Name: Immuno-belichting fluorescerende etikettering van microtubuli en Centrosomal eiwitten in Ex Vivo intestinale weefsel en 3D In Vitro intestinale Organoids (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Leer immunolabeling van microtubuli en centrosomale eiwitten in 3D darmorganoids en ex vivo weefsel met formaldehyde-methanol fixatie. Deze methode behoudt de 3D-architectuur en antigeeniteit voor effectieve fluorescentie-microscopie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs bedanken Paul Thomas voor Microscoop advies en hulp. Dit werk hierbij werd gesteund door de BBSRC (neen verlenen. BB/J009040/1 M.M.M. en TW).

<ol><li>Bacallao, R., Antony, C., Dotti, C., Karsenti, E., Stelzer, E. H., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+subcellular+organization+of+Madin-Darby+canine+kidney+cells+during+the+formation+of+a+polarized+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The subcellular organization of Madin-Darby canine kidney cells during the formation of a polarized epithelium.</a> J Cell Biol. 109 (6 Pt 1), 2817-2832 (1989).</li>
<li>Bellett, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+plus-end+and+minus-end+capture+at+adherens+junctions+is+involved+in+the+assembly+of+apico-basal+arrays+in+polarised+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Microtubule plus-end and minus-end capture at adherens junctions is involved in the assembly of apico-basal arrays in polarised epithelial cells.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 66 (10), 893-908 (2009).</li>
<li>Mogensen, M. M., Tucker, J. B., Mackie, J. B., Prescott, A. R., Nathke, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adenomatous+polyposis+coli+protein+unambiguously+localizes+to+microtubule+plus+ends+and+is+involved+in+establishing+parallel+arrays+of+microtubule+bundles+in+highly+polarized+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The adenomatous polyposis coli protein unambiguously localizes to microtubule plus ends and is involved in establishing parallel arrays of microtubule bundles in highly polarized epithelial cells.</a> J Cell Biol. 157 (6), 1041-1048 (2002).</li>
<li>Mogensen, M. M., Tucker, J. B., Stebbings, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+polarities+indicate+that+nucleation+and+capture+of+microtubules+occurs+at+cell+surfaces+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule polarities indicate that nucleation and capture of microtubules occurs at cell surfaces in Drosophila.</a> J Cell Biol. 108 (4), 1445-1452 (1989).</li>
<li>Sanchez, A. D., Feldman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-organizing+centers%3A+from+the+centrosome+to+non-centrosomal+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule-organizing centers: from the centrosome to non-centrosomal sites.</a> Curr Opin Cell Biol. , (2016).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>van der Flier, L. G., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells%2C+self-renewal%2C+and+differentiation+in+the+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium.</a> Annu Rev Physiol. 71, 241-260 (2009).</li>
<li>Goldspink, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ninein+is+essential+for+apico-basal+microtubule+formation+and+CLIP-170+facilitates+its+redeployment+to+non-centrosomal+microtubule+organizing+centres%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biol%22%5BJournal%5D)">Ninein is essential for apico-basal microtubule formation and CLIP-170 facilitates its redeployment to non-centrosomal microtubule organizing centres.</a> Open Biol. 7 (2), (2017).</li>
<li>Verissimo, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+mutant+RAS+in+patient-derived+colorectal+cancer+organoids+by+combinatorial+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Targeting mutant RAS in patient-derived colorectal cancer organoids by combinatorial drug screening.</a> Elife. 5, (2016).</li>
<li>Young, M., Reed, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+as+a+Model+for+Colorectal+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Colorectal+Cancer+Rep%22%5BJournal%5D)">Organoids as a Model for Colorectal Cancer.</a> Curr Colorectal Cancer Rep. 12 (5), 281-287 (2016).</li>
<li>Andersson-Rolf, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+conditional+and+reversible+gene+knockouts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">One-step generation of conditional and reversible gene knockouts.</a> Nat Methods. 14 (3), 287-289 (2017).</li>
<li>Schwank, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+repair+of+CFTR+by+CRISPR%2FCas9+in+intestinal+stem+cell+organoids+of+cystic+fibrosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).</li>
<li>Goldspink, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microtubule+end-binding+protein+EB2+is+a+central+regulator+of+microtubule+reorganisation+in+apico-basal+epithelial+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The microtubule end-binding protein EB2 is a central regulator of microtubule reorganisation in apico-basal epithelial differentiation.</a> Journal of Cell Science. 126 (17), 4000-4014 (2013).</li>
<li>Yoneda, M., Molinolo, A. A., Ward, J. M., Kimura, S., Goodlad, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Device+to+Rapidly+Prepare+Whole+Mounts+of+the+Mouse+Intestine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A Simple Device to Rapidly Prepare Whole Mounts of the Mouse Intestine.</a> J Vis Exp. (105), e53042(2015).</li>
<li>Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+video+protocol+of+retroviral+infection+in+primary+intestinal+organoid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture.</a> J Vis Exp. (90), e51765(2014).</li>
<li>Coquelle, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LIS1%2C+CLIP-170%27s+key+to+the+dynein%2Fdynactin+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">LIS1, CLIP-170's key to the dynein/dynactin pathway.</a> Mol Cell Biol. 22 (9), 3089-3102 (2002).</li>
<li>Belshaw, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+DNA+methylation+in+individual+colonic+crypts+reveal+aging+and+cancer-related+field+defects+in+the+morphologically+normal+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Patterns of DNA methylation in individual colonic crypts reveal aging and cancer-related field defects in the morphologically normal mucosa.</a> Carcinogenesis. 31 (6), 1158-1163 (2010).</li>
<li>Whitehead, R. H., VanEeden, P. E., Noble, M. D., Ataliotis, P., Jat, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+conditionally+immortalized+epithelial+cell+lines+from+both+colon+and+small+intestine+of+adult+H-2Kb-tsA58+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Establishment of conditionally immortalized epithelial cell lines from both colon and small intestine of adult H-2Kb-tsA58 transgenic mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (2), 587-591 (1993).</li>
<li>Hamilton, K. L., Butt, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+transport+into+everted+sacs+of+the+small+intestine+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Physiol+Educ%22%5BJournal%5D)">Glucose transport into everted sacs of the small intestine of mice.</a> Adv Physiol Educ. 37 (4), 415-426 (2013).</li>
<li>Rogers, S. L., Rogers, G. C., Sharp, D. J., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+EB1+is+important+for+proper+assembly%2C+dynamics%2C+and+positioning+of+the+mitotic+spindle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle.</a> J Cell Biol. 158 (5), 873-884 (2002).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Isolatie van intestinale weefsel Isolatie van kleine intestinale crypten en villi en Colon crypten gaat bloot van de mucosal oppervlakte, behandeling met EDTA oplossing cel contactpersonen, fractionering (schudden) en centrifugeren los te maken. Het protocol van de isolatie gepresenteerde intestinale villi/crypt is gewijzigd van Belshaw et al. en Whitehead et al. 17 , 18
Bloot van de mucosal oppervlakte We hebben geëxperimenteerd met een aantal benaderingen voor het blootstellen van de mucosal oppervlakte van het darmkanaal in de ontwikkeling van deze procedure. Een klassieke benadering wil evert (draai binnenstebuiten) de buis, meestal in segmenten ongeveer 100 mm lang, met behulp van een metalen staaf die is gevangen in een vouw van het weefsel op de ene kant en vervolgens de resterende buis gleed over de buis19. Muis weefsel, een metalen staaf (2,4 mm doorsnede) met afgeronde uiteinden is ideaal voor is. Deze aanpak heeft het voordeel van de mucosal oppervlakte betere toegang tot de PBS en EDTA uit te breiden. In eerste instantie gebruikten deze aanpak we maar verplaatst naar de buis snijden in korte lengtes (ongeveer 5 cm) en elke sectie met het ontleden van schaar, zoals dit gemakkelijker blijkt openen. Deze aanpak is geschikt als slechts een paar darmen vereist zijn; maar als meer dieren moesten worden gebruikt in een experiment dan een speciaal gebouwde apparaat voor snijden open de tube lengterichting, zoals beschreven door Yoneda et al. 14 zou efficiënter zijn.
Detachement van villi en crypten van de spier laag Aanvankelijk gebruikten wij 3 mM EDTA in PBS en relatief lange incubatie tijden van maximaal 60 min los van de mucosal oppervlakte van de onderliggende weefsel17,18te maken. Bij deze concentratie van EDTA vonden wij dat een incubatietijd van 30 min was voldoende crypten van muis dubbelpunt los te maken. Echter voor de dunne darm crypt/villosités isolatie we geprobeerd met behulp van meer geconcentreerde EDTA voor een kortere tijd, die bleek te zijn een efficiënte aanpak. Alle latere werk werd uitgevoerd met weefsel geëxtraheerd met behulp van de 30 mM EDTA techniek relevante breuken voor villi of crypten genereren. Voor crypten, we normaal gebundeld met breuken 3-5 vóór de vaststelling, maar het is belangrijk om te controleren of dit de juiste breuken zijn, zoals de tijdsinstellingen van een aantal factoren zoals de positie langs het darmkanaal, leeftijd van muis, ontsteking, vorige dieet afhangen zal , etc. ook hoe lang het weefsel moet worden geschud na de EDTA behandeling effectief kan verschillen onder verschillende omstandigheden. Het resultaat is geïsoleerde weefsel breuken met een mengsel van villi en crypten of voornamelijk villi of crypten (Figuur 2). Aangezien er geen villi in de dikke darm, de crypte extractie kan haalbaar in één stap door schudden van het weefsel in de buis voor 30 s. Deze fracties kunnen dan worden vastgesteld en verwerkt voor immuno-labeling.
Isolatie van intestinale organoids uit kelder matrix Isolatie van organoids uit kelder matrix koepels kan worden bereikt met behulp van de oplossing van de gegevensterugwinning van de cel. De oplossing werkt door het depolymerizing van de matrix gegeleerde kelder maar de temperatuur moet worden van 2-8 ° C. Een nota van voorzichtigheid is dat dynamische microtubuli niet worden beschermd. Dus, voor immuno-labeling van dynamische microtubuli en + TIPs zoals de EBs-cel, herstel uit kelder matrix voorafgaand aan de fixatie wordt niet aanbevolen. Toch, allermeest naar de microtubuli in de onderscheidende organoid cellen zijn relatief stabiel en deze werden bewaard (Figuur 6). Het werkte ook goed voor immuno-labeling van centrosomal en regulates eiwitten, alsmede cel-markeringen.
Fixatie protocollen Formaldehyde (vers gemaakt van PFA) is een relatief snelle-acteren fixatief die omkeerbare vormt cross-links en 4% PFA werkt goed, bijvoorbeeld in de microtubuli immuno-labeling en gamma-tubuline en kleuring actine-filamenten met Phalloidin. Meer PFA oplossingen zoals 1% goed gewerkt voor immuno-labeling, bijvoorbeeld met de stamcel markeringen Lgr5 en Paneth cel markering CD24 binnen de crypte stamcel niche, terwijl hogere concentraties van PFA niet werkte verdund.
De toevoeging van Glutaaraldehyde geeft beter behoud van microtubuli en de zogenaamde PHEMO fixatie die uit een mengsel van 3.7% PFA, Glutaaraldehyde 0,05% en 0,5% wasmiddel in PHEMO buffer (68 mM buizen, 25 mM HEPES, 15 mM EGTA en 3 mM MgCl2)2 bestaat geeft uitstekende behoud van microtubuli zonder afbreuk te doen aan de antigenicity. Het werkt ook goed voor immuno-labeling gamma-tubuline, β-catenine, en E-cadherine en kleuring actine-filamenten met phalloidin. Echter in 3D weefsel en organoid culturen, de PHEMO fixatie inconsistente resultaten geproduceerd en was daarom niet gebruikt.
Methanol is een coagulant fixatief dat geeft relatief goede doordringing en heeft de neiging om antigenicity te behouden. Fixatie met 100% methanol (-20 ° C) introduceert enkele krimp geeft gematigde morfologie behoud en werkt voor de microtubuli, + TIPs, en vele centrosomal antilichamen, met inbegrip van ninein in 2D celculturen. Echter, sommige organoids samengevouwen wanneer using zulks werkwijze fixatie. Daarnaast penetratie van antilichamen door hele crypten, villi of organoids was aanvankelijk een probleem maar de toevoeging van 0,1% wasmiddel wassen oplossing en langdurige wassen betere resultaten bereikt.
Een combinatie van formaldehyde en methanol had eerder gebruikt door Rogers et al. 20 tot immuno-label EB1 in Drosophila. Een fixatie-protocol gebaseerd op een mengsel van formaldehyde en methanol is daarom ontwikkeld voor intestinale weefsel en organoids op basis van 3% formaldehyde en 97% methanol gekoeld worden tot-20 ° C, maar het weglaten van de 5 mM natriumcarbonaat uit het mengsel dat werd gebruikt door Rogers et al. 20 voorts monsters werden vastgesteld in de diepvries bij-20 ° C. Dit werkte met name goed voor immuno-labeling + TIPs, zoals CLIP-170 en de EBs, maar bewees ook uitstekend geschikt voor de vaststelling en immuno-labeling microtubuli en actine binnen weefsel en 3D organoids. Zeer goede structurele behoud bleek en antigenicity werd bewaard voor verschillende cytoskeletal en bijbehorende eiwitten evenals centrosomal eiwitten zoals gamma-tubuline en ninein, hoewel labeling voor ninein steeds meer met methanol gewerkt fixatie.

Vorming van epitheel met apico-basale polariteit is een fundamentele proces in ontwikkeling en houdt een drastische reorganisatie van de microtubuli en centrosomal eiwitten. Een radiale microtubulus-matrix die afkomstig zijn van een centraal gelegen centrosomal microtubulus organiseren center (MTOC) is prominent in de vele dierlijke cellen en dit is zeer geschikt voor relatief platte cellen. In tegenstelling, assembleren in kolomvorm epitheliale cellen, zoals die van de darm, niet-radial transcellulair microtubulus matrices die de vorm en de gespecialiseerde functies van deze cellen beter te ondersteunen. Deze dramatische reorganisatie van de microtubuli wordt bereikt door de centrosoom overgang op de apex en apicaal niet-centrosomal MTOCs (n-MTOCs) vormen, wordt verantwoordelijk voor het bevestigingspunt voor de transcellulair microtubuli1,2 , 3 , 4 , 5.
Veel van onze kennis van epitheliale differentiatie en de bijbehorende microtubulus reorganisatie kwam uit de onderzoeken van 2D in vitro cel lagen, die niet de in vivo weefsel architectuur weergeven. Ontwikkeling van 3D in vitro organoid culturen, gepionierd door Clevers en medewerkers6, vormt een grote technologische vooruitgang zoals ze in vivo architectuur en ontwikkeling nabootsen. Een hiërarchie van epitheliale differentiatie is duidelijk in de darm; stamcellen aan de onderkant van de crypten geven aanleiding tot onvolwassen transit sturen cellen vermenigvuldigen en geleidelijk onderscheiden als ze van de crypte op de kleine intestinale villosités of Colon oppervlak migreren, waar ze volledig worden gedifferentieerd voorafgaand aan wordt schuur in de lumen-7. Nog belangrijker is, wordt dit gerepliceerd in de intestinale organoids waar cellen uit de cel van de stam niche zelftappende cysten die vervolgens genereren crypt-achtige toppen met stamcellen aan de onderkant en de differentiatie geleidelijk op weg naar de regio van de cyste, vermenigvuldigen die villosités-achtige8wordt. De intestinale organoid vertegenwoordigt daarom een krachtig model niet alleen microtubulus en reorganisatie van de centrosomal tijdens de epitheliale differentiatie maar talrijke andere proteïnen, evenals het verstrekken van een ideaal platform voor screening van drugs en voedsel te studeren verbindingen van potentieel therapeutische voordelen9,10.
Organoids zijn geschikt voor wonen-imaging van TL-gelabelde proteïnen en beide knock-in en knock-out organoids kan worden gegenereerd met behulp van CRISPR/Cas9 gene11,12te bewerken. Het is echter belangrijk, vooral om te controleren of het gedrag van de tagged eiwitten tot oprichting van de expressie en de lokalisatie van de endogene eiwitten worden bestudeerd. Immuno-labeling 3D organoids gegroeid in kelder matrix of ex vivo geïsoleerde weefsel is complexer dan cellen gekweekt in cultuur gerechten in 2D. Het protocol fixatie moet voor het behoud van de gevoelige 3D architectuur van organoids terwijl nog het bewaren van antilichaam antigenicity (dat wil zeggen, de epitopes voor het binden van antistoffen). Bijvoorbeeld, 4% paraformaldehyde (PFA) wordt vaak gebruikt als een hechtmiddel maar terwijl het een relatief snelle handelen fixatief en goede morfologische behoud geeft, in onze ervaring het vaak leidt tot verlies van antigenicity en is niet geschikt voor veel centrosomal antilichamen. Het vermogen van de fixeer en antilichamen te dringen 3D structuren en weefsel moet ook worden overwogen. Te dien einde, we hebben gewijzigd en ontwikkelde protocollen voor weefsel isolatie en indirecte immuno-etikettering van 3D in vitro organoids en ex vivo geïsoleerd intestinale weefsel. We beschrijven hoe isoleren van kleine intestinale crypten en villi en Colon weefsel, en omvatten een protocol voor het isoleren van 3D organoids als alternatief vaststelling en immuno-labeling binnen de kelder-matrix. Presenteren we drie alternatieve fixatie protocollen voor immuno-labeling van microtubuli en centrosomal eiwitten, zoals ninein, en microtubulus plus-end tracering eiwitten (+ TIPs), zoals de EB eiwitten en CLIP-170 (Zie ook de referenties8, 13). We bespreken ook de voors en tegens van elk protocol is gekoppeld.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&rsquo;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Sigma</td><td>D8537-500ML</td><td>wassen en PFA</td></tr><tr><td>Cell Recovery Solution</td><td>Corning</td><td>354253</td><td>organoïden isoleren</td></tr><tr><td>lobind microcentrifuge tubes</td><td>Eppendorf</td><td>30108116</td><td>cellen voorkomen dat ze plakken</td></tr><tr><td>0.5 M EDTA-oplossing, pH 8,0</td><td>Sigma</td><td>03690-100ML</td><td>Crypt-isolatie</td></tr><tr><td>70 &mu;m celzeef</td><td>Fisher Scientific</td><td>11517532</td><td>Crypts van villi isoleren</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>detergens</td></tr><tr><td>geitenserum</td><td>Sigma</td><td>G6767</td><td>blokkeermiddel</td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum (FBS)</td><td>Sigma</td><td></td><td>gebruikt als niet-klevende agent</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde, 4% in PBS</td><td>Alfa Aesar</td><td>J61899</td><td>fixeermiddel</td></tr><tr><td>Formaldehyde-oplossing (36,5&ndash;38% in H2O)</td><td>Sigma</td><td>F8775</td><td>gebruikt als fixeermiddel</td></tr><tr><td>Methanol 99,9% analytische kwaliteit</td><td>Fisher</td><td>M/4000/17</td><td>gebruikt als fixeermiddel</td></tr><tr><td>MaxFluor Mouse on Mouse Immunofluorescence Detection Kit</td><td>Maxvision Biosciences</td><td>MF01-S</td><td>commercieel immunofluorescence-kit; om niet-specifieke markering te verminderen</td></tr><tr><td>Rotator SB2 of SB3</td><td>Stuart</td><td></td><td>microcentrifugebuisrotator</td></tr><tr><td>Natriumcitraat</td><td></td><td></td><td>antigenretrieval</td></tr><tr><td>Hydromount</td><td>National Diagnostics</td><td>HS-106</td><td>montant</td></tr><tr><td>DABCO - 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octaan</td><td>Sigma</td><td>D27802</td><td>anti-fade middel</td></tr><tr><td>Permanent Positive Charged, Pre-Washed, 90 Degree Ground Edges</td><td>Clarity</td><td>N/C366</td><td>glazen dia's</td></tr><tr><td>Glazen dekglas - dikte nr. 1, 22 x 50 mm</td><td>Clarity</td><td>NQS13/2250</td><td>dekglasjes</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>Basale matrix voor 3D-organoïdecultuur</td></tr><tr><td>50 mL kegelbuisjes</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td>voor verwerking van weefsel/organoïden</td></tr><tr><td>15 mL kegelbuisjes</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td>voor verwerking van weefsel/organoïden</td></tr><tr><td>1,5 mL LoBind-buisjes</td><td>Eppendorf</td><td>30108051</td><td>voor geïsoleerde organoïden</td></tr><tr><td>Muis monoklonaal anti-E-cadherine-antilichaam</td><td>BD Biosciences</td><td>610181</td><td>primair antilichaam 1:500</td></tr><tr><td>Ratten monoklonaal anti-tubuline YL1/2-antilichaam</td><td>Abcam</td><td>ab6160</td><td>primair antilichaam 1:100</td></tr><tr><td>Konijn alpha-tubuline-antilichaam</td><td>Abcam</td><td>ab15246</td><td>primair antilichaam 1:100</td></tr><tr><td>Konijn anti-beta-actine-antilichaam</td><td>Abcam</td><td>ab8227</td><td>primair antilichaam 1:100</td></tr><tr><td>Ratten monoklonaal anti-p150Glued-antilichaam</td><td>BD Bioscience</td><td>610473/4</td><td>primair antilichaam 1:100</td></tr><tr><td>Ratten monoklonaal EB3KT36-antilichaam</td><td>Abcam</td><td>ab53360</td><td>primair antilichaam 1:200</td></tr><tr><td>Muis monoklonaal EB1-antilichaam</td><td>BD Bioscience</td><td>610535</td><td>primair antilichaam 1:200</td></tr><tr><td>Konijn anti-Lgr5-antilichaam</td><td>Abgent</td><td>AP2745d</td><td>primair antilichaam 1:100</td></tr><tr><td>Dylight anti-rat 488</td><td>Jackson</td><td>112545167</td><td>secundair antilichaam 1:400</td></tr><tr><td>Dylight anti-muis 488</td><td>Jackson</td><td>ST115545166</td><td>secundair antilichaam 1:400</td></tr><tr><td>Dylight anti-konijn 647</td><td>Jackson</td><td>111605144</td><td>secundair antilichaam 1:400</td></tr></tbody></table>

immuno-belichting fluorescerende etikettering van microtubuli en centrosomal eiwitten in ex vivo intestinale weefsel en 3d in vitro intestinale organoids

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

De komst van 3D in vitro organoids die na te de in vivo weefsel architectuur en de voedselproductie bootsen is sterk vooruitgegaan de mogelijkheid te bestuderen van biologische kernvragen in cel en ontwikkelingsbiologie. Bovendien belooft organoids samen met de recente technische vooruitgang in gen bewerken en virale gen levering medisch onderzoek en de ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen voor de behandeling van ziekten te bevorderen. Organoids gekweekt in vitro in kelder matrix krachtige modelsystemen verschaffen voor de studie van het gedrag en de functie van verschillende eiwitten en zijn geschikt voor wonen-imaging van TL-gelabelde proteïnen. Echter, tot oprichting van de expressie en de localisatie van de endogene eiwitten in weefsel ex vivo en in vitro organoids is belangrijk om te controleren of het gedrag van de tagged eiwitten. Te dien einde hebben we ontwikkeld en weefsel afzondering, fixatie en immuno-labeling protocollen voor lokalisatie van microtubuli, centrosomal en bijbehorende eiwitten in de intestinale weefsel ex vivo en in vitro intestinale organoids bewerkt. Het doel was voor de fixeerspray voor het behoud van de 3D-architectuur van het organoids/weefsel terwijl ook het behoud van antilichaam antigenicity en het inschakelen van goede doordringing en Goedkeuringvande fixeer en antilichamen. Blootstelling aan koude depolymerizes alles behalve stabiel microtubuli, en dit was een belangrijke factor bij het wijzigen van de verschillende protocollen. We vonden dat verhoging van de ethyleendiamminetetra (EDTA) zuurconcentratie van 3 mM tot 30 mM gaf efficiënte detachement van villi en crypten in de dunne darm, terwijl 3 mM EDTA volstond voor Colon crypten. Het ontwikkelde formaldehyde/methanol fixatie protocol gaf zeer goede structurele behoud ook behoud van antigenicity voor effectieve etikettering van microtubuli, actine en de einde-bindende (EB) eiwitten. Het werkte ook voor de centrosomal proteïne ninein hoewel het methanol-protocol consistenter gewerkt. We verder vastgesteld dat fixatie en immuno-labeling van microtubuli en bijbehorende proteïnen kunnen worden bereikt met organoids van geïsoleerd of resterende binnen de kelder-matrix.

Isolatie van intestinale weefsel voor immuno-labeling De protocollen van de isolatie beschreven weefsel voor de dikke darm en dunne darm werden geoptimaliseerd voor behoud en immuno-labeling van microtubuli en geassocieerde eiwitten, maar niet voor de levensvatbaarheid van de cellen van de stam en organoid generatie (Figuur 1 en tabel 1 ). Het doel was om het genereren van de crypte en villosités facties die als waren schoon (verstoken van slijm en ander weefsel) mogelijk, terwijl het minimaliseren van de blootstelling aan EDTA en koude structuur behouden en voorkomen dat depolymerization van microtubuli met ijs koud oplossingen, die ertoe bewegen depolymerization van alles behalve stabiel microtubuli. Figuur 2 ziet u voorbeelden van beelden van de fracties 2 en 3 van geïsoleerde kleine intestinale weefsel, met 2 van de Fractie met een mengsel van zowel villi en crypten (figuur 2A, B), terwijl deel 3 bevat voornamelijk crypten (figuur 2C D).
Fixatie en immuno-labeling van geïsoleerde intestinale weefsel De afzonderlijke of gecombineerde breuken werden vervolgens verwerkt voor fixatie en immuno-aangeduid door middel van een reeks van maatregelen zoals fixatie, wasmiddel, blokkeren, antilichaam en oplossingen, wassen voordat de definitieve villi/crypten opnieuw wordt verbroken pellet in montage media, overbrengen op dia's en omvatten met glas coverslips. De crypten en villi werden vervolgens beeld op een confocal microscoop.
Goede bewaring en etikettering van microtubuli en actine in zowel villi en crypten werd bereikt door het volgende: een combinatie van formaldehyde/methanol fixatie op-20 ° C, herhaald wassen in PBS met 0,1% wasmiddel en 1% serum en blokkeren in PBS met 0,1% wasmiddel en 10% serum, gevolgd door overnight incubatie op 4 ° C in primaire antilichamen en vervolgens 2 h in de secundaire antilichamen bij kamertemperatuur (Figuur 3). Formaldehyde/methanol fixatie is ook goed gewerkt voor labeling + TIPs zoals de EBs en CLIP-170 in geïsoleerde crypten en villi (Figuur 4). EB3 ophopingen eind plus-van microtubuli (bekend als kometen) waren duidelijk in de cryptes (figuur 4A), terwijl de vereniging langs de tralie van stabiele microtubuli kan worden gezien in de villi monsters (figuur 4C). Duidelijke lokalisatie van CLIP-170 en p150gelaste (subeenheid van dynactin) bleek duidelijk in de apicale n-MTOCs in geïsoleerde villi (figuur 4B). Fixatie met het protocol van formaldehyde/methanol werkte niet consequent voor ninein lokalisatie in geïsoleerde intestinale weefsel met behulp van onze Pep3 antilichaam tegen muis ninein. Echter methanol fixatie op-20 ° C, gevolgd door het dezelfde wassen en blokkeren van oplossingen voor formaldehyde/methanol gaf zeer goede lokalisatie van ninein binnen de geïsoleerde crypten en villi (Figuur 5; verwijzing8). Interessant, terwijl ninein geconcentreerd op de apicale centrosomes is bleek sommige ophoping van onderaan cel in sommige cellen in geïsoleerde crypten (Figuur 5). Of dit te wijten aan niet-specifieke etikettering of een gevolg van het uitstellen van de procedure van de isolatie is moet fixatie (en dus op het gebied van behoud) verder onderzoek. Methanol-vaste (-20 ° C) secties van de cryostaat van villi (Zie figuur 3bi in8) bleek echter ook ninein bij de cel basis in sommige cellen die suggereren dat ninein ook kan associëren met een basale bevolking van microtubuli.
Fixatie en immuno-labeling van organoids geïsoleerd uit kelder matrix Kleine intestinale organoids werden gegenereerd en gegroeid in kelder matrix voor drie weken of langer (figuur 6A; verwijzing6,15). Een koud (4 ° C) de oplossing van de gegevensterugwinning van de cel werd gebruikt voor het isoleren van organoids uit de kelder-matrix. De oplossing van de matrix depolymerized kelder met organoids werd overgedragen aan buizen en gecentrifugeerd voorafgaand aan de fixatie en immuno-labeling. Dit zeer schoon preparaten geproduceerd en goede toegang tot de organoids voor de verschillende oplossingen. De gedifferentieerde cellen binnen de organoid villosités domeinen bevatten stabiele apico-basale microtubuli; deze label goed in de meeste gevallen (figuur 6B, C) en EB1 ook langs het microtubulus lattice (Figuur 6 sexies; verwijzing13) kon worden gezien. De oplossing van de gegevensterugwinning koude cel kan echter resulteren in depolymerization van de dynamische microtubuli, die bleek in sommige monsters door het ontbreken van EB1 kometen (die binden aan het plus-einde van groeiende microtubuli) binnen de domeinen van de basale crypt (figuur 6F ). In andere monsters, werden astral (dynamische) microtubuli bewaard (figuur 6D). Organoid isolatie voorafgaand aan de fixatie en immuno-labeling werkte ook voor regulates eiwitten, ninein, CLIP-170 en cel markers, zoals mucin voor goblet cellen en chromogranin A voor enteroendocrine cellen.
Fixatie en immuno-labeling van organoids binnen kelder matrix Figuur 7 toont een organoid in het stadium van de cyste (A-C) en in een vroeg stadium van de ontwikkeling van de crypte (D), zowel vaste in formaldehyde/methanol en immuno-label voor microtubuli en ninein. Goede microtubulus behoud en etikettering, alsmede labeling voor ninein in de apicale n-MTOCs zijn duidelijk. Figuur 8A, B toont een crypte domein binnen een dag 6 organoid vast met het methanol-protocol en het label voor microtubuli en EB1. Goede behoud van microtubuli en EB1 kometen bleek suggereren behoud van dynamische microtubuli.
Organoids waren ook vaste en immuno-label terwijl de resterende binnen de kelder-matrix. De nadelen van deze procedure kunnen worden arme penetratie van fixeer en overlapping van antilichamen in de kelder-matrix (Figuur 8), hoewel in beide gevallen minder vaak wanneer 0,1% wasmiddel werd opgenomen in het fixeer en/of wassen oplossingen. Bovendien, 4% PFA niet behouden de kelder matrix goed maar veroorzaakt te ontbinden, hoewel dit minder dus met 1 was % PFA.Methanol fixatie, aan de andere kant, geïnduceerde soms organoid ineenstorting.
Labelen met sommige antistoffen zoals tegen de stamcel marker Lgr5 en Paneth cel markering bewezen CD24 mislukt met de 4%-PFA, methanol of formaldehyde/methanol-protocollen. Leidt echter tot vaststelling van de organoids binnen de kelder-matrix met 1% PFA in PBS met 0,1% wasmiddel bij kamertemperatuur tot labeling voor zowel Lgr5 als CD24 (Figuur 9).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56662/56662fig1.jpg"> 
Figuur 1: isolatie van kleine intestinale villi en crypten. Stroomdiagram van de belangrijkste stappen in kleine intestinale villosités en crypte isolatie voorafgaand aan de fixatie en immuno-labeling. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56662/56662fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56662/56662fig2.jpg"> 
Figuur 2: geïsoleerd villi en crypten van muis dunne darm. Helderveld Microscoop beelden van intestinale breuken met villi (grote pijlen) en cryptes (kleine pijlen). (A, B) Deel 2 bevat een mengsel van villi en crypten en behoud van de morfologie van de villosités en de crypte is duidelijk in B. (C, D) Fractie 3 toont isolatie van de crypten en villi en intact crypten, met inbegrip van een gespleten crypte in Contbreken. Schaal bars = 500 μm (A, C); 100 μm (B, D). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56662/56662fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56662/56662fig3.jpg"> 
Figuur 3: geïsoleerd kleine intestinale villosités en crypte vaste in formaldehyde/methanol en immuno-gelabeld voor microtubuli en actine. (A) schema van het epitheel van het villosités en de crypte met verschillende soorten cellen aangegeven. De gemarkeerde vakken geven de representatieve gebieden beeld in B en C. (B, C) Confocale optische secties door deel van een villosités (B) en basale crypte (C) geïsoleerd uit de dunne darm met behulp van 30 mM EDTA en vaste in formaldehyde/methanol, gewassen in PBS met 1% geit serum en 0,1% wasmiddel, geblokkeerd in PBS bevattende 10% geit serum en 0,1% wasmiddel, en gelabeld voor microtubuli met rat monoklonaal anti-tubuline antilichaam (groen) en actine met konijn polyclonal anti-β-actine antilichaam (rood). Goed bewaard gebleven apico-basale microtubulus bundels zijn evident in zowel de villosités en de crypte cellen en actine kan gezien worden geconcentreerd in de apicale regio geconfronteerd met de lumen (pijl). Schaal bars = 5 μm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56662/56662fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56662/56662fig4.jpg"> 
Figuur 4: Geïsoleerd kleine intestinale crypte en villi vaste in formaldehyde/methanol en immuno-label voor de microtubuli, EB3 p150gelasteen CLIP-170. Confocale optische secties van de crypte en villi regio's geïsoleerd uit de dunne darm met behulp van 30 mM EDTA en bevestigd in formaldehyde/methanol, gewassen in PBS met 10% geit serum en 0,1% wasmiddel, geblokkeerd in PBS met 10% geit serum en 0,1% wasmiddel, en Immuno-label. (A) Crypt gelabeld met konijn α-tubuline polyclonal antilichaam (rood) en rat monoclonal EB3KT36 antilichaam (groen) en gekleurd voor DNA met DAPI (blauw) met apico-basale microtubuli en EB3 kometen. De omgekeerde enkellijns afbeelding toont duidelijk EB3 kometen in de cellen van de basale crypt suggereren goede behoud van dynamische en stabiele microtubuli. (B) villosités epitheliale cellen aangeduid met konijn polyclonal antilichaam van CLIP-170 (rood, zie ook verwijst naar16) en muis monoclonal p150gelaste antilichaam (groen) toont apicale co lokalisatie. Omgekeerde enkellijns beelden worden hieronder weergegeven. (C) villosités cellen gelabeld met konijn α-tubuline polyclonal antilichaam (rood) en rat monoclonal EB3-KT36 antilichaam (groen) en gekleurd voor DNA met DAPI (blauw) toont apico-basale microtubuli met EB3 langs het lattice. De vereniging EB3 rooster is gemarkeerd in het vergrote beeld terwijl het omgekeerde enkellijns beeld zowel EB3 kometen en lattice vereniging suggereert. Schaal bars = 5 μm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56662/56662fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56662/56662fig5.jpg"> 
Figuur 5: geïsoleerde dubbele punt crypt opgelost in methanol, immuno-label voor ninein en E-cadherine, en gekleurd met DAPI. Confocale optische sectie van de basale en doorvoer-sturen een crypte provincie geïsoleerd van de dikke darm met behulp van 3 mM EDTA opgelost in methanol, gewassen in PBS met 1% geit serum en 0,1% wasmiddel, en geblokkeerd in PBS met 10% geit serum en 0,1% wasmiddel. De crypte was gelabeld met konijn ninein polyclonal antilichamen (Pep3, zie ook verwijzing8, rood) en muis monoklonaal antilichaam van E-cadherine (groen) en gekleurd met DAPI (blauw). De omgekeerde enkellijns afbeelding toont ninein alleen. De afbeelding toont een goed bewaarde crypte met E-cadherine onthullen de omtrek van de afzonderlijke cellen en ninein geconcentreerd op de apicale centrosomes. Het suggereert dat goede doordringing van fixeer en antilichamen, en het behoud van de antigenicity. Schaal bar = 5 μm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56662/56662fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56662/56662fig6.jpg"> 
Figuur 6: Organoid ontwikkeling, fixatie en immuno-labeling van geïsoleerd organoids. (A) fase contrast weergegeven: verschillende stadia van ontwikkeling van de organoid van de cel aggregaten te cyste met bud initiatie en volledig beelden gevormd organoids met crypte en villosités domeinen.(B--F) Confocale optische secties via organoids geïsoleerd uit kelder matrix met behulp van de oplossing van de gegevensterugwinning van de cel bij 4 ° C (10 min) gevolgd door formaldehyde/methanol fixatie, wassen in PBS met 10% geit serum en 0,1% wasmiddel, blokkeren in PBS met 10% geit serum en 0,1% wasmiddel en immuno-labeling voor microtubuli, β-catenine en EB1. (B) Organoid cyste gelabeld voor microtubuli (blauw) en β-catenine (rood) onthullen goede microtubulus behoud en etikettering in de meeste cellen. (C) verschillende apico-basale microtubuli zijn duidelijk in deze uitgebreide epitheliale cellen uit een organoid cyste. (D) delen van cellen die zijn gelabeld voor microtubuli tonen spindels met inbegrip van astral (dynamische) microtubuli (pijl). (E, F) Villosités domein (E) en de crypte domein (F) organoid regio's tonen enkele EB1 labeling langs de tralie van stabiele microtubuli, vooral in de villosités, terwijl weinige EB1 kometen zijn gezien zelfs binnen de basale crypte suggereren dat dynamische microtubuli zijn niet bewaard gebleven. Schaal bars = 20 μm (A); 2 μm (D); 5 μm (B, C, E-F). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56662/56662fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56662/56662fig7.jpg"> 
Figuur 7: Organoids vaste binnen de matrix van de kelder in formaldehyde/methanol en immuno-gelabeld voor microtubuli en ninein. Confocale optische gedeelten van organoids vast in formaldehyde/methanol, gewassen en geblokkeerd in PBS met 10% geit serum en 0,1% wasmiddel, en met het label terwijl de resterende in de kelder-matrix. (A-C) Organoid cyste gelabeld voor microtubulus (groen) en ninein (Pep3; verwijzing8, rood) en gekleurd met DAPI (blauw) toont de samengevoegde afbeelding in A en omgekeerd enkellijns beelden voor microtubuli (B) en ninein (C). De afbeeldingen tonen apico-basale microtubuli en apicaal ninein localisatie, zeer goede structurele behoud van de organoid en de penetratie van antilichamen suggereren, alsmede het ruimen van niet-afhankelijke antistoffen. (D, E) Organoid met ontwikkelen van crypt vast en zoals hierboven aangeduid en opnieuw weergegeven: uitstekende structurele behoud, labelen en ruimen van antilichamen. Verschillende apico-basale microtubuli en apicaal n-MTOC ninein lokalisatie is duidelijk en gemarkeerd in het vergrote beeld (E) van de boxed Gewest in D. Schaal bars = 10 μm (A-D); 5 μm (E). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56662/56662fig7large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56662/56662fig8.jpg"> 
Figuur 8: Organoids vaste binnen de matrix van de kelder in methanol en immuno-gelabeld voor microtubuli en EB1. Confocale optische gedeelten van organoids opgelost in methanol, gewassen en geblokkeerd in PBS met 10% geit serum en 0,1% wasmiddel, en aangeduid, terwijl de resterende in de kelder-matrix. (A) cyste domein van een volledig ontwikkelde organoid aangeduid met konijn polyklonale α-tubuline (rood) en muis van monoclonal antilichamen van de EB1 (groen) toont apico-basale microtubuli, spindels (pijl) in twee verdelen cellen en afzonderlijke EB1 kometen. Sommige overlapping van niet-afhankelijke EB1 antilichamen is duidelijk. Echter, goede structurele behoud en etikettering van microtubuli en EB1 wordt waargenomen. De aanwezigheid van EB1 kometen suggereert dat dynamische microtubuli bewaard zijn gebleven (A, omkeren). (B) omgekeerde beeld van organoid cyste regio tonen α-tubuline antilichaam labelen met aanzienlijke antilichamen gevangen in de omliggende kelder matrix (pijl). Schaal bars = 5 μm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56662/56662fig8large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56662/56662fig9.jpg"> 
Figuur 9: Organoids vast binnen de matrix van de kelder in 1% PFA en immuno-label voor Lgr5 en CD24. Confocale optische gedeelten van organoids vast binnen de matrix van de kelder in 1% PFA in PBS met 0,1% wasmiddel, gewassen in PBS met 1% geit serum en 0,1% wasmiddel, en gelabeld met antilichamen tegen Lgr5 en CD24. (A, B) Stamcel niche binnen een domein van de crypte tonen Paneth cellen positief voor CD24 (rood). De confocal en fase contrast beelden zijn samengevoegd in A. B toont het labelen van één kanaal van CD24. (C) stamcel regio binnen een domein van de crypte weergegeven: een cel van de stam van Lrg5 positief. Schaal bars = 10 μm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56662/56662fig9large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/56662/56662table1.jpg"> 
Tabel 1: tijdlijn van kleine intestinale crypte en villi afzondering en fixatie. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56662/56662table1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Presenteren wij protocollen voor isolatie van intestinale 3D structuren uit weefsel in vivo en in vitro kelder matrix ingesloten organoids, en detail verschillende fixatie en kleuring van protocollen die zijn geoptimaliseerd voor immuno-labeling van microtubuli, centrosomal en regulates eiwitten zo goed zoals markeringen met inbegrip van de stamcel proteïne Lgr5 cel.

Immuno-belichting fluorescerende etikettering van microtubuli en Centrosomal eiwitten in Ex Vivo intestinale weefsel en 3D In Vitro intestinale Organoids

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

Het algemene doel van deze procedure is om 3D in vitro basement matrix ingebedde intestinale organoïden te isoleren en vervolgens de microtubuli en centrosomale eiwitten te fixeren en immunolabelen. 3D in vitro organoïden zijn ideale modellen voor het bestuderen van belangrijke biologische vragen in cel- en ontwikkelingsbiologie. Maar het lokaliseren van endogene eiwitten en structuren in 3D-modellen is complexer dan in 2D-cultures.Belangrijk is dat het fixatief de delicate 3D-architectuur moet behouden terwijl het ook de antigeniciteit van het antilichaam behoudt. De gepresenteerde methoden omvatten isolatie, fixatie en immunolabeling van een 3D in vitro intestinale organoïde. Maar de fixatie- en immunolabelingprotocollen kunnen ook worden gebruikt in ex vivo geïsoleerd weefsel.Het belangrijkste voordeel van het gepresenteerde formaldehyde methanol fixatieprotocol is dat het de 3D-structuren behoudt terwijl het ook de antigeniciteit behoudt. Het maakt een goede penetratie en opruiming van post-gefixeerde tevel antilichamen mogelijk voor effectieve labeling van microtubuli, actinefilamenten en bindingseiwitten en verschillende centrosomale eiwitten, inclusief ninein. Het demonstreren van de procedure zal worden gedaan door doctor Deborah Goldspink, een formeel postdoc in mijn lab, en doctor Zoe Matthews, een co-auteur.Na de isolatie van intestinale crypten en villi kunnen geïsoleerde epitheliale structuren worden gefixeerd voor immunokleuring. De geïsoleerde crypten kunnen afwisselend worden geplaatst in matrix domes die vervolgens organoïden zullen vormen. Na ongeveer vijf tot zeven dagen incubatie zullen organoïden zijn gevormd.Gebruik 500 microliters RT-PBS om de putjes met de basement matrix domes met organoïden te wassen. Voeg vervolgens 250 microliters koude celrecuperatieoplossing toe aan elk putje. Gebruik vervolgens een P1000 micropipet om de basement matrix domes te schrapen en voorzichtig op en neer te pipetten door het gehele putje om de basement matrix te breken en te verwijderen van het plastic.Zorg ervoor dat de recuperatieoplossing koud is om de matrix af te breken. Bij het schrappen, gebruik alleen een P1000 micropipet zodat je de organoïden niet breekt en ze intact blijven. Verzamel de supernatant in 1,5 milliliter lage binding microcentrifugebuisjes.Keer vervolgens de buis meerdere keren om en controleer onder een microscoop met een vergroting van 50 keer of de organoïden zijn geïsoleerd, vrij bewegend zijn en niet in klonten zitten. Pel de organoïden door centrifugatie bij 1.000 g en kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Verwijder vervolgens het recuperatiereagens en ga onmiddellijk door met fixatie.Om eerder geïsoleerde organoïden met formaldehyde en methanol te fixeren, resuspendeer de organoïden in negatieve 20 graden Celsius formaldehyde methanol fixatiefoplossing. Incubeer de organoïden bij min 20 graden Celsius in een vriezer gedurende 15 minuten, waarbij het buisje om de vijf minuten wordt omgekeerd. Pel de organoïden vervolgens door centrifugatie bij 1.000 g gedurende vijf minuten.Verwijder het fixatief en voeg vervolgens de wasoplossing toe die bestaat uit PBS met 1% secundair antilichaamsoorten serum of PBS met 0,1% detergent en 1% serum. Nadat het monster is gepelleteerd zoals hiervoor, verwijder de wasoplossing en resuspendeer het monster in verse wasoplossing. Gebruik een buisrotator om de cellen gedurende een totaal van een uur te wassen, door elke 15 minuten de organoïden te pelletten door centrifugatie en de wasoplossing te vervangen.Om de intestinale organoïdemonsters te blokkeren, voeg 10% secundair antilichaamsoorten serum toe aan PBS. Pel de organoïden bij 1.000 g gedurende vijf minuten en verwijder het supernatant. Voeg één milliliter blokkeeroplossing toe aan elk monster om in de verschillende antilichamen te incuberen.Vervolgens incubeer de monsters en blokkeeroplossing op een buisrotator bij kamertemperatuur gedurende één uur. Verdun vervolgens de primaire antilichamen in PBS met 10% serum en 0,1% detergent. Gebruik vervolgens de primaire antilichaamsoplossing om het organoïdpellet te resuspenderen nadat de monsters zijn gecentrifugeerd en het blokkeermiddel is verwijderd.Roteer de buizen gedurende een nacht bij 20 RPM en vier graden Celsius om de organoïden in suspensie te houden. De volgende dag brengt u de monsters terug naar kamertemperatuur op de buisrotator gedurende één uur. Na het centrifugeren van het monster, verwijder de primaire antilichaamsoplossing, voeg één milliliter wasoplossing toe aan elk buisje en resuspendeer de organoïdpellets.Vervolgens verwijdert u onmiddellijk de oplossing door centrifugatie. Voeg één milliliter verse wasoplossing toe en meng de cellen gedurende twee uur op een buisrotator bij 20 RPM. Verdun vervolgens de secundaire antilichamen in PBS met 1% serum en 0,1% detergent.Na het pelletten van het weefsel, resuspendeer de pellets in 200 microliters secundaire antilichaamsoplossing. Incubeer de buizen gedurende één uur op een buisrotator bij kamertemperatuur. Na het centrifugeren en verwijderen van het supernatant, resuspendeer het pellet in wasoplossing en centrifugeer de monsters onmiddellijk om de organoïden te pelletten.Vervolgens verwijdert u het supernatant en resuspendeert u het pellet in één milliliter verse wasoplossing. Meng de monsters gedurende 1,5 tot twee uur op een buisrotator bij kamertemperatuur, waarbij het wasoplossing elke 20 tot 30 minuten wordt vervangen zoals eerder beschreven. Om de organoïden te monteren, voegt u na het centrifugeren en verwijderen van alle wasoplossing twee druppels hard-set montagemedium met antifade reagens toe aan het pellet.Snijd het uiteinde van een P200 micropipet af en resuspendeer voorzichtig het pellet in het montagemedium. Bij het resuspenderen van gefixeerde en gekleurde organoïden in montagemedium, wees voorzichtig om geen luchtbellen te introduceren. Als er luchtbellen aanwezig zijn, laat ze dan naar het oppervlak drijven en vermijd ze dan over te brengen naar de dia.Gebruik de micropipet om de organoïden met montagemedium in een lijn langs het midden van een microscoopdia te doseren. Plaats vervolgens voorzichtig een dekglaasje erover en vermijd het genereren van luchtbellen. Plaats de dia in een diaboek en bewaar hem een nacht in de koelkast om het montagemedium te

immuno-fluorescent-labeling-microtubules-centrosomal-proteins-ex-vivo

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

This video describes the technique of immunofluorescent staining of intact prostate cancer organoids and their imaging by whole-mount confocal microscopy. This technique aims to evaluate the ex vivo differentiation capacity of basal and luminal prostate epithelial cells.

Whole-mount Immunofluorescence Imaging: A Fixing and Staining Technique to Evaluate Intact Organoids

This video illustrates an immunofluorescence-based method for visualizing intestinal tuft cells in free-floating mouse jejunum cryosections. Within the intestinal villi, the co-localization of green fluorescence at the luminal tip with an extended red rootlet mass indicates the presence of tuft cells.

An Immunofluorescence-Based Method for Visualizing Tuft Cells in Jejunum Cryosections

Verbeterde beeldvormingstechnologie maakt driedimensionale beeldvorming van organen mogelijk tijdens de ontwikkeling. Hier beschrijven we een systeem voor de kweek van hele organen dat levende beeldvorming van de zich ontwikkelende villi in de foetale muizendarm mogelijk maakt.

Muis Foetale Hele Darm Cultuur System voor Ex Vivo Manipulatie van signaalwegen en Driedimensionale Live-Imaging van Villus Development

Het enterische zenuwstelsel (EZS) is een netwerk van neuronen en gliacellen in de darmwand dat intestinale reflexen controleert. Dit protocol beschrijft methoden voor het opnemen van de activiteit van enterische neuronen en gliacellen in levende bereidingen van EZS met behulp van Ca2+ beeldvorming.

In Situ Ca 2+ Beeldvorming van het enterische zenuwstelsel

De transparante C. elegans darm kan dienen als een"in-vivo weefsel kamer" voor de studie van apicobasal membraan en lumen biogenese de eencellige en subcellular niveau tijdens meercellige tubulogenesis. Dit protocol beschrijft hoe te combineren met het standaard labeling, verlies-van-functie genetische/RNAi en microscopische benaderingen te ontleden van deze processen op een moleculair niveau.

C. elegans darm als een Model voor intercellulaire Lumen genuitdrukking en In Vivo gepolariseerde biogenese van eencellige niveau: Labeling door antilichaam kleuring, RNAi verlies-van-functie analyse en beeldvorming

Dit protocol beschrijft de meting van epitheliale barrière permeabiliteit in real-time volgende farmacologische behandeling in menselijke intestinale organoids met behulp van fluorescentie microscopie en levende cel microscopie.

Real-time meting van epitheliale barrière permeabiliteit in menselijke intestinale Organoids

Kuga et al. ontdekt dat fosforylatie-status specifieke antilichamen tegen de actine bindende eiwit girdin phosphorylated op tyrosine 1798 (pY1798) kunnen worden gebruikt om het label tuft cellen (TCs). Dit protocol staat robuuste visualisatie van televisiecamerasystemen gebruik immunefluorescentie verkleuring van de vrij zwevende jejunum cryosecties met pY1798 antilichamen.

Gebruik van Anti-phospho-girdin antilichamen te visualiseren van intestinale Tuft cellen in zwevende muis Jejunum cryosecties

We beschrijven een methode om GFP-gelabeld γδ IELs met behulp van intravital Imaging van muizen dunne darm te visualiseren door omgekeerde spinnen schijf confocale microscopie. Deze techniek maakt het bijhouden van levende cellen in het slijmvlies voor maximaal 4 uur en kan worden gebruikt om een verscheidenheid van intestinale immuun-epitheel interacties te onderzoeken.

Intravital beeldvorming van epitheliale lymfocyten in muizen dunne darm

Hier presenteren we een protocol voor geoptimaliseerde on-section correlatieve licht-elektronenmicroscopie op basis van endogene, fluorescerende labeling als een hulpmiddel om de lokalisatie van zeldzame eiwitten in relatie tot cellulaire ultrastructuur te onderzoeken. De kracht van deze aanpak wordt aangetoond door ultrastructurele lokalisatie van endogene LC3 in uitgehongerde cellen zonder behandeling met Bafilomycine.

Ultrastructurele lokalisatie van endogene LC3 door middel van on-section correlatieve licht-elektronenmicroscopie

Hier beschrijven we de constructie van een basis driedimensionaal (3D) intestinale cellijnmodelsysteem en een paraffine-inbeddingsprotocol voor lichtmicroscopische evaluatie van vaste darmequivalenten. Kleuring van geselecteerde eiwitten maakt de analyse van meerdere visuele parameters van een enkel experiment mogelijk voor mogelijk gebruik in preklinische onderzoeken naar geneesmiddelen.

Basis driedimensionaal (3D) darmmodelsysteem met een immuuncomponent

We presenteren een stapsgewijs protocol voor hoge-resolutie, labelvrije en driedimensionale beeldvorming van organoïden met behulp van low-coherence holotomografie. Dit protocol beschrijft de voorbereiding van de organoïdecultuur, de beeldvorming en de computationele beeldanalyse, waardoor real-time visualisatie van structurele dynamiek en geneesmiddelresponsen in levende organoïden mogelijk is.

Labelvrije 3D-beeldvorming met hoge resolutie en machine learning-analyse van darmorganoïden via holotomografie met lage coherentie

Leer immunolabeling van microtubuli en centrosomale eiwitten in 3D darmorganoids en ex vivo weefsel met formaldehyde-methanol fixatie. Deze methode behoudt de 3D-architectuur en antigeeniteit voor effectieve fluorescentie-microscopie.

Immuno-belichting fluorescerende etikettering van microtubuli en Centrosomal eiwitten in Ex Vivo intestinale weefsel en 3D In Vitro intestinale Organoids (Video) | JoVE Journal

Immuno-belichting fluorescerende etikettering van microtubuli en Centrosomal eiwitten in Ex Vivo intestinale weefsel en 3D In Vitro intestinale Organoids

Meer video's verkennen