Inactivering van de reactie door broeden bij 80 ° C gedurende 10 minuten.</li>
</ol>5. meting van de zuur-responsieve genexpressie met behulp van PCR in real time
<ol><li>De volgende onderdelen in een 384-well reactie plaat combineren: 1 µL sjabloon cDNA, 0,75 µL 10 X N',N'-dimethyl-N-[4-[(E)-(3-methyl-1,3-benzothiazol-2-ylidene)methyl]-1-phenylquinolin-1-ium-2-yl]-N-propylpropane-1,3-diamine, 0,3 µL 50 µM vooruit primer, 0,3 µL 50 µM reverse primer, 1 µL polymerase Taq, 2.5 µL 10 x Taq polymerase buffer, 2.5 µL 20 mM dNTP, 16.65 µL water. Opmerking: Voorbeeld van commercieel beschikbare kits zijn weergegeven in Tabel van materialen. Een lijst met inleidingen is weergegeven in tabel 1. Een reactie van de 96-wells-plaat kan ook worden gebruikt in deze stap. Andere sondes (b.v., Taqman sonde) kunnen ook worden gebruikt.</li>
	<li>Opzetten van het experiment en de volgende PCR-programma op een Real-time PCR-systeem: 50 ° C gedurende 2 minuten, 1 cyclus; 95 ° C gedurende 10 min, 1 cyclus; 95 ° C voor 15 s en 60 ° C gedurende 1 min, 40 cycli; 95 ° C gedurende 15 s, 1 cyclus; 60 ° C gedurende 15 s, 1 cyclus; 95 ° C gedurende 15 s, 1 cyclus.</li>
	<li>Plaats de plaat in de qPCR instrument. Start het programma. Opmerking: Opregulatie van de pH responsieve genen MSMO1, INSIG1en IDI1 kunnen worden gemeten door eiwitniveaus.</li>
</ol>

<ol><li>Cairns, R. A., Harris, I. S., Mak, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cancer+cell+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Regulation of cancer cell metabolism.</a> Nature reviews. Cancer. 11 (2), 85-95 (2011).</li>
<li>Chang, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+Competition+in+the+Tumor+Microenvironment+Is+a+Driver+of+Cancer+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Metabolic Competition in the Tumor Microenvironment Is a Driver of Cancer Progression.</a> Cell. 162 (6), 1229-1241 (2015).</li>
<li>Hsu, P. P., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cell+metabolism%3A+Warburg+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer cell metabolism: Warburg and beyond.</a> Cell. 134 (5), 703-707 (2008).</li>
<li>Gerweck, L. E., Seetharaman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+pH+gradient+in+tumor+versus+normal+tissue%3A+potential+exploitation+for+the+treatment+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Cellular pH gradient in tumor versus normal tissue: potential exploitation for the treatment of cancer.</a> Cancer research. 56 (6), 1194-1198 (1996).</li>
<li>Webb, B. A., Chimenti, M., Jacobson, M. P., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulated+pH%3A+a+perfect+storm+for+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Dysregulated pH: a perfect storm for cancer progression.</a> Nature Rev. Cancer. 11 (9), 671-677 (2011).</li>
<li>Gatenby, R. A., Gillies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+do+cancers+have+high+aerobic+glycolysis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Why do cancers have high aerobic glycolysis?</a> Nature reviews. Cancer. 4 (11), 891-899 (2004).</li>
<li>McBrian, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+acetylation+regulates+intracellular+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Histone acetylation regulates intracellular pH.</a> Mol Cell. 49 (2), 310-321 (2013).</li>
<li>Damaghi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+acidosis+in+the+tumour+microenvironment+selects+for+overexpression+of+LAMP2+in+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Chronic acidosis in the tumour microenvironment selects for overexpression of LAMP2 in the plasma membrane.</a> Nat Commun. 6, 8752(2015).</li>
<li>Corbet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acidosis+Drives+the+Reprogramming+of+Fatty+Acid+Metabolism+in+Cancer+Cells+through+Changes+in+Mitochondrial+and+Histone+Acetylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Acidosis Drives the Reprogramming of Fatty Acid Metabolism in Cancer Cells through Changes in Mitochondrial and Histone Acetylation.</a> Cell Metab. 24 (2), 311-323 (2016).</li>
<li>Chen, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genomic+analysis+of+lactic+acidosis+and+acidosis+response+in+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">The genomic analysis of lactic acidosis and acidosis response in human cancers.</a> PLoS genetics. 4 (12), e1000293(2008).</li>
<li>Kondo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+Acidic+pH+Activates+the+Sterol+Regulatory+Element-Binding+Protein+2+to+Promote+Tumor+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Extracellular Acidic pH Activates the Sterol Regulatory Element-Binding Protein 2 to Promote Tumor Progression.</a> Cell Rep. 18 (9), 2228-2242 (2017).</li>
</ol>

De auteur Ayano Kondo is een medewerker van Mizuho Securities Kirin Co., Ltd.

We beschreven hier, een eenvoudige zure pH cultuur systeem en het evaluatieproces. De combinatie van drie methoden voor middelgrote verzuring, dat wil zeggen, verminderde bicarbonaat concentratie, lactaat toevoeging en HCl toevoeging, konden we het pH-response-mechanisme grondig onderzoeken en vergelijken van de cellulaire reactie op andere tumor microenvironmental voorwaarden zoals hypoxie of nutriënt honger.
De sleutel van deze methode is het bepalen van de juiste concentraties van ...

De tumor communicatie speelt een belangrijke rol in de progressie van de tumor en kanker cel stofwisseling1,2,3. Kankercellen zijn vaak blootgesteld aan voorwaarden zoals hypoxie, nutriënten ontbering en zure extracellulaire pH (pHe). Echter, de rol van pHe in tumor progressie is niet opgehelderd zo uitgebreid zoals hypoxie of nutriënt honger. De pHe in de tumor weefsel kan worden zuur, ongeveer pH 6.84,5te bereiken. De zure pH vloeit voort uit de aërobe en anaërobe glycolytic uitscheiding van protonen (H+) en lactaat door delende kanker cellen5,6.
Recente studies is gebleken dat zure pHe-geïnduceerde Histon exocytose van zure lysosomen voor aanpassing aan de ernstige zure omgeving7,8,9,10, deacetylation en oxidatie van de vetzuren. Nochtans, de mechanismen via welke extracellulaire verzuring is van invloed op kanker gedrag en de identiteit van de sleutel regelgevers in de zure pH tumor communicatie zijn nog niet volledig vastgesteld. Bovendien verschillende rapporten beschreven verschillende zure pH media met behulp van onduidelijk concentraties van bicarbonaat, Tris, PIJPEN en HEPES-buffer of lactaat en HCl, maar er zijn weinig rapporten om aan te tonen van de stabiliteit van de gecorrigeerde middellange noch uitgebreide vergelijking van verschillende afzonderlijke zure voedingsbodems7,8,9,10
Om te verhelderen de belangrijkste regelgevers en metabole veranderingen in kankercellen in het kader van extracellulaire verzuring, we een eenvoudige in vitro cultuur model voor het handhaven van een zure pHe opgericht en gebogen over de rol van pHe in kanker cellen11. Met behulp van deze methode, wij onderhouden een zure kweekmedium met een pHe van 6,8 bij 37 ° C minder dan 5% CO2, met behulp van verminderde bicarbonaat concentraties in het kweekmedium. pH 7.4 werd gebruikt als normaal en controle van medium. De middellange pH was opgelopen gedurende ten minste 24 uur en daalde geleidelijk met 72 h tijdens cultuur van PANC-1 en AsPC-1 pancreatic kankercellen. Omdat u verbeterde glycolyse versnelt uitscheiding van niet alleen de protonen, maar ook de lactaat7,8,9, wij vastgesteld een cultuur methode lactaat-geïnduceerde acidose nabootsen door toevoegen van lactaat in plaats van het verminderen van de bicarbonaat concentratie. Bovendien, HCl-geïnduceerde zure pHe in het medium stelt ons in staat om uit te sluiten van de mogelijkheid die cellulaire reacties op zure pH kweekmedium niet als gevolg van een verminderde concentratie van bicarbonaat. Bovendien, voor informatie over het gebruik van verschillende media met een pH van 6.4 tot en met 7.4 met concentratie van de verschillende bicarbonaat we kunnen beoordelen in welke mate van pHe gevolgen voor cellulaire reacties.

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium&ldquo;Nissui&rdquo; 2</td><td>Nissui</td><td>05919</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Thermo Fisher</td><td>10438</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Wako</td><td>191-01305</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine oplossing</td><td>Thermo Fisher</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine gemengde oplossing(Gestabiliseerd)</td><td>Nacalai</td><td>09367-34</td><td></td></tr><tr><td>0,5g/l-Trypsine/0,53mmol/l-EDTA oplossing, met fenolrood</td><td>Nacalai</td><td>32778-05</td><td></td></tr><tr><td>0,5%-Trypan Blauwe kleurstofoplossing</td><td>Nacalai</td><td>29853-34</td><td></td></tr><tr><td>Melazooplossing</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252476</td><td></td></tr><tr><td>Zoutzuuroplossing</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9892</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Plus Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>74134</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript IV First-Strand Synthesis System</td><td>Thermo Fisher</td><td>18091</td><td></td></tr><tr><td>Power SYBR Green PCR Master Mix&nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>4368702&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Cellijnen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PANC-1</td><td>ATCC</td><td>CRL-1469</td><td></td></tr><tr><td>AsPC-1</td><td>ATCC</td><td>CRL-1682</td><td></td></tr><tr><td>KMS-6</td><td>JCRB Cell Bank</td><td>JCRB0432</td><td></td></tr><tr><td>TIG</td><td>JCRB Cell Bank</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MRC9</td><td>ATCC</td><td>CCL-212</td><td></td></tr><tr><td>HUVEC</td><td>ATCC</td><td>CRL-1730</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrofotometer met Wi-Fi</td><td>Thermo Fisher</td><td>ND-ONE-W</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 5 Real-Time PCR System</td><td>Thermo Fisher</td><td>CRL-1682</td><td></td></tr></tbody></table>

oprichting van een extracellulaire zure ph cultuur systeem

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Voorwaarden van de tumor communicatie, zoals hypoxie of nutriënten honger, spelen belangrijke rol in de progressie van kanker en maligniteit. Echter, de rol van zure extracellulaire pH in tumor agressiviteit en het onderliggende mechanisme heeft niet uitvoerig bestudeerd in vergelijking met hypoxische of nutriënten honger voorwaarden. Daarnaast is een welomschreven cultuur methode om na te bootsen de zure extracellulaire tumor communicatie niet volledig gemeld.
Hier presenteren we een eenvoudige in vitro cultuur methode om met behulp van de zure pH van de extracellulaire verminderd bicarbonaat en verhoogde lactaat of HCl concentraties in het kweekmedium. De middellange pH was opgelopen gedurende ten minste 24 uur en geleidelijk daalde met 72 h na cultuur van PANC-1 en AsPC-1 pancreatic kankercellen. Drie verschillende zure media voorwaarden in deze studie zeer upregulated pH-responsieve genen zoals MSMO1, INSIG1en IDI1 ten opzichte van hypoxie of nutriënten honger. De opregulatie van deze genen kan worden gebruikt als een marker van zure pH. Deze eenvoudige technieken zijn nuttig voor het verhelderen van de onderliggende mechanismen van tumor maligniteit onder zure tumor communicatie. Daarom kunnen onze extracellulaire zure pH cultuur system ontdekking van cellulaire zure pH reacties niet alleen in kankercellen, maar ook in primaire cellen, zoals renale tubulaire cellen, met betrekking tot de andere zure aandoeningen waaronder, diabetische ketoacidose, melkzuur acidose, renale tubulaire acidose en respiratoire acidose.

Om te bepalen van de juiste bicarbonaat concentratie, we DMEM voorbereid op een bereik van 0 - 8 mM NaHCO3 (eindconcentratie in het kweekmedium) en opgevolgd in het bereiden van voedingsbodems met pH variërend van 6.4-7.4 (Figuur 1). Wij DMEM met 8 mM NaHCO3 (pH 7.4) als een medium van de controle, en 2 mM NaHCO3 (pH 6,8) als een medium met een zure pH volgens een vorige rapport waarin staat dat de extracellulaire pH pH 6.8 vo...

De zure tumor communicatie speelt belangrijke rol in de progressie van de tumor. Om te beoordelen van de gevolgen van zure extracellulaire pH voor kanker cellen in vitro vastgesteld we eenvoudige zure cultuur systemen.

Oprichting van een extracellulaire zure pH cultuur systeem

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...

Het algemene doel van deze eenvoudige in vitro kweekmethode is om de onderliggende mechanismen van tumormaligniteit onder een zure tumormicro-omgeving te verduidelijken. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen in het gebied van tumorbiologie, zoals het onderliggende mechanisme van kankerprogressie en maligniteit als reactie op de tumormicro-omgeving. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn de stabiliteit van de medium-pH en de mogelijkheid om verschillende zure pH-media te vergelijken.De implicatie van deze techniek breidde zich uit naar de therapie van niet alleen kanker, maar ook van zure aandoeningen omdat acidose geassocieerd kan worden met verschillende soorten ziekten. Om te beginnen, los 4,75 gram DMEM poeder met L-glutamine op in 500 milliliter water. Bereid ook een 0,33-molare natriumbicarbonaat oplossing in een drukdichte fles voor.Autoclaveer het medium en de oplossing. Nadat deze buffers zijn afgekoeld tot 25 graden Celsius, voeg vijf milliliter 200 millimolair L-glutamine, vijf milliliter penicilline-streptomycine en 50 milliliter foetaal bovien serum toe aan 500 milliliter DMEM zonder bicarbonaat. Voor een controlemedium, voeg 2,4 mill

establishment-of-an-extracellular-acidic-ph-culture-system

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Microbiële eukaryoten zijn zowel een bron van fotosynthetisch afgeleide koolstof en top roofzuchtige soort in permanent met ijs bedekte Antarctische meren. Dit rapport beschrijft een verrijking cultuur benadering van het metabool veelzijdige microbiële eukaryoten isoleren van de Antarctische meer, Lake Bonney, en beoordeelt anorganische koolstof fixatie mogelijkheden met behulp van een radio-isotoop test voor ribulose-1 ,5-bisphophate carboxylase oxygenase (RuBisCO) activiteit.

Oprichting van Microbiële Eukaryote Enrichment Culturen van een chemisch Stratified Antarctic Lake en Beoordeling van Carbon Fixatie Potentiële

Het huidige artikel schetst een protocol bij een in vitro celcultuur model systeem om de interactie van een facultatief intracellulaire menselijke pathogene schimmel Candida glabrata met menselijke macrofagen, die een nuttig instrument om onze kennis van schimmel virulentiemechanismen vooruit zal bestuderen vestigen.

Oprichting van een<em&gt; In vitro</em&gt; Systeem om Intracellular Gedrag van Studie<em&gt; Candida glabrata</em&gt; In Human THP-1 macrofagen

Bacteriën kunnen tijdens hun leven schadelijke of gunstige mutaties ophopen. In een populatie van cellen kunnen individuen die gunstige mutaties hebben geaccumuleerd, snel hun medemens overtreffen. Hier presenteren we een eenvoudige procedure om intraspecies-concurrentie in een bacteriële celpopulatie in de loop van de tijd te visualiseren met behulp van fluorescerend gelabelde individuen.

Monitoring intraspecies competitie in een bacteriële celpopulatie door cocultivatie van fluorescerend gelabelde stammen

Het eerste deel van dit artikel laat zien hoe mutante cellijnen te selecteren zijn die vesiculaire Na+/H+ uitwisselaars in hun plasmamembraan tot expressie brengen. Het tweede deel biedt protocollen gebaseerd op intracellulaire pH-metingen en snelle ionopname, die worden gebruikt om de ionselectiviteit en de kinetische parameters van deze uitwisselaars te bepalen.

Functionele karakterisatie van Na<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup&gt; Warmtewisselaars van intracellulaire compartimenten met Proton-doden Selectie om ze te uiten op het plasmamembraan

Glycolyse is een bepalende metabolische marker in meerdere biologische systemen. Het monitoren van glycolyse door het meten van de extracellulaire flux van H+ is gebruikelijk, maar vereist correctie om kwantitatief en eenduidig te zijn. Hier laten we zien hoe je extracellulaire fluxgegevens kunt verzamelen en corrigeren om onderscheid te maken tussen respiratoire en glycolytische bronnen van extracellulaire acidificatie.

Meting en analyse van de extracellulaire zuurproductie te bepalen glycolytisch Rate

Gut host-microbe interacties werden geschat aan de hand van een nieuwe benadering van het combineren van een synthetische mondelinge Gemeenschap, in vitro gastro-intestinale spijsvertering en een model van het epitheel van de dunne darm. Presenteren we een methode die aangepast worden kan voor de beoordeling van de cel invasie van ziekteverwekkers en multispecifieke biofilms, of zelfs om te testen op het overlevingsvermogen van probiotische formuleringen.

Beoordelen van de levensvatbaarheid van een synthetische bacteriële Consortium op de In Vitro -Interface van het Gut-Host-microbe

Hier beschrijven we een protocol voor te bereiden en handhaven van hypofyse en primaire celculturen van medaka (Oryzias latipes). De geoptimaliseerde voorwaarden in dit protocol rekening belangrijke parameters zoals temperatuur, osmolaliteit en pH door het nabootsen van de fysiologische omstandigheden van de vis, waardoor fysiologisch meer zinvolle resultaten.

Voorbereiding van een kwalitatief hoogwaardige primaire celcultuur van vis Pituitaries

We demonstreren een methode voor het isoleren van moeilijk te kweken leden van de nieuwe bacteriële fylum, Saccharibacteriën, door tandplak te filteren en samen te kweken met gastheerbacteriën.

Het vestigen van stabiele binaire culturen van symbiotische saccharibacteriën uit de mondholte

Hier presenteren we een experimenteel evolutieprotocol voor aanpassing bij thermofielen met behulp van goedkope, energiezuinige bench-top thermomixers als incubatoren. De techniek wordt gedemonstreerd door de karakterisering van temperatuuraanpassing in Sulfolobus acidocaldarius, een archaeon met een optimale groeitemperatuur van 75 °C.

Aanpassing aan de uitersten van het leven: experimentele evolutie met de extremofiele Archaeon Sulfolobus acidocaldarius

Hier presenteren we een protocol voor het karakteriseren van gemedieerde extracellulaire elektronenoverdracht (EET) in melkzuurbacteriën met behulp van een bio-elektrochemisch systeem met drie elektroden en twee kamers. We illustreren deze methode met Lactiplantibacillus plantarum en de redoxmediator 1,4-dihydroxy-2-naftoïnezuur en geven een grondige beschrijving van de elektrochemische technieken die worden gebruikt om gemedieerde EET te evalueren.

Karakterisering van gemedieerde extracellulaire elektronenoverdracht in melkzuurbacteriën met een bio-elektrochemisch systeem met drie elektroden en twee kamers

Leer een in vitro zure pH-cultuurmethode voor oncologisch onderzoek met DMEM en natriumbicarbonaat. Deze techniek onthult mechanismen van tumorprogressie in zure micro-omgevingen.

Oprichting van een extracellulaire zure pH cultuur systeem

Meer video's verkennen