Cre-lox recombinatie bij muis hersenschors via In Utero Electroporation inducerende
17 november 2017
Cel-autonome functies van genen in de hersenen kunnen worden bestudeerd door het induceren van verlies of winst van functie in dunbevolkte van cellen. Hier beschrijven we in utero electroporation om te Cre recombinase leveren in dunbevolkte corticale neuronen met floxed genen te ontwikkelen om te leiden tot verlies van functie in vivo.
Het algemene doel van deze procedure is om een genetisch mozaïek in de hersenschors van muizen te genereren door Cre-Lox recombinatie te induceren door middel van in utero elektroporatie. Deze methode om genetische mozaïeken te genereren kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de neurobiologie. Zoals het bepalen of een gen noodzakelijk is voor een bepaald neuronaal fenotype op een cell-autonome manier.
Het grootste voordeel van deze techniek is dat het effectieve Cre-Lox recombinatiesysteem wordt gecombineerd met een even effectieve gen-levertechniek in utero elektroporatie. Hoewel deze methode is gericht op het targeten van laag twee-drie corticale neuronen, kan deze worden gebruikt om neuronen in andere corticale laagdieptes te targeten. Toen we probeerden genetische mozaïeken in ons hersenweefsel te maken, kwamen we verschillende problemen tegen om onze experimentele dieren na de geboorte te laten overleven, dus introduceerden we verschillende vereenvoudigingen en verfijningen in onze techniek.
Bereid een pipet voor met een zeer lange tapsheid en zeer fijne punt, typisch voor pipetten voor injectie van embryonale stamcellen of nucleaire overdracht door eerst de glazen capillair in de pipettrekker te steken. Na het vastzetten van de klemmen, activeer het programma voor het trekprotocol, waardoor een tapsheid op de glazen capillair ontstaat. Zorg ervoor dat de lengte van de tapsheid tussen de 10 en 15 mm is met behulp van een samengestelde lichtmicroscoop.
Vervolgens, om de punt van de pipet te breken, wikkel een enkele laag taakdoek over een 50-mL beker en span deze met één hand strak. Met de andere hand, duwt u de getrokken pipet, tapsheid naar beneden, loodrecht door het midden van de doek, waardoor een schone breuk in de tapsheid ontstaat. Controleer de grootte van de opening onder een samengestelde lichtmicroscoop.
Calibreer vervolgens de pipet door 1 mcL van 0,4% Trypan blauw en PBS in een gedeeltelijk gevulde pipet te aspireren en de pipet te gradueren met 1-mcL markeringen op basis van de hoogte van 1 mcL in de pipet. Gebruik de gecalibreerde pipet om andere getrokken pipetten te gradueren voordat u ze weggooit. Plaats de pipetten in de pipethouders vrij van stof en andere deeltjes.
Nadat een drachtig muis op E-15.5 diep is geanesthetiseerd, test u de rechterreflex door de inductiekamer voorzichtig te kantelen en de reactie van de muis op te merken. Als de rechterreflex afwezig is, brengt u de muis over naar het chirurgische voorbereidingsgebied en dient u ingeademd isofluraan toe via een neusdop om een chirurgisch anesthesieniveau te handhaven. Gebruik pincetten om de peesreflex te testen om de anesthesie te verifiëren.
Bewaak de ademhalingssnelheid in de inspanning, kijkend naar diepe, regelmatige ademhaling en dat de slijmvliezen roze van kleur en vochtig zijn. Breng voldoende veterinaire oogzalf aan over de ogen om ze volledig te bedekken ter bescherming tegen uitdroging. Masseer ontharingscreme op de buikstreek met wattenstaafjes totdat het buikhaar oplost.
Veeg vervolgens het buikhaar weg. Reinig zorgvuldig eventuele resterende residuen en ontharingscreme met 70% ethanol en wattenstaafjes. Breng jodium-gebaseerde scruboplossing in een cirkelvormige beweging op de buikstreek aan.
Gebruik vervolgens een chirurgische doek om het operatiegebied te isoleren en steriele omstandigheden te handhaven. Nadat u een 2-cm ventrale middenlijnsnede in de huid heeft gemaakt, vindt u de linea alba om de middenlijn van de rectus abdominis te visualiseren. Trek de spier omhoog en weg van de buik en maak een 2-cm middenlijnsnede om de buikholte bloot te leggen met behulp van aseptische technieken.
Gebruik een steriele 10-mcL micropipettip om carprofen in de buikholte te dispenseren voor analgesie. Klem vervolgens een Hartmann-mosquito pincet op de linkerrand van de rectus abdominis snede. Laat het pincet op een omgekeerde petrischaal naar de linkerkant van de snede rusten, waardoor de linkerkant van de snede open blijft.
Nadat u de rechterkant van de snede op een vergelijkbare manier hebt geklemd, plaats u een gaasje rond het gebied van de snede. Gebruik ringpincetten zonder aangebrachte limietschroef, trek aan de baarmoeder tussen twee naburige embryo's zonder weefsel te pletten of te verwonden. Begin alle embryo's door de snede te trekken, leg ze op het gaasje.
Verbind een gecalibreerde pipet met de aspiratorbuisassemblage en injecteer exact 1 mcL DNA-oplossing bereid door de baarmoederwand in een zijventrikel van elk embryo. Gebruik de duim en wijsvinger om de embryo's te manipuleren, waardoor de embryo's tijdens de injectie voorzichtig tegen de baarmoederwand kunnen worden geduwd. De zijventrikels verschijnen als twee donkerdere vlekken op de dorsale telencephalon van het embryo.
Bevestig een succesvolle injectie door Trypan blauw te observeren dat het zijventrikel vult. Nadat alle embryo's zijn geïnjecteerd, plaats u de kathode van pincet-type elektroden op de baarmoeder, direct boven de mediale en caudale cortex om de visuele cortex te targeten. Plaats de anode net inferieur en anterieur aan het hoofd van het embryo.
Met het voetpedaal, activeer de levering van 550-ms pulsen van 50 volt gescheiden door een 950-ms interval. Nadat alle embryo's zijn geëlektroporeerd, brengt u de baarmoeder terug in de buikholte in dezelfde oriëntatie waarin deze werd gevonden. Gebruik zoutoplossing om de baarmoeder te smeren terwijl u deze handmatig en uiterst voorzichtig begeleidt, zorg ervoor dat embryo's niet uit hun positie in de baarmoeder worden verplaatst.
Sluit de buikspieren met absorbeerbare hechtingen. Gebruik een eenvoudige onderbroken steek, bind de uiteinden met een chirurgische knoop. Sluit de huidlaag met absorbeerbare hechtingen.
Breng een kleine hoeveelheid weefselkleefstof aan om de wond te verzegelen. Breng weefselkleefstof aan op de knopen om losraken te voorkomen. Gebruik een micropipet om eventueel weefselkleefstof rond de wond
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol dat gebruikmaakt van in utero elektroporatie om Cre-Lox recombinatie te induceren in schaarse populaties corticale neuronen bij muizen. De techniek is bedoeld om de celautonome functies van genen binnen de cerebrale cortex van de muis te onderzoeken, wat uiteindelijk bijdraagt aan het begrip van neuronale fenotypes.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Genetische manipulatie
- Ontwikkelingsbiologie
Achtergrond
- Deze benadering maakt gerichte genetische modificaties in de ontwikkelende hersenen mogelijk.
- Het faciliteert de generatie van genetische mozaïeken in een levend model.
- Het targeten van specifieke neuronale lagen verbetert de resolutie van functionele studies.
- De methode is verfijnd om uitdagingen met betrekking tot de overlevingspercentages van embryo's aan te pakken.
Doel van de studie
- Om vast te stellen of specifieke genen noodzakelijk zijn voor bepaalde neuronale fenotypes.
- Om genetische invloeden binnen een gedefinieerde kleine populatie neuronen te onderzoeken.
- Om de overlevingskansen van embryo's tijdens en na experimenten te verbeteren.
Gebruikte methoden
- In utero electroporatie werd gebruikt als methode om Cre-recombinase in ontwikkelende embryo's over te brengen.
- Het belangrijkste biologische model betrof corticale neuronen in de cerebrale cortex van muisembryo's.
- Cruciale stappen omvatten de voorbereiding van de pipet, de injectie in het embryo en de opstelling voor de electroporatie.
- Er wordt nadruk gelegd op de postoperatieve zorg en monitoring van de moeder en de embryo's.
Belangrijkste resultaten
- Deze methode maakt efficiënte loss-of-function studies in vivo mogelijk.
- Specifieke wijzigingen in de genfunctie kunnen de rol van genen bij de neuronale identiteit verduidelijken.
- Het protocol is erop gericht de levensvatbaarheid en overleving van geïnjecteerde embryo's te verbeteren, wat essentieel is voor succesvolle experimentele resultaten.
Conclusies
- De studie demonstreert een betrouwbare methode voor het induceren van genetische veranderingen in specifieke neuronale populaties.
- Deze benadering biedt inzicht in genfunctie binnen de neurobiologie, wat essentieel is voor het begrijpen van neuronale processen en potentiële ziektemodellen.
- De implicaties strekken zich uit tot diverse vakgebieden, waaronder genetisch onderzoek en ontwikkelingsneurowetenschappen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Deze methode maakt celautonome analyse van genfuncties mogelijk in ijle neuronale mozaïeken, wat doelwitvalidatie bij de ontdekking van geneesmiddelen in de neurowetenschappen ondersteunt. Door Cre-lox recombinatie te combineren met in utero elektroporatie, biedt het een reproduceerbaar systeem voor het beoordelen van de noodzakelijkheid en voldoendeheid van genen in vivo. De aanpak helpt bij het mechanistisch verminderen van risico's door geneffecten te isoleren in gedefinieerde corticale populaties, wat bijdraagt aan de betrouwbaarheid van doelwitten in een vroeg stadium.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk via spaarzame mozaïekanalyse van genfuncties in neuronen.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door onderscheid te maken tussen celautonome en niet-celautonome effecten.
- Strategische waarde: Verhoogt de betrouwbaarheid van targets door genfenotypen in vivo te valideren met spaarzame labeling.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert gevalideerde neuronale mozaïeken voor downstream fenotypische screening van genperturbaties.
- Operationele waarde: Standaardiseert schaarse labeling via getitreerde Cre-afgifte, wat de reproduceerbaarheid tussen experimenten verbetert.
- Strategische waarde: Maakt schaalbare preparatie van ziekte-relevante neuronale systemen mogelijk voor compoundscreening.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Biedt ziekterelevante corticale modellen voor het bestuderen van genfuncties in gelaagde neuronale architecturen.
- Operationele waarde: Waarborgt continuïteit van embryonale genmanipulatie tot postnatale morfologische analyse via confocale beeldvorming.
- Strategische waarde: Faciliteert voorspellende risicoreductie door embryonale doelwitmodulatie te koppelen aan structurele neuronale uitkomsten.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode integreert in vroege discovery-workflows door genfunctievalidatie mogelijk te maken voorafgaand aan de fasen van assay-ontwikkeling en lead-identificatie.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing van gen-necessiteit en -sufficiëntie in corticale neuronen via mozaïekanalyse.
- Screening: Levert assay-klare, schaarse neuronale populaties met fluorescente markering voor read-outs op basis van beeldvorming.
- Analytica: Maakt kwantitatieve beoordeling van dendritische en axonale arbor-morfologie en spine-dichtheid als functionele outputs mogelijk.
- Translationeel onderzoek: Verbindt embryonale gen-targeting met postnatale structurele fenotypen, ter ondersteuning van biomarker-gealigneerde validatie.
- Herbruikbaarheid in de praktijk: Vestigt een herbruikbaar platform voor het genereren van genetische mozaïeken over meerdere gentargets en constructen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Predictieve betrouwbaarheid bij targetvalidatie door middel van celautonome fenotypering in vivo.
- Operationele waarde: Gestandaardiseerde elektroporatie en pipetkalibratie verbeteren de reproduceerbaarheid en overlevingstallen.
- Strategische waarde: Vermindert fout-positieven bij de selectie van targets door geneffecten te isoleren in ijle mozaïeken.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van targets mogelijk op basis van gevalideerde neuronale fenotypes.
Overwegingen bij implementatie
- Vereist expertise in embryonale chirurgie, microchirurgie en de behandeling van neuraal weefsel.
- Afhankelijk van gekalibreerde glazen pipetten, electroporatoren en fluorescentie-beeldgevingssystemen.
- Vereist standaardisatie van DNA-constructtiters en injectievolumes voor een consistente verspreiding.
- Omvat aanpassing aan verschillende corticale lagen en embryonale stadia voor een brede toepasbaarheid op doelgebieden.
- Beperkt door variabiliteit in de overleving van embryo's, wat wordt gemitigeerd door verfijnde chirurgische en electroporatieprotocollen.
