Name: Verzameling na paring sperma van de vrouwelijke voortplantingssysteem en de waardering van sperma vloeibaar in muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: Leer hoe u post-coïtale sperma verzamelt uit het vrouwelijke voortplantingssysteem van muizen en de vloeibaarheidstijd meet. Deze methode biedt inzicht in sperma-mobiliteit en vruchtbaarheidsmechanismen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk wordt ondersteund door College voor diergeneeskunde (WSU) startfonds, gevormd op WW. De auteurs bedanken Sierra Olsen (WSU) voor de kritische lezing van dit manuscript.

Alle dieren en procedures die gebruikt worden in deze studie werden behandeld volgens de Washington State University (WSU) Animal Care en gebruik Comité richtsnoeren en met inachtneming van de WSU-goedgekeurde dierlijke protocollen #4702 en #4735.
1. muizen
<ol><li>
Gebruik standaard C57BL/6J volwassen mannelijke muizen of andere stammen van belang. Het houden van dieren onder een temperatuur - en vocht-gecontroleerde omgeving, met ad libitum toegang van water en voedsel.
	<ol>
<li>Gebruik mannelijke fokkers variërend van 8 weken oud tot 10 maanden oud. Gebruik alleen bewezen kwekers in de experimenten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Volwassen vrouwelijke muizen met een selectieve schrapping van weefsel van voortplantingssysteem oestrogeen receptor α (gecodeerd door Esr1 gen) gebruiken in de epitheliale cellen10 (Wnt7aCre / +; Esr1f/f, knock-out of "KO" genoemd) en controle van nestgenoten (Esr1f/f, genaamd "CTRL") in deze studie.
	<ol>
<li>Gebruik 8 weken oude vrouwtjes. Leeftijden van vrouwtjes gevarieerd afhankelijk van het experiment van belang.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Het bepalen van de stadia van de oestrische cyclus in de ochtend om 08:00 uur. Gebruik alleen vrouwtjes in de estrus fase van de cyclus. Voor gedetailleerde methoden van vaginale smeren en cytologische analyse, verwijzen naar de eerder gepubliceerde procedures11.</li>
</ol>2. voortplanting en beoordelen van Copulatory stekkers
<ol><li>Op de dag van estrus (16:00 h), het huis van de vrouwelijke in een man in de kooi.</li>
	<li>De volgende ochtend (08:00 h), scheiden de vrouwtjes van de mannelijke muis.</li>
	<li>Gebruik een aanpassing van een eerder gepubliceerde methode12 om de aanwezigheid of afwezigheid van een vaginale of copulatory stekker als indicatie van de paring.</li>
	<li>Houd de vrouwelijke muis uit de basis van de staart te kort heffen de achterste ledematen.</li>
	<li>Zoek de copulatory stekker van de aanwezigheid van een gebroken witte baanbrekende coagulum bij de vaginale opening met een tandenstoker. Als de stekker van de copulatory aanwezig is, zal de tandenstoker niet zitten kundig voor het vaginale kanaal worden ingevoegd.</li>
</ol>3. voorbereiding voor weefsel collectie
<ol><li>Bereiden van 10 mL Leibovitz van L-15 media, aangevuld met 1% foetale runderserum (genaamd L15 media + 1% FBS) in een tube van 15 mL. Incubeer bij 37 ° C gedurende 15 min. in waterbaden media.</li>
	<li>Oog op het behoud van de levensvatbaarheid van het weefsel en sperma voor downstream toepassingen, aliquoot 2 mL voorverwarmde L15 media + 1% FBS in een microcentrifuge van 2 mL tube voor weefsel collectie.</li>
	<li>Warm de fase van de stereomicroscoop tot 37 ° C. De warmte-blok ingesteld op 37 ° C en plaats een lege 1,5 mL microcentrifuge buis in het blok.</li>
	<li>Indien de downstream toepassingen beeldvorming van de beweeglijkheid van de zaadcellen vereisen, warm het glasplaatje tot 37 ° C.</li>
</ol>4. de weefsels collectie
<ol><li>Voorverwarmde L15 media + 1% FBS aliquot brengen door het weefsel collectie gebied.</li>
	<li>Het vrouwtje euthanaseren (~ 08: 30h) met behulp van kooldioxide verstikking gevolgd door cervicale dislocatie. Opmerking: Dit is ongeveer 8 h na de paring, ervan uitgaande dat paring om middernacht plaatsvindt.</li>
	<li>Plaats het dier in een liggende positie voor het blootstellen van de buikstreek.</li>
	<li>Spray 70% alcohol op de buik in de buurt van hind ledematen.</li>
	<li>Gebruik de ontleden schaar te maken een kleine snede (~ 1 cm) op de huid van de onderbuik.</li>
	<li>Gebruik van de dominante hand te trekken van de staart (en hind ledematen indien nodig) terwijl niet-dominante hand de huid in de tegenovergestelde richting (richting het hoofd trekt) om de buikspier bloot te stellen. Deze methode wordt gebruikt om te minimaliseren van de hoeveelheid haar besmetting van de viscerale organen.</li>
	<li>Snijd de buikspier in een V-vorm aan de voet van de buik, grenzend aan de vagina, de viscerale organen bloot te stellen.</li>
	<li>Darmen en buikvet verplaatsen naar de kant het voortplantingskanaal bloot te stellen.</li>
	<li>Trim uit blaas en andere weefsels boven het vaginale gebied.</li>
	<li>Snijd de symphysis pubica apart toegang te krijgen tot het vaginale weefsel.</li>
	<li>Til het vaginale weefsel bij de vaginale opening, en met behulp van schaar te scheiden van het vaginale kanaal van het rectale weefsel.</li>
	<li>Trim zorgvuldig uit de mesenterische vet aan weerszijden van de baarmoeder met behulp van voorjaar schaar. Let op: De baarmoeder is erg kwetsbaar met het sperma binnen. Wees voorzichtig niet te doorprikken van de baarmoeder, of anders het sperma zal worden verloren.</li>
	<li>Til het lagere voortplantingskanaal en snijd de ovariële vet pad off van beide zijden.</li>
	<li>Breng het geheel voortplantingskanaal in de buis van de voorverwarmde Leibovitz L-15 media + 1% FBS.</li>
</ol>5. meting van de sperma vloeibaar (viscositeit) uit uteriene inhoud collectie
<ol><li>Het verwarmde werkgebied van de stereomicroscoop, overdracht van de weefsels in een 35 mm steriele weefselkweek schotel gevuld met 3,5 mL pre opgewarmd L-15 media + 1% FBS te reinigen van de weefsels van bloed en andere verontreinigingen. Let op: Tijdens het wassen, grijpen de weefsels door het vet, niet de baarmoeder. Op dit punt het sperma wordt verwacht worden binnen de baarmoeder intact.</li>
	<li>DEP de weefsels van overtollige media gebruikend laboratorium afveegt.</li>
	<li>Houd het weefsel vaginale eind terwijl de plaatsing van de ovariële uiteinden in de voorverwarmde microcentrifuge buis. Houd het vaginale einde en snijd de baarmoeder horens aan de voet van de baarmoeder, waardoor de baarmoeder horens te vallen in de buis microcentrifuge.</li>
	<li>Laat de sperma in de buis stromen uit de baarmoeder horens. Gebruik tandeloze pincet te zachtjes knijpen de baarmoeder horens ovariële na daartoe de vaginale uitzetting uit overgebleven sperma.</li>
	<li>Negeren van de weefsels in biohazard zak en verbranden.</li>
	<li>Kort spin down het sperma in een minicentrifuge (~ 1-2 s).</li>
	<li>Leg de buis, parallel aan de verwarmde fase - sperma zal niet morsen uit.</li>
	<li>De timer klaar hebben en ingesteld op 'tellen'.</li>
	<li>Een 25 µL capillair in het sperma monster bij een hoek van 180° (parallel aan de buiswand) invoegen. Dit is om te minimaliseren van de variabiliteit tussen elke onderzoeker uit het bezit van het capillair onder verschillende hoeken.</li>
	<li>Druk op de timer zodra het capillair maakt contact met het sperma.</li>
	<li>Het opnemen van de tijd (s) die nodig is voor het sperma tot de 25 µL-lijn.</li>
	<li>Wanneer de meting is voltooid, onmiddellijk zet de buis met sperma terug in de droge hitte blok voor verdere functionele analyse, zoals video beeldvorming van de beweeglijkheid van de zaadcellen.</li>
	<li>Ontsmetten van het capillair met sperma door de buis in 10% bleekwater oplossing gedurende 20 minuten onder te dompelen en gooi het capillair in de container slijpsel.</li>
</ol>6. video beeldvorming van de beweeglijkheid van de zaadcellen
<ol><li>Zet de Microscoop en video imagingsoftware.</li>
	<li>Pipetteer 20 µL van het resterende sperma op de voorverwarmde glasplaatje, terwijl het glasplaatje in het verwarmde werkgebied is geplaatst.</li>
	<li>Dek af met een dekglaasje glas aan.</li>
	<li>Leg de dia dekglaasje aan kant naar beneden in de Microscoop.</li>
	<li>Gebruik 20 X objectief te vinden interessegebied.</li>
	<li>100 X objectief voor video imaging omzetten.</li>
	<li>Vastleggen van de video op 12 frames/s (fps) voor 30 s.</li>
	<li>Willekeurig het opnemen van de video's in ten minste 3 verschillende gebieden per dier.</li>
	<li>Uitvoeren van de beeldvorming snel en blootstelling aan licht naar de dia te minimaliseren om de beweeglijkheid van de zaadcellen en levensvatbaarheid te behouden. Opmerking: Deze beeldvormende procedure moet gebeuren binnen 2-3 min.</li>
	<li>Het uitvoeren van de gegevensanalyse met behulp van ImageJ software als eerder beschreven8.</li>
</ol>

<ol><li>Suarez, S. S., Pacey, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+transport+in+the+female+reproductive+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod+Update%22%5BJournal%5D)">Sperm transport in the female reproductive tract.</a> Hum Reprod Update. 12 (1), 23-37 (2006).</li>
<li>Bedford, J. M., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+sperm+motility+after+mating+in+the+rat+and+hamster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Androl%22%5BJournal%5D)">Initiation of sperm motility after mating in the rat and hamster.</a> J Androl. 13 (5), 444-449 (1992).</li>
<li>Lilja, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+of+semenogelin%5BTitle%5D)+AND+%22Andrologia%22%5BJournal%5D)">Cell biology of semenogelin.</a> Andrologia. 22 Suppl 1, 132-141 (1990).</li>
<li>Lilja, H., Abrahamsson, P. A., Lundwall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semenogelin%2C+the+predominant+protein+in+human+semen.+Primary+structure+and+identification+of+closely+related+proteins+in+the+male+accessory+sex+glands+and+on+the+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Semenogelin, the predominant protein in human semen. Primary structure and identification of closely related proteins in the male accessory sex glands and on the spermatozoa.</a> J Biol Chem. 264 (3), 1894-1900 (1989).</li>
<li>Veveris-Lowe, T. L., Kruger, S. J., Walsh, T., Gardiner, R. A., Clements, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seminal+fluid+characterization+for+male+fertility+and+prostate+cancer%3A+kallikrein-related+serine+proteases+and+whole+proteome+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Thromb+Hemost%22%5BJournal%5D)">Seminal fluid characterization for male fertility and prostate cancer: kallikrein-related serine proteases and whole proteome approaches.</a> Semin Thromb Hemost. (33), 87-99 (2007).</li>
<li>Emami, N., Deperthes, D., Malm, J., Diamandis, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Major+role+of+human+KLK14+in+seminal+clot+liquefaction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Major role of human KLK14 in seminal clot liquefaction.</a> J Biol Chem. 283 (28), 19561-19569 (2008).</li>
<li>Gerhard, I., Roth, B., Eggert-Kruse, W., Runnebaum, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+kallikrein+on+sperm+motility%2C+capillary+tube+test%2C+and+pregnancy+rate+in+an+AIH+program%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Androl%22%5BJournal%5D)">Effects of kallikrein on sperm motility, capillary tube test, and pregnancy rate in an AIH program.</a> Arch Androl. 24 (2), 129-145 (1990).</li>
<li>Li, S., Garcia, M., Gewiss, R. L., Winuthayanon, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crucial+role+of+estrogen+for+the+mammalian+female+in+regulating+semen+coagulation+and+liquefaction+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Crucial role of estrogen for the mammalian female in regulating semen coagulation and liquefaction in vivo.</a> PLoS Genet. 13 (4), e1006743(2017).</li>
<li>Elia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+semen+hyperviscosity%3A+prevalence%2C+pathogenesis+and+therapeutic+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+J+Androl%22%5BJournal%5D)">Human semen hyperviscosity: prevalence, pathogenesis and therapeutic aspects.</a> Asian J Androl. 11 (5), 609-615 (2009).</li>
<li>Winuthayanon, W., Hewitt, S. C., Orvis, G. D., Behringer, R. R., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uterine+epithelial+estrogen+receptor+alpha+is+dispensable+for+proliferation+but+essential+for+complete+biological+and+biochemical+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Uterine epithelial estrogen receptor alpha is dispensable for proliferation but essential for complete biological and biochemical responses.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (45), 19272-19277 (2010).</li>
<li>McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performing+vaginal+lavage%2C+crystal+violet+staining%2C+and+vaginal+cytological+evaluation+for+mouse+estrous+cycle+staging+identification%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Performing vaginal lavage, crystal violet staining, and vaginal cytological evaluation for mouse estrous cycle staging identification.</a> J Vis Exp. (67), e4389(2012).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.jove.com/science-education/10293">Lab Animal Research. Fundamentals of Breeding and Weaning.</a> JoVE. , Cambridge, MA (2017).</li>
<li>Prassas, I., Eissa, A., Poda, G., Diamandis, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unleashing+the+therapeutic+potential+of+human+kallikrein-related+serine+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Unleashing the therapeutic potential of human kallikrein-related serine proteases.</a> Nat Rev Drug Discov. 14 (3), 183-202 (2015).</li>
<li>Muytjens, C. M., Vasiliou, S. K., Oikonomopoulou, K., Prassas, I., Diamandis, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Putative+functions+of+tissue+kallikrein-related+peptidases+in+vaginal+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Urol%22%5BJournal%5D)">Putative functions of tissue kallikrein-related peptidases in vaginal fluid.</a> Nat Rev Urol. 13 (10), 596-607 (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Voordelen ten opzichte van sperma analyse in vitro kan verzamelen van sperma van muis baarmoeders geven, zoals de voormalige de fysiologische interacties tussen het sperma en de afscheidingen van de vrouwelijke voortplantingssysteem. illustreren kunt De technieken gepresenteerd in deze studie laten onderzoekers om sperma kwaliteit evenals sperma levensvatbaarheid en beweeglijkheid in ideale fysiologische omstandigheden te bepalen. Bovendien zijn er diverse downstream analyses die kunnen worden uitgevoer...

Het vrouwelijke voortplantingssysteem bestaat uit de bovenste en onderste traktaten. Het bovenste voortplantingskanaal omvat de eileiders, de baarmoeder en de endocervix. Het lagere voortplantingskanaal omvat de ectocervix en de vagina. Bij de mens, wordt het ejaculated sperma gestort op de voorste wand van de vagina, grenzend aan de ectocervix1. Bij muizen, echter is het sperma veegde in de baarmoeder binnen minuten na de paring2.
Sperma bevat baanbrekende gel die is verhard binnen seconden na de ejaculatie, waardoor het sperma te worden in de val gelokt en3geïmmobiliseerd. Vloeibaar brengt het geïmmobiliseerdet sperma door sperma van een gel-achtige omzetten in een waterige consistentie. Dit proces is essentieel voor de beweeglijkheid van de zaadcellen en zoogdieren reproductie. Kennis van sperma vloeibaar is meestal gebaseerd op in vitro studies waar sperma wordt vloeibaar in een cultuur schotel. Bij de mens is de enzymatische activiteit van prostaat specifiek antigeen of PSA (ook bekend als kallikrein-gerelateerde peptidase 3 of KLK3) de grootste bijdrage voor vloeibaar maken door middel van hydrolyse van semenogelins (gel-vormende aanwezige eiwitten in het sperma)4 ,5,6. Afbraak van semenogelins bevrijdt het sperma van de baanbrekende coagulum, mobiliteit van sperma. Bevrijd zaadcellen zwemmen naar de eileider te bevruchten het ei. Vloeibaar (of sperma viscositeit) tests zijn een van de standaard eerste screenings voor semenanalyse in vruchtbaarheid klinieken te beoordelen van de mannelijke vruchtbaarheid7.
Een onlangs gepubliceerde artikel toont aan dat de analyse van zaadvocht vloeistof verzameld uit de vrouwelijke muis voortplantingssysteem na de paring kan worden gebruikt ter illustratie van een tekort aan vloeibaar dat vervolgens leiden vruchtbaarheid gebreken8 tot kan. Defecte vloeibaar zoals sperma hyperviscosity draagt bij aan 11,8-32.3% van onvruchtbaar gevallen in mannen9, suggereert dat de normale vloeibaar onmisbaar voor de voortplanting van de zoogdieren is. Echter, studies en de behandeling van vloeibaar gebreken hebben uitsluitend gericht op de mannelijke7. De mogelijkheid dat het vrouwelijke voortplantingssysteem een rol in het sperma vloeibaar speelt is niet onderzocht. Daarom zal de methoden voor sperma en vloeibaar meettijd bieden onderzoekers een nieuwe diagnostische tool om te bepalen of vloeibaar maken één van de oorzaken van onvruchtbaarheid bij de modelorganisme van belang zou kunnen zijn.

<table><tbody><tr><td>Toothpick</td><td>Diamond</td><td>750-Flat</td><td>Autoclaaf steriel, gebruik stompe tandenstoker. Gebruik geen punt-eindig</td></tr><tr><td>Dissectie schaar</td><td>Fisher</td><td>08-940</td><td></td></tr><tr><td>Veerschaar</td><td>Roboz</td><td>RS-5600</td><td></td></tr><tr><td>Fijne pincet</td><td>Roboz</td><td>RS-5045</td><td></td></tr><tr><td>25-&mu;L glazen capillairbuis</td><td>VWR</td><td>53432-761</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz&rsquo;s L-15 media</td><td>Life Technologies</td><td>11415064</td><td>Supplement met 1% FBS</td></tr><tr><td>Foetaal bovien serum (FBS)</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>1,5-mL microcentrifugebuis</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>2-mL microcentrifugebuis</td><td>Axygen</td><td>MCT-200-A</td><td></td></tr><tr><td>Digitaal droogblokverwarming</td><td>VWR</td><td>13259-052</td><td>Voor het verwarmen van de microcentrifugebuis voorafgaand aan zaadverzameling</td></tr><tr><td>Minicentrifuge</td><td>Corning</td><td>LSE 6765</td><td></td></tr><tr><td>35-mm kweekschaal</td><td>VWR</td><td>10861-656</td><td></td></tr><tr><td>15-mL polypropyleen centrifugebuis</td><td>VWR</td><td>10025-686</td><td></td></tr><tr><td>Waterbad</td><td>Precision</td><td>TSGP05</td><td></td></tr><tr><td>Verwarmde stereomicroscoop</td><td>Leica Microsystems</td><td>MZ10F</td><td>Om het weefsel warm te houden voorafgaand aan zaadverzameling</td></tr><tr><td>Heldereveldmicroscoop</td><td>Leica Microsystems</td><td>DMi8</td><td>Optioneel. Voor videobeelden van de spermamotiliteit</td></tr><tr><td>Camera</td><td>Leica Microsystems</td><td>DMC2900</td><td>Optioneel. Voor videobeelden van de spermamotiliteit</td></tr><tr><td>Glijplaten</td><td>Fisher</td><td>12-552-3</td><td>Optioneel. Voor videobeelden van de spermamotiliteit</td></tr><tr><td>Dekglas</td><td>VWR</td><td>48393-059</td><td>Optioneel. Voor videobeelden van de spermamotiliteit</td></tr><tr><td>Bleekmiddel</td><td></td><td></td><td>Verdun in dH2O tot 10% concentratie</td></tr></tbody></table>

verzameling na paring sperma van de vrouwelijke voortplantingssysteem en de waardering van sperma vloeibaar in muizen

Collection of Post-mating Semen from the Female Reproductive Tract and Measurement of Semen Liquefaction in Mice

Bij muizen, wordt ejaculated sperma gestort in de baarmoeder. Na ejaculatie, verandert het sperma consistentie van gel-achtige te waterig, een proces dat vloeibaar. In deze studie, we laten zien hoe het na ejaculated sperma van het vrouwelijke voortplantingssysteem in een muismodel verzamelen. Eerste, volwassen vrouwelijke muizen in de estrus fase werden gehuisvest in een man de kooi 's nachts. De volgende ochtend, werd copulatie bevestigd door de aanwezigheid van copulatory stekker aan de vaginale opening. Vrouwelijke muizen met copulatory stekkers waren euthanized, en elke voortplantingssysteem verzameld als geheel (vagina, baarmoeder, oviducts, eierstokken), zorgen voor een gesloten systeem om te bevatten het sperma. Het voortplantingskanaal werd geplaatst in een tube van 1,5 mL microcentrifuge, en de vagina werd afgesneden vrij te geven van het sperma in de buis. Om ervoor te zorgen maximale sperma volume voor analyse, tandeloze pincet dienden te knijpen de baarmoeder horens van ovariële einde vaginale daartoe resterende sperma verdrijven. Het hele voortplantingskanaal werd vervolgens weggegooid. De sperma-bevattende buis was kort gesponnen beneden. Capillaire Pipetteer 25 μL werd geplaatst in de buis onder een hoek van 180° (parallel aan de buiswand). De hoeveelheid tijd gebruikt voor het vullen van het capillair aan de 25 μL lijn werd opgenomen. Sperma van een bewezen mannelijke Fokker duurt meestal ongeveer 60-180 s tot een capillaire buis van 25 μL. Dit sperma collectie techniek kan ook worden gebruikt in andere downstream toepassingen zoals sperma beeldvorming en motiliteit analyse.

Sperma werd bijeengezocht uit CTRL en KO vrouwtjes ongeveer 8 h na de paring met vruchtbare CTRL mannetjes. Vloeibaar (of sperma viscositeit) wordt gekwantificeerd door de tijd genomen om de 25 μL capillair vullen met sperma. Sperma van CTRL baarmoeders nam 2.06 ±0.12 min (mean±S.E.M, n = 5) naar de capillaire buis (Figuur 1). Echter het sperma van KO baarmoeders duurde langer dan 60 min (60,0 ±0.0, mean±S.E.M, n = 5) experimentele tijd. Deze gegevens duiden erop dat het sp...

Sperma vloeibaar is vereist voor sperma worden bevrijd van de rudimentaire gel. Deze studie bevat de procedures voor het verzamelen van sperma van de vrouwelijke voortplantingssysteem na coïtus en sperma vloeibaar tijdmeting.

Verzameling na paring sperma van de vrouwelijke voortplantingssysteem en de waardering van sperma vloeibaar in muizen

In mice, ejaculated semen is deposited in the uterus. After ejaculation, the semen changes consistency from gel-like to watery, a process called ...

Het doel van dit onderzoek is om te bepalen hoe post-paring sperma uit het vrouwelijke voortplantingsstelsel kan worden verzameld en hoe sperma-vloeibaarmaking bij muizen kan worden gemeten. De dieren die in dit onderzoek werden gebruikt, werden behandeld volgens de richtlijnen van de Animal Care and Use Committee van de Washington State University en in overeenstemming met WSU-goedgekeurde dierproevenprotocollen 4702 en 4735. Bij mensen wordt het geëjaculeerde sperma afgezet op de voorwand van de vagina naast de ectocervix.Bij muizen wordt het sperma echter binnen enkele minuten na de paring in de baarmoeder geveegd. Sperma bevat een seminale gel die binnen enkele seconden na de ejaculatie stolt waardoor de spermacellen worden geïmmobiliseerd. Het vloeibaarmakingsproces verandert sperma van een gelachtige in een waterige consistentie.Dit proces is essentieel voor de beweeglijkheid van spermacellen en de voortplanting bij zoogdieren. De enzymatische activiteit van het Prostate Specific Antigen of PSA is de belangrijkste bijdrage aan de vloeibaarmaking door hydrolyse van de seminale gel of gelvormend eiwit dat in het sperma aanwezig is. De afbraak van gelvormend eiwit bevrijdt de spermacellen van het seminale coagulum waardoor de beweeglijkheid van de spermacellen toeneemt, zodat de spermacellen naar de bovenste delen van het vrouwelijke voortplantingsstelsel zwemmen om het ei in de eileider te bevruchten.De methode voor het verzamelen van sperma uit het vrouwelijke voortplantingsstelsel en de meting van de vloeibaarmakingstijd die in dit onderzoek wordt gepresenteerd, zal onderzoekers een nieuw diagnostisch hulpmiddel bieden om te bepalen of vloeibaarmaking een van de oorzaken van onvruchtbaarheid kan zijn bij het modelorganisme van belang. Vervolgens zijn de procedures waarbij de muizen worden gekoppeld en de vaginale plug wordt bepaald. Standaard C57BL/6 volwassen mannelijke muizen of andere stammen van belang kunnen worden gebruikt.Alleen vrouwtjes in de oosterfase van de cyclus werden gebruikt. Voor de gedetailleerde methode voor vaginaal uitstrijken en cytologische analyse, verwijs naar de eerder gepubliceerde procedures. Om vier uur 's middagsop de dag van ooster werd het vrouwtje in de kooi van het mannetje gehuisvest. De volgende ochtend om acht uur wordt het vrouwtje van de kooi van het mannetje gescheiden. Met behulp van een steriele platte tandenstoker werd de aanwezigheid of afwezigheid van een depositie van een vaginale of copulatieve plug beoordeeld als een indicatie van paring, met behulp van een procedure die is aangepast van een eerder gepubliceerde methode.Vervolgens is de procedure voor voorbereiding vóór weefselverzameling. Bereid een 10 milliliter Leibovitz's L-15 media aangevuld met 1% foetaal bovien serum of L-15 media plus 1% FBS in een 15 milliliter buis. Verwarm de media gedurende 15 minuten op 37 graden Celsius.Om de levensvatbaarheid van het weefsel en het sperma te behouden voor downstream toepassingen, verdeel twee milliliter media in een twee milliliter buis voor weefselverzameling. Verwarm de stage van de stereomicroscoop tot 37 graden Celsius. Stel de hitteblok op 37 graden Celsius.Plaats een lege buis in de hitteblok. Verwarm ook de glazen plaat tot 37 graden Celsius als de downstream toepassing beeldvorming van spermabeweeglijkheid vereist. Vervolgens zijn de procedures voor weefselverzameling.Hier zijn de hulpmiddelen die zullen worden gebruikt voor weefselverzameling. Euthaniseer het vrouwtje onmiddellijk na het controleren van de plug door koolstofdioxide-asfyxiatie gevolgd door cervicale dislocatie. Plaats het dier in een rugligging om het buikgebied bloot te leggen.Spuit 70% ethanol op de buik. Maak een kleine snede van ongeveer een centimeter op de huid op de onderbuik. Trek de staart en de huid in tegengestelde richtingen om de buikspier bloot te leggen.Snijd de buikspier in een V-vorm aan de basis van de buik. Trek de darmen en buikvet opzij om het voortplantingsstelsel bloot te leggen. Snijd de blaas en andere weefsels boven de vaginale regio weg.Snijd de symphysis pubica uit elkaar om toegang te krijgen tot de vaginale weefsels. Trek het symphysis pubica-gebonden deel met behulp van buistang uit elkaar om het vaginale kanaal bloot te leggen. Til het vaginale weefsel bij de vaginale opening op en gebruik een schaar om het vaginale kanaal te scheiden van het rectale weefsel eronder.Trim zorgvuldig het mesenterisch vet van beide zijden van de baarmoeder met behulp van veerschaar. De baarmoeder is erg kwetsbaar met het sperma erin. Daarom moet de onderzoeker voorzichtig zijn om de baarmoeder niet te puncteren, anders gaat het sperma verloren.Snijd de ovariumvetkussen van beide zijden van de eierstokken af. Breng het hele voortplantingsstelsel over in de buis met voorverwarmd media. Vervolgens is de methode voor meting van spermavloeibaarmaking.Hier zijn de hulpmiddelen voor sperma-verzameling. Breng drie milliliter van het warme media over in een 3,5 centimeter schaal. Breng het weefsel over in de schaal.Was het weefsel verschillende keren door de vetkussen vast te grijpen. Op dit punt zou het sperma nog steeds intact moeten zijn in de baarmoeder. Dep het weefsel op Kimwipes om overtollig media te verwijderen.Houd het weefsel bij het vaginale uiteinde vast en plaats het weefsel in de voorverwarmde buis door de ovariumuiteinden in een lege buis te plaatsen. Snijd beide baarmoederhoorns tussen de vagina en de baarmoeder door. Laat het sperma uit de baarmoederhoorns in de buis stromen.Gebruik tandeloos pincet om voorzichtig te knijpen en het overgebleven sperma in de baarmoederhoorns te verdrijven. Laat het sperma kort een tot twee seconden naar beneden draaien. Leg de buis parallel aan de verwarmde stage.Steek een capillaire buis van 25 microliter in het spermamonster onder een hoek van 180 graden. Dit is om de variabiliteit tussen elke onderzoeker te minimaliseren doordat de capillaire buis onder verschillende hoek

collection-post-mating-semen-from-female-reproductive-tract

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Dit protocol laat zien methoden voor de extractie van sperma van de testikels van de mannetjes en daarna inseminatie vrouwelijke muizen. Deze procedure is handig wanneer precieze tijd nodig is in ontwikkeling studies als transgene werken.

Oogsten Sperma en kunstmatige inseminatie van Muizen

Dit protocol geeft een werkwijze kwantitatieve eencellige voeren in situ analyse van eiwitexpressie van afstamming specificatie mouse pre-implantatie embryo bestuderen. De noodzakelijke voor het verzamelen van blastocysten procedures, whole-mount immunofluorescentie detectie van eiwitten, beeldvorming van de monsters op een confocale microscoop, en nucleaire segmentatie en beeldanalyse worden beschreven.

Kwantitatieve Analyse van eiwitexpressie aan Lineage Specificatie studie in muizenmodellen preimplantatie embryo&#39;s

Het doel van deze zaadvormende squash techniek is te snel beoordelen cytologische kenmerken van ontwikkeling van muis spermatocyten cellulaire integriteit aan te tasten. Deze methode zorgt voor de studie van alle stadia van de spermatogenese, en kan gemakkelijk worden toegepast naast andere biochemische en moleculaire biologische benaderingen voor de studie van muis meiose.

Een Seminiferous zaadvormende Squash techniek voor de cytologische analyse van de spermatogenese met behulp van het muismodel

Veel behandelingen en genetische mutaties van invloed op de timing van seksuele rijpheid en vruchtbaarheid. Dit protocol beschrijft een niet-invasieve methode om te evalueren van de pubertijd begin in muizen en ratten vóór het opzetten van een vruchtbaarheidsonderzoek in seksueel volwassen dieren.

Bepaling van reproductieve bevoegdheid door te bevestigen van pubertijd begin en uitvoeren van een test van de vruchtbaarheid in muizen en ratten

Baarmoeder contracties zijn belangrijk voor het welzijn van vrouwen. Echter, pathologisch verhoogde contractiliteit kan leiden tot dysmenorroe, vooral bij jongere vrouwtjes. Hier beschrijven we een eenvoudige ex vivo voorbereiding waardoor een snelle beoordeling van de werkzaamheid van glad Spierrelaxantia die kunnen worden gebruikt voor de behandeling van dysmenorroe.

Ex vivo-methode voor het beoordelen van het voortplantingsstelsel van muizen spontane beweeglijkheid en een op MATLAB gebaseerd baarmoeder bewegings Volgalgoritme voor gegevensanalyse

In dit artikel wordt beschreven hoe u seksueel gedragstests uitvoeren bij mannelijke muizen.

Beoordeling van seksueel gedrag van mannelijke muizen

De gepresenteerde cervicale manipulatiemethode kan pseudozwangerschap bij muizen induceren zonder dat het nodig is om vrouwtjes te fokken met vasectomie mannetjes. De inductie van pseudozwangerschap is vereist voor het succes van niet-chirurgische embryotransfer en niet-chirurgische kunstmatige inseminatie, die beide ook worden gepresenteerd.

Het induceren van pseudopregnancy bij vrouwelijke muizen zonder de noodzaak van vasectomie bij mannen voorafgaand aan niet-chirurgische embryotransfer of kunstmatige inseminatie

Hier introduceren we een methode voor het uitvoeren van ronde spermatide-injectie (ROSI) bij muizen, een techniek met veelbelovende klinische toepassingen en bruikbaarheid voor het onderzoeken van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de embryonale ontwikkeling.

Muis Ronde Spermatide Injectie

Deze procedure heeft tot doel metabolieten te identificeren die tijdens de bevruchting van sperma naar eicellen worden overgebracht door gebruik te maken van stabiele isotopenlabeling met 2H2O of U13C glucose gevolgd door metabolomische analyse. Stieren met een deuteriumlabel worden gedekt door niet-gelabelde moederdieren. Verzamelde pre-implantatie-embryo's worden geanalyseerd door middel van massaspectrometrie om vaderlijke (gedeutereerde) metabolieten te sorteren van maternale...

Stabiele isotoop in-vivo labeling voor massaspectrometrie-identificatie van vaderlijke metabolieten die tijdens de bevruchting van sperma naar eicel worden overgebracht

Een zeer veelbelovende techniek voor het genereren van weefsel construeert zonder met behulp van matrix aan cultuur cellen in een gesimuleerde microzwaartekracht voorwaarde is. Met behulp van een roterende cultuur systeem, onderzochten we ovariële follikel groei en oöcyt rijping in termen van overleving van de follikel, morfologie, groei en oöcyt functie onder de voorwaarde van de gesimuleerde microzwaartekracht.

In Vitro Groei van de Preantral follikels muis onder gesimuleerde microzwaartekracht

Leer hoe u post-coïtale sperma verzamelt uit het vrouwelijke voortplantingssysteem van muizen en de vloeibaarheidstijd meet. Deze methode biedt inzicht in sperma-mobiliteit en vruchtbaarheidsmechanismen.

Verzameling na paring sperma van de vrouwelijke voortplantingssysteem en de waardering van sperma vloeibaar in muizen

Meer video's verkennen