Name: Cre-lox recombinatie bij muis hersenschors via In Utero Electroporation inducerende (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: Leer Cre-lox recombinatie in de hersenschors van muizen via in utero elektroporatie. Deze methode maakt gerichte genetische modificaties mogelijk om neuronale fenotypen en genfuncties in vivo te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs bedanken de gulle steun van het James Madison University Department of Biology, James Madison Universiteit licht microscopie en de Imaging faciliteit. Dr. Mark L. Gabriele voor nuttig advies met betrekking tot jonge postnatale weefsel voorbereiding, en Drs. Justin W. Brown en Corey L. Cleland voor gulle coördinatie van chirurgische materialen en ruimte. Dit onderzoek werd gedeeltelijk gefinancierd door een gezamenlijke onderzoeksbeurs door 4-VA, een samenwerkingspartnerschap ter bevordering van de Commonwealth van Virginia (G.S.V.), en door een Virginia Academie van Science kleine onderzoek projectsubsidie (G.S.V.). Ondersteuning is royaal voorzien door een Betty Jo liefdevolle Butler ' 58 Endowment Undergraduate Research beurs (aan K.M.B.), een Farrell zomer onderzoek beurs (voor K.M.B.), een James Madison universiteit tweede eeuw beurs (voor K.M.B.), een James Madison Universiteit Centennial beurs (voor C.J.H.), een James Madison Universiteit Lucy Robinson Search ' 30 Memorial Scholarship (aan Z.L.H.) en een James Madison Hogeschool voor wetenschap en wiskunde de toekenning van de bijstand van de faculteit (aan G.S.V.).

<ol><li>Southwell, D. G., Froemke, R. C., Alvarez-Buylla, A., Stryker, M. P., Gandhi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+plasticity+induced+by+inhibitory+neuron+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cortical plasticity induced by inhibitory neuron transplantation.</a> Science. 327 (5969), 1145-1148 (2010).</li>
<li>Hanson, J. E., Madison, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+FMR1+genotype+influences+the+degree+of+synaptic+connectivity+in+a+mosaic+mouse+model+of+fragile+X+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome.</a> J. Neurosci. 27 (15), 4014-4018 (2007).</li>
<li>Patel, A. B., Hays, S. A., Bureau, I., Huber, K. M., Gibson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Target+Cell-Specific+Role+for+Presynaptic+Fmr1+in+Regulating+Glutamate+Release+onto+Neocortical+Fast-Spiking+Inhibitory+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A Target Cell-Specific Role for Presynaptic Fmr1 in Regulating Glutamate Release onto Neocortical Fast-Spiking Inhibitory Neurons.</a> J. Neurosci. 33 (6), 2593-2604 (2013).</li>
<li>Patel, A. B., Loerwald, K. W., Huber, K. M., Gibson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postsynaptic+FMRP+promotes+the+pruning+of+cell-to-cell+connections+among+pyramidal+neurons+in+the+L5A+neocortical+network%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Postsynaptic FMRP promotes the pruning of cell-to-cell connections among pyramidal neurons in the L5A neocortical network.</a> J. Neurosci. 34 (9), 3413-3418 (2014).</li>
<li>McConnell, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+Copy+Number+Variation+in+Human+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mosaic Copy Number Variation in Human Neurons.</a> Science. 342 (6158), 632-637 (2013).</li>
<li>McConnell, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intersection+of+diverse+neuronal+genomes+and+neuropsychiatric+disease%3A+The+Brain+Somatic+Mosaicism+Network%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Intersection of diverse neuronal genomes and neuropsychiatric disease: The Brain Somatic Mosaicism Network.</a> Science. 356 (6336), eaal1641(2017).</li>
<li>Gu, H., Marth, J. D., Orban, P. C., Mossmann, H., Rajewsky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+a+DNA+polymerase+beta+gene+segment+in+T+cells+using+cell+type-specific+gene+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Deletion of a DNA polymerase beta gene segment in T cells using cell type-specific gene targeting.</a> Science. 265 (5168), 103-106 (1994).</li>
<li>Hodges, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+Contributions+to+Synaptic+and+Learning+Abnormalities+in+a+Mouse+Model+of+Fragile+X+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Astrocytic Contributions to Synaptic and Learning Abnormalities in a Mouse Model of Fragile X Syndrome.</a> Biol. Psychiatry. (17), 1-11 (2016).</li>
<li>Young, P., Qiu, L., Wang, D., Zhao, S., Gross, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-neuron+labeling+with+inducible+cre-mediated+knockout+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Single-neuron labeling with inducible cre-mediated knockout in transgenic mice.</a> Nat. Neurosci. 11 (6), 721-728 (2011).</li>
<li>Zong, H., Espinosa, J. S., Su, H. H., Muzumdar, M. D., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+Analysis+with+Double+Markers+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mosaic Analysis with Double Markers in Mice.</a> Cell. 121 (3), 479-492 (2005).</li>
<li>Hippenmeyer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+mosaic+dissection+of+Lis1+and+Ndel1+in+neuronal+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic mosaic dissection of Lis1 and Ndel1 in neuronal migration.</a> Neuron. 68 (4), 695-709 (2010).</li>
<li>De la Rossa, A., Jabaudon, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+rapid+gene+delivery+into+postmitotic+neocortical+neurons+using+iontoporation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vivo rapid gene delivery into postmitotic neocortical neurons using iontoporation.</a> Nat. Protoc. 10 (1), 25-32 (2015).</li>
<li>Lu, W., Bushong, E. A., Shih, T. P., Ellisman, M. H., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell-autonomous+role+of+excitatory+synaptic+transmission+in+the+regulation+of+neuronal+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The cell-autonomous role of excitatory synaptic transmission in the regulation of neuronal structure and function.</a> Neuron. 78 (3), 433-439 (2013).</li>
<li>Duan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semaphorin+5A+inhibits+synaptogenesis+in+early+postnatal-+and+adult-born+hippocampal+dentate+granule+cells%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Semaphorin 5A inhibits synaptogenesis in early postnatal- and adult-born hippocampal dentate granule cells.</a> eLife. 3, 1-24 (2014).</li>
<li>Dixit, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Gene+Delivery+into+Multiple+CNS+Territories+Using+In+utero+Electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In utero Electroporation.</a> J. Vis. Exp. (52), e2957(2011).</li>
<li>Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+in+utero+Electroporation%3A+Controlled+Spatiotemporal+Gene+Transfection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Mouse in utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection.</a> J. Vis. Exp. (54), e3024(2011).</li>
<li>Briz, C. G., Navarrete, M., Esteban, J. A., Nieto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+Electroporation+Approaches+to+Study+the+Excitability+of+Neuronal+Subpopulations+and+Single-cell+Connectivity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity.</a> J. Vis. Exp. (120), (2017).</li>
<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev. Biol. 240 (1), 237-246 (2001).</li>
<li>Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electroporation+in+the+embryonic+mouse+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system.</a> Nature protocols. 1 (3), 1552-1558 (2006).</li>
<li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation%3A+Visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).</li>
<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+expression+of+transgenes+introduced+by+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 10 (3), 1027-1032 (2007).</li>
<li>Pacary, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+Genetic+Manipulation+of+Dendrites+and+Spines+in+the+Mouse+Cerebral+Cortex+and+Hippocampus+using+In+utero+Electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation.</a> J. Vis. Exp. (65), e4163(2012).</li>
<li>Mizuno, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDAR-Regulated+Dynamics+of+Layer+4+Neuronal+Dendrites+during+Thalamocortical+Reorganization+in+Neonates%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">NMDAR-Regulated Dynamics of Layer 4 Neuronal Dendrites during Thalamocortical Reorganization in Neonates.</a> Neuron. 82 (2), 365-379 (2014).</li>
<li>Luo, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supernova%3A+A+Versatile+Vector+System+for+Single-Cell+Labeling+and+Gene+Function+Studies+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Supernova: A Versatile Vector System for Single-Cell Labeling and Gene Function Studies in vivo.</a> Sci. Rep. 6, 35747(2016).</li>
<li>Mader, S. L., Libal, N. L., Pritchett-Corning, K., Yang, R., Murphy, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refining+timed+pregnancies+in+two+strains+of+genetically+engineered+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+animal%22%5BJournal%5D)">Refining timed pregnancies in two strains of genetically engineered mice.</a> Lab animal. 38 (9), 305-310 (2009).</li>
<li>Vidal, G. S., Djurisic, M., Brown, K., Sapp, R. W., Shatz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-Autonomous+Regulation+of+Dendritic+Spine+Density+by+PirB%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Cell-Autonomous Regulation of Dendritic Spine Density by PirB.</a> eNeuro. 3 (5), 1-15 (2016).</li>
<li>Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+estrous+cycle+identification+tool+and+images%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Mouse estrous cycle identification tool and images.</a> PLoS ONE. 7 (4), 1-5 (2012).</li>
<li>Andreu-Agullo, C., Maurin, T., Thompson, C. B., Lai, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ars2+maintains+neural+stem-cell+identity+through+direct+transcriptional+activation+of+Sox2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ars2 maintains neural stem-cell identity through direct transcriptional activation of Sox2.</a> Nature. 481, 195-198 (2011).</li>
<li>Scotto-Lomassese, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fragile+X+mental+retardation+protein+regulates+new+neuron+differentiation+in+the+adult+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fragile X mental retardation protein regulates new neuron differentiation in the adult olfactory bulb.</a> J. Neurosci. 31, 2205-2215 (2011).</li>
<li><a target="_blank" href="https://moodle2.units.it/pluginfile.php/145932/mod_resource/content/0/Plasmids%20101%20eBook%203rd%20Ed%20Final.pdf">Plasmids 101: A Desktop Resource</a>. , 3rd ed, Addgene. Cambridge, Massachusetts. (2017).</li>
<li><a target="_blank" href="https://www.sutter.com/PDFs/pipette_cookbook.pdf">Pipette Cookbook</a>. , rev. ed, Sutter Instrument Company. Novato, California. (2015).</li>
<li>Cuddington, B., Verschoor, M., Mossman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Handling+of+the+Cotton+Rat+in+Studies+for+the+Pre-clinical+Evaluation+of+Oncolytic+Viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Handling of the Cotton Rat in Studies for the Pre-clinical Evaluation of Oncolytic Viruses.</a> J. Vis. Exp. (93), e52232(2014).</li>
<li>Leary, S., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLeary%2C+S+%22AVMA+Guidelines+for+the+Euthanasia+of+Animals%3A+2013+Edition%22">AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition</a>. , American Veterinary Medical Association. Schaumburg, Illinois. (2013).</li>
<li>Anderson, S. A., Eisenstat, D. D., Shi, L., Rubenstein, J. L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interneuron+Migration+from+Basal+Forebrain+to+Neocortex%3A+Dependence+on+Dlx+Genes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Interneuron Migration from Basal Forebrain to Neocortex: Dependence on Dlx Genes.</a> Science. 28 (5337), 474-476 (1997).</li>
<li>Parker, J. M., Austin, J., Wilkerson, J., Carbone, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Multimodal+Analgesia+on+the+Success+of+Mouse+Embryo+Transfer+Surgery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Assoc.+Lab.+Anim.+Sci%22%5BJournal%5D)">Effects of Multimodal Analgesia on the Success of Mouse Embryo Transfer Surgery.</a> J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 50 (4), 466-470 (2011).</li>
<li>Kim, J. -Y., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23347239">Viral transduction of the neonatal brain delivers controllable genetic mosaicism for visualising and manipulating neuronal circuits in vivo.</a> Eur. J. Neurosci. 37 (8), 1203-1220 (2013).</li>
<li>Pierfelice, T. J., Gaiano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound-Guided+Microinjection+into+the+Mouse+Forebrain+In+Utero+at+E9.5%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5.</a> J. Vis. Exp. (45), e2047(2010).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen conflicten van belang om te vermelden.

Hier introduceren we de combinatie van in utero electroporation met Cre recombinase bij floxed muizen voor het genereren van mozaïek hersenweefsel. Een voordeel van deze aanpak is dat een nieuwe lijn van de muis niet hoeft te worden gegenereerd elke keer een verschillende cellulaire subtype is gericht: in utero electroporation kan worden gebruikt om te richten excitatory neuronen, remmende neuronen of glia afhankelijk van de tijd en de locatie van electroporation15,<su...

Het genereren van een genetische mozaïek is een klassieke experimentele paradigma voor het begrijpen van de functie van een gen van belang. Om te bepalen als een gen noodzakelijk voor een cellulaire fenotype is, wordt de eenvoudigste aanpak veroorzaakt door een verlies van functie van het gen in het organisme (bijvoorbeeld knock-out). Om te bepalen als een gen specifiek in een bepaalde celtype vereist is, is knock-out van het gen in het organisme echter niet een geldige benadering. In plaats daarvan een methode is verplicht die zal leiden tot het verlies van functie van een gen in een bepaalde cel terwijl het wordt omringd door wildtype (dat wil zeggen genetisch onverstoorbaar) weefsel — met andere woorden, het maken van mozaïek weefsel. Als de gemuteerde cel een mutant fenotype toont, maar omringende wildtype cellen niet, de functies van het gen in een cel-autonome wijze. Analyse van mozaïek weefsel, waarin mutantcellen zijn omringd door wildtype weefsel, is ideaal voor het begrijpen van de cel-autonome functies van genen, met name in de hersenen waar neuronen en glia een uitgebreid, onderling verbonden netwerk van weefsel vormen.
Verschillende vormen van mozaïek hersenweefsel hebben verstrekt krachtige modellen om te onderzoeken van cel-autonome functies van genen. Studies gericht op neuronale transplantatie1, vrouwelijke X-gebonden mozaïcisme2,3,4, en endogene somatische mozaïcisme5,6 hun conclusies op basis van mozaïek hebben getrokken hersenweefsel. Voorwaardelijke schrapping van een gen door middel van de Cre-lox recombinatie systeem is een methode die volledig gebruik van de grote beschikbaarheid van transgene muis lijnen maakt. Bij deze methode worden twee loxP sites geïntroduceerd aan weerszijden van een vereiste sequentie van een gen (zoals een exon), waarbij het geflankeerd door loxP sites dat beide in dezelfde richting ("floxed") worden geconfronteerd. CRE recombinase excises de volgorde tussen de sites loxP7. CRE-gemedieerde recombinatie kan worden bereikt door Overstekende floxed muizen naar een andere muis lijn uiting van Cre recombinase samen met een fluorescerende marker in een subset van cellen ("Cre verslaggever lijn"). Dit is aangetoond in een verscheidenheid van manieren om de functies van een gen in subsets van cellen, zoals de excitatory neuronen of astrocyten8bloot te leggen. CRE verslaggever lijnen kunnen uitdrukken CreERT2 zodat Cre-gemedieerde recombinatie als drug-afleidbare (single-neuron labelen met afleidbare Cre-gemedieerde knockout of SLICK)9. In een andere strategie genaamd mozaïek analyse met dubbele markeringen (MADM)10,11, laat Cre-gemedieerde interchromosomal recombinatie een homozygoot mutant naast heterozygoot weefsel worden gemaakt. In deze benaderingen moet een nieuwe lijn van muizen worden geproduceerd elke keer voor elke kandidaat-gen of cellulaire subtype dat wordt getest. Als alternatief, Cre recombinase kan worden ingevoerd postnatale stadium manifesteren door middel van Iontoforese12 of via virale vectoren (b.v. virussen adeno-geassocieerde13 of lentivirussen14 cellulaire subtype-specifieke uitvoering initiatiefnemers). Deze strategie maakt sterke en postnatale labeling. Te richten op ontwikkeling van cerebrale corticale neuronen dunbevolkte en geïnduceerd, is een ideale strategie in utero electroporation van Cre recombinase met een fluorescerende marker.
Naast het combineren van Cre-lox recombinatie door in utero electroporation te produceren mosaic weefsel in vivo, we verscheidene aanpassingen kennismaken met procedures van andere gepubliceerde protocollen15,16, 17,18,19,20,21. Wij bieden informatie om succes in de getimede-zwangere vrouwelijke fokdieren. Wij ook een overzicht van onze twee strategieën in te voeren schaars en heldere labeling van neuronen in de corticale weefsel: een strategie is om de niveaus van een enkele construct codering voor Cre recombinase en een fluorescerende marker22Titreer. Een andere strategie is het gebruik van de "Supernova"-systeem, ontworpen specifiek met deze parameters in gedachten23,24. Daarnaast bieden wij verbeteringen op het produceren van consistente microinjection pipetten en vereenvoudigingen van de in utero electroporation operatie. Tot slot schetsen we kritische stappen in een vereenvoudigde histologisch preparaat dat de analyse van dendritische spines en dendritische en axonale arbors, zonder verdere kleuring of immunohistochemistry toelaat.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6J muizen</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>#000664</td><td>Zie "1. Muisopstelling" (stap 1.1, "wildtype muizen")</td></tr><tr><td>GFP.Cre lege vector</td><td>AddGene</td><td>#20781</td><td>Zie "2. DNA-opstelling" (stap 2.1 "enkelvoudige DNA-construct die codeert voor Cre-recombinase evenals een fluorescente marker"). GFP.Cre lege vector was een geschenk van Tyler Jacks.</td></tr><tr><td>pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova)</td><td>AddGene</td><td>#69138</td><td>Zie "2. DNA-opstelling" (stap 2.1 "Supernova" systeem) en http://snsupport.webcrow.jp/. pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) was een geschenk van Takuji Iwasato.</td></tr><tr><td>pK031.TRE-Cre (Supernova)</td><td>AddGene</td><td>#69136</td><td>Zie "2. DNA-opstelling" (stap 2.1 "Supernova" systeem) en http://snsupport.webcrow.jp/. pK031.TRE-Cre (Supernova) was een geschenk van Takuji Iwasato.</td></tr><tr><td>pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova)</td><td>AddGene</td><td>#85006</td><td>Zie "2. DNA-opstelling" (stap 2.1 "Supernova" systeem) en http://snsupport.webcrow.jp/. pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) was een geschenk van Takuji Iwasato.</td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit (10)</td><td>Qiagen</td><td>#12362</td><td>Zie "2. DNA-opstelling" (stap 2.3 "endotoxine-vrije plasmide-zuiveringskit")</td></tr><tr><td>Trypanblauw poeder, BioReagent-kwaliteit</td><td>Sigma</td><td>T6146-5G</td><td>Zie "2. DNA-opstelling" (stap 2.5 "trypanblauw")</td></tr><tr><td>Natriumchloride, ACS, 2,5 kg</td><td>VWR</td><td>BDH9286-2.5KG</td><td>Zie "2. DNA-opstelling" (stap 2.5 "NaCl")</td></tr><tr><td>Kaliumchloride, ACS, 500 g</td><td>VWR</td><td>#97061-566</td><td>Zie "2. DNA-opstelling" (stap 2.5 "KCl")</td></tr><tr><td>Natriumfosfaat dibasisch, ReagentPlus, 100 g</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0876-100G</td><td>Zie "2. DNA-opstelling" (stap 2.5 "Na2HPO4")</td></tr><tr><td>Kaliumfosfaat monobasisch, ReagentPlus, 100 g</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5379-100G</td><td>Zie "2. DNA-opstelling" (stap 2.5 "KH2PO4")</td></tr><tr><td>Zoutzuur, ACS-reagens, 500 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144-500</td><td>Zie "2. DNA-opstelling" (stap 2.5 "HCl")</td></tr><tr><td>P-97 Micropipet Puller</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td>Zie "3. Pipet-opstelling" (stap 3.1 "glas capillaire puller")</td></tr><tr><td>3,0 mm brede trog gloeidraad</td><td>Sutter Instrument</td><td>FT330B</td><td>Zie "3. Pipet-opstelling" (stap 3.1 "glas capillaire puller")</td></tr><tr><td>Dünnwandige Glaskapillaren, 4", 1 / 0,75 OD/ID</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW100-4</td><td>Zie "3. Pipet-opstelling" (stap 3.1.1 "glas capillair")</td></tr><tr><td>Single Ply Soft-Tech Wipes, 4.5"</td><td>Phenix</td><td>LW-8148</td><td>Zie "3. Pipet-opstelling" (stap 3.2.1 "single-ply taakdoek"); andere single-ply doeken (bijv. Kimwipes) kunnen worden gebruikt.</td></tr><tr><td>Graefe-pincetten, 7 cm, recht, 0,7 mm 1x2 tanden</td><td>World Precision Instruments</td><td>#14140</td><td>Zie "4. In utero elektroporatie" (stap 4.1 "Graefe-pincetten")</td></tr><tr><td>Iris-schaar, 11,5 cm, recht, 12-pack</td><td>World Precision Instruments</td><td>#503708-12</td><td>Zie "4. In utero elektroporatie" (stap 4.1 "iris-schaar")</td></tr><tr><td>Hartman-muggenpincetten, 9 cm, recht, 12-pack</td><td>World Precision Instruments</td><td>#503728-12</td><td>Zie "4. In utero elektroporatie" (stap 4.1 "Hartman-muggenpincetten")</td></tr><tr><td>Algemene niet-geweven sponzen, 2" x 2", 4-laags</td><td>Medrepexpress</td><td>#2204-c</td><td>Zie "4. In utero elektroporatie" (stap 4.1 "niet-geweven gaas sponzen")</td></tr><tr><td>Ring-tip-pincetten, 10 cm, recht, 2,2 mm ID</td><td>World Precision Instruments</td><td>#503203</td><td>Zie "4. In utero elektroporatie" (stap 4.1 "ring-tip-pincetten")</td></tr><tr><td>Pyrex petrischalen compleet, O.D. &times; H 100 mm &times; 20 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3160102-12EA</td><td>Zie "4. In utero elektroporatie" (stap 4.1 "Petrischalen")</td></tr><tr><td>Vlak type instrumentenbak, roestvrij staal, 13-5/8" x 9-3/4" x 5/8"</td><td>Amazon</td><td>B007SHGAHA</td><td>Zie "4. In utero elektroporatie" (stap 4.1 "roestvrij stalen bak")</td></tr><tr><td>Platinum Tweezertrode, 5 mm</td><td>BTX</td><td>#45-0489</td><td>Zie "4. In utero elektroporatie" (stap 4.3 en 4.16 "pincet-type elektroden")</td></tr><tr><td>ECM 830 vo

cre-lox recombinatie bij muis hersenschors via in utero electroporation inducerende

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Cel-autonome neuronale functies van genen kunnen worden onthuld door het veroorzaken van verlies of winst van de functie van een gen in een kleine en spaarzame bevolking van neuronen. Vereist voor het genereren van een mozaïek waarin neuronen met verlies of winst voor de functie van een gen zijn omringd door genetisch onverstoorbaar weefsel om dit te doen. Hier combineren we het Cre-lox recombinatie systeem met in utero electroporation om te genereren van mozaïek hersenweefsel die kan worden gebruikt voor het bestuderen van de cel-zelfstandige functie van genen in neuronen. DNA constructies (beschikbaar via repositories), codering voor een fluorescerende label en Cre recombinase, worden ingevoerd in de ontwikkeling van de corticale neuronen met genen geflankeerd met loxP sites in de hersenen van muis embryo's met behulp van in utero Electroporation. Daarnaast beschrijven we verschillende aanpassingen aan de in utero electroporation methode waardoor overlevingsvermogen en reproduceerbaarheid. Deze methode omvat ook tot oprichting van een titer voor Cre-gemedieerde recombinatie bij een schaars of dichte bevolking van neuronen. Histologische preparaten van gelabelde hersenweefsel vereisen geen (maar kan worden aangepast aan) immunohistochemistry. De constructies gebruikt garanderen dat label fluorescently neuronen dragen het gen voor Cre recombinase. Histologische preparaten toestaan morfologische analyse van neuronen via confocal beeldvorming van dendritische en axonale arbors en dendritische spines. Omdat verlies of winst van functie in sparse mozaïek weefsel wordt bereikt, wordt deze methode kunnen de studie van cel-autonome noodzaak en de toereikendheid van gene producten in vivo.

De single construeren GFP. CRE (Zie materiaallijst) was electroporated op E15.5 en gevisualiseerd op P14. Afhankelijk van de concentratie van de constructie en de omvang van de injectie, kan een schaars of dichte resultaat worden verkregen van22,26. Bijvoorbeeld injectie van 1 µL van 2 mg/mL GFP. De resultaten van het CRE in een verspreide verdeling van gelabelde cellen, waarvan sommige helder (figuur 1A</stro...

Cel-autonome functies van genen in de hersenen kunnen worden bestudeerd door het induceren van verlies of winst van functie in dunbevolkte van cellen. Hier beschrijven we in utero electroporation om te Cre recombinase leveren in dunbevolkte corticale neuronen met floxed genen te ontwikkelen om te leiden tot verlies van functie in vivo.

Cre-lox recombinatie bij muis hersenschors via In Utero Electroporation inducerende

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To ...

Het algemene doel van deze procedure is om een genetisch mozaïek in de hersenschors van muizen te genereren door Cre-Lox recombinatie te induceren door middel van in utero elektroporatie. Deze methode om genetische mozaïeken te genereren kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de neurobiologie. Zoals het bepalen of een gen noodzakelijk is voor een bepaald neuronaal fenotype op een cell-autonome manier.Het grootste voordeel van deze techniek is dat het effectieve Cre-Lox recombinatiesysteem wordt gecombineerd met een even effectieve gen-levertechniek in utero elektroporatie. Hoewel deze methode is gericht op het targeten van laag twee-drie corticale neuronen, kan deze worden gebruikt om neuronen in andere corticale laagdieptes te targeten. Toen we probeerden genetische mozaïeken in ons hersenweefsel te maken, kwamen we verschillende problemen tegen om onze experimentele dieren na de geboorte te laten overleven, dus introduceerden we verschillende vereenvoudigingen en verfijningen in onze techniek.Bereid een pipet voor met een zeer lange tapsheid en zeer fijne punt, typisch voor pipetten voor injectie van embryonale stamcellen of nucleaire overdracht door eerst de glazen capillair in de pipettrekker te steken. Na het vastzetten van de klemmen, activeer het programma voor het trekprotocol, waardoor een tapsheid op de glazen capillair ontstaat. Zorg ervoor dat de lengte van de tapsheid tussen de 10 en 15 mm is met behulp van een samengestelde lichtmicroscoop.Vervolgens, om de punt van de pipet te breken, wikkel een enkele laag taakdoek over een 50-mL beker en span deze met één hand strak. Met de andere hand, duwt u de getrokken pipet, tapsheid naar beneden, loodrecht door het midden van de doek, waardoor een schone breuk in de tapsheid ontstaat. Controleer de grootte van de opening onder een samengestelde lichtmicroscoop.Calibreer vervolgens de pipet door 1 mcL van 0,4% Trypan blauw en PBS in een gedeeltelijk gevulde pipet te aspireren en de pipet te gradueren met 1-mcL markeringen op basis van de hoogte van 1 mcL in de pipet. Gebruik de gecalibreerde pipet om andere getrokken pipetten te gradueren voordat u ze weggooit. Plaats de pipetten in de pipethouders vrij van stof en andere deeltjes.Nadat een drachtig muis op E-15.5 diep is geanesthetiseerd, test u de rechterreflex door de inductiekamer voorzichtig te kantelen en de reactie van de muis op te merken. Als de rechterreflex afwezig is, brengt u de muis over naar het chirurgische voorbereidingsgebied en dient u ingeademd isofluraan toe via een neusdop om een chirurgisch anesthesieniveau te handhaven. Gebruik pincetten om de peesreflex te testen om de anesthesie te verifiëren.Bewaak de ademhalingssnelheid in de inspanning, kijkend naar diepe, regelmatige ademhaling en dat de slijmvliezen roze van kleur en vochtig zijn. Breng voldoende veterinaire oogzalf aan over de ogen om ze volledig te bedekken ter bescherming tegen uitdroging. Masseer ontharingscreme op de buikstreek met wattenstaafjes totdat het buikhaar oplost.Veeg vervolgens het buikhaar weg. Reinig zorgvuldig eventuele resterende residuen en ontharingscreme met 70% ethanol en wattenstaafjes. Breng jodium-gebaseerde scruboplossing in een cirkelvormige beweging op de buikstreek aan.Gebruik vervolgens een chirurgische doek om het operatiegebied te isoleren en steriele omstandigheden te handhaven. Nadat u een 2-cm ventrale middenlijnsnede in de huid heeft gemaakt, vindt u de linea alba om de middenlijn van de rectus abdominis te visualiseren. Trek de spier omhoog en weg van de buik en maak een 2-cm middenlijnsnede om de buikholte bloot te leggen met behulp van aseptische technieken.Gebruik een steriele 10-mcL micropipettip om carprofen in de buikholte te dispenseren voor analgesie. Klem vervolgens een Hartmann-mosquito pincet op de linkerrand van de rectus abdominis snede. Laat het pincet op een omgekeerde petrischaal naar de linkerkant van de snede rusten, waardoor de linkerkant van de snede open blijft.Nadat u de rechterkant van de snede op een vergelijkbare manier hebt geklemd, plaats u een gaasje rond het gebied van de snede. Gebruik ringpincetten zonder aangebrachte limietschroef, trek aan de baarmoeder tussen twee naburige embryo's zonder weefsel te pletten of te verwonden. Begin alle embryo's door de snede te trekken, leg ze op het gaasje.Verbind een gecalibreerde pipet met de aspiratorbuisassemblage en injecteer exact 1 mcL DNA-oplossing bereid door de baarmoederwand in een zijventrikel van elk embryo. Gebruik de duim en wijsvinger om de embryo's te manipuleren, waardoor de embryo's tijdens de injectie voorzichtig tegen de baarmoederwand kunnen worden geduwd. De zijventrikels verschijnen als twee donkerdere vlekken op de dorsale telencephalon van het embryo.Bevestig een succesvolle injectie door Trypan blauw te observeren dat het zijventrikel vult. Nadat alle embryo's zijn geïnjecteerd, plaats u de kathode van pincet-type elektroden op de baarmoeder, direct boven de mediale en caudale cortex om de visuele cortex te targeten. Plaats de anode net inferieur en anterieur aan het hoofd van het embryo.Met het voetpedaal, activeer de levering van 550-ms pulsen van 50 volt gescheiden door een 950-ms interval. Nadat alle embryo's zijn geëlektroporeerd, brengt u de baarmoeder terug in de buikholte in dezelfde oriëntatie waarin deze werd gevonden. Gebruik zoutoplossing om de baarmoeder te smeren terwijl u deze handmatig en uiterst voorzichtig begeleidt, zorg ervoor dat embryo's niet uit hun positie in de baarmoeder worden verplaatst.Sluit de buikspieren met absorbeerbare hechtingen. Gebruik een eenvoudige onderbroken steek, bind de uiteinden met een chirurgische knoop. Sluit de huidlaag met absorbeerbare hechtingen.Breng een kleine hoeveelheid weefselkleefstof aan om de wond te verzegelen. Breng weefselkleefstof aan op de knopen om losraken te voorkomen. Gebruik een micropipet om eventueel weefselkleefstof rond de wond

inducing-cre-lox-recombination-mouse-cerebral-cortex-through-utero

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

In Utero Intraventriculaire injectie en elektroporatie van de E15 muizenembryo&#39;s

In utero elektroporatie zorgt voor een snelle genafgifte in een ruimtelijk-temporeel en gecontroleerde wijze in de zich ontwikkelende centrale zenuwstelsel (CZS). Hier beschrijven we een groot aanpassingsvermogen in utero electroporatie protocol dat gebruikt kan worden om expressie constructen te leveren in meerdere embryonale CNS domeinen, waaronder de telencephalon, diencephalon en netvlies.

Efficiënte gen delivery in meerdere CNS Gebieden Het gebruik van In Utero Elektroporatie

Een genoverdracht methode in de zich ontwikkelende hersenen van muizen wordt beschreven door middel van een unieke chirurgische methode en de speciale vorm van de elektroden. Deze unieke techniek maakt het mogelijk transfectie van plasmide DNA tijdelijk en ruimtelijk, die veel neurowetenschappers zullen helpen bij het bestuderen van ontwikkeling van de hersenen.

Muis In Utero Elektroporatie: Gecontroleerde spatiotemporele Gene Transfectie

Dit artikel beschrijft in detail een protocol bij electroporate in utero de cerebrale cortex en de hippocampus bij E14.5 bij muizen. We tonen ook aan dat dit een waardevolle methode om dendrieten en stekels te bestuderen in deze twee cerebrale regio's.

Visualisatie en genetische manipulatie van dendrieten en stekels in de muis Cerebral cortex en de hippocampus met behulp van<em&gt; In utero</em&gt; Elektroporatie

In this video, a genetically modified mouse pup carrying the Ccm2 gene flanked by loxP sites and Cre recombinase fused to an estrogen receptor is used to induce cerebral cavernous malformations (CCMs). The administration of 4-hydroxytamoxifen activates Cre in endothelial cells, leading to the deletion of Ccm2 and the formation of CCMs in the brain.

Cre-LoxP Mediated Induction of Cerebral Cavernous Malformations in a Mouse Model

Source: Denaxa, M., el al., Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the procedure for injecting a plasmid vector carrying the gene of interest into interneuron progenitors in an embryonic brain slice, followed by electroporation for plasmid entry and gene expression. These modified progenitors can later be used for treating brain disorders.

Agarose-Embedded Electroporation-Assisted Gene Transfer in Mouse Cortical Interneuron Progenitors

Neuronmigratie wordt gereguleerd door talrijke cel-autonome en niet-cel-autonome factoren. Dit protocol laat zien hoe in utero elektroporatie kan worden gebruikt om te bepalen of een fenotype in een transgene muis het gevolg is van verstoring van een intrinsiek celmechanisme of belemmering van de interactie tussen de neuron en zijn omgeving.

Inductie van Eiwit van de verwijdering door In Utero Electroporatie tekorten Definieer in neuronale migratie in transgene modellen

Door gebruik te maken van een binaire genetische strategie bieden we een gedetailleerd protocol voor het traceren van neurale circuits bij muizen die complementaire transsynaptische tracers tot expressie brengen na Cre-gemedieerde recombinatie. Omdat celspecifieke tracerproductie genetisch is gecodeerd, is onze experimentele aanpak geschikt om de vorming en rijping van neurale circuitreeksen te bestuderen tijdens de muis-embryonale hersenontwikkeling met een resolutie van één enkele cel.

Voorwaardelijke Genetische transsynaptische Tracing in de embryonale hersenen van muizen

Dit protocol beschrijft in detail hoe specifiek te transfecteren verschillende regio's in het centrale zenuwstelsel van C57BL/6 via in utero elektroporatie. Inbegrepen in dit protocol zijn gedetailleerde instructies voor transfecties van regio's die zich ontwikkelen tot de cortex, hippocampus, thalamus, hypothalamus, laterale septumkern en striatum.

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Laterale Septal Nucleus- en Striatum-specifieke<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporatie in de C57BL / 6 muis

Dubbel in utero elektroporatie maakt het richten van celpopulaties die ruimtelijk en tijdelijk gescheiden. Deze techniek is nuttig om interacties tussen die celpopulaties te visualiseren met behulp van fluorescerende eiwitten in normale omstandigheden, maar ook na functionele experimenten om genen van belang te verstoren.

Dubbel in utero-elektroporatie om tijdelijk en ruimtelijk gescheiden celpopulaties te targeten

Astrocyten betegelen de hersenschors uniform, waardoor de analyse van hun complexe morfologie uitdagend is op cellulair niveau. Het protocol dat hier wordt verstrekt, maakt gebruik van multicolor-etikettering op basis van in utero-elektroporatie om corticale astrocyten uit te schakelen en hun volume en morfologie te analyseren met een gebruiksvriendelijke pijplijn voor beeldanalyse.

In Utero Electroporation of Multiaddressable Genome-Integrating Color (MAGIC) Markers om Cortical Mouse Astrocytes te individualiseren

Leer Cre-lox recombinatie in de hersenschors van muizen via in utero elektroporatie. Deze methode maakt gerichte genetische modificaties mogelijk om neuronale fenotypen en genfuncties in vivo te bestuderen.

Cre-lox recombinatie bij muis hersenschors via In Utero Electroporation inducerende

Meer video's verkennen