Name: Een eenvoudige cel-gebaseerde immunofluorescentie Assay voor het detecteren van Autoantibody tegen de N-Methyl-D-aspartaat (NMDA)-Receptor in het bloed (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Leer een eenvoudige cel-gebaseerde immunofluorescentie-assay voor het detecteren van autoantilichamen tegen de NMDA-receptor in bloed van patiënten met vermoedelijke auto-immuun encefalitis.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd gesteund door de Chang Gung Medical Foundation (subsidie nummer CMRPG3C1771, CMRPG3C1772, CMRPG3E0631, CMRPG3E0632 en CMRPG3E0633).

De studie werd goedgekeurd door de institutionele Review Board van Chang Gung Memorial Hospital in Linkuo, Taoyuan, Taiwan (102-2577A3).
1. bereiding van de NR1-GFP expressie plasmide
<ol><li>Mix 10 ng van NR1-GFP plasmide met 100 µL van Escherichia coli bevoegde cellen stam DH5α in een steriele 1,5 mL Centrifugeer buis, Pipetteer het mengsel voorzichtig omhoog en omlaag 4 - 6 keer, en de buis op ijs gedurende 20 minuten uit te broeden.</li>
	<li>Incubeer de buis bij 42 ° C gedurende 1 minuut in een waterbad, verwijderen van de buis van het waterbad, voeg 1 mL lysogenie Bouillon (LB) medium in de buis en Incubeer de buis bij 37 ° C in een broedmachine met schudden 1 h.</li>
	<li>Verspreid 50 µL van het mengsel op een LB agar bord met ampicilline (0,1 mg/mL), en na een nacht bebroeden de LB agarplaat bij 37 ° C in een broedstoof.</li>
	<li>Kies een één kolonie van de overnachting LB agarplaat met behulp van een steriele tip, en swirl van de tip in een in een buis van de bacteriële cultuur met 5 mL van LB medium en ampicilline (0,1 mg/mL). Incubeer de buis bij 37 ° C in een broedmachine met 's nachts te schudden.</li>
	<li>Aliquot 3 mL van de overnachting bacteriecultuur in een maatkolf van 500 mL met 250 mL steriele LB medium en ampicilline (0,1 mg/mL). Incubeer de kolf bij 37 ° C met schudden. Controleer regelmatig de optische dichtheid (OD) van de bacteriecultuur bij golflengte van 600 nm met behulp van een spectrometer, totdat de OD600 0.6-1.0 bereikt. Opmerking: Meng goed 800 µL van de overnachting bacteriële cultuur met 200 µL glycerol bereiden de voorraad van glycerol en de glycerol voorraad tot-80 ° C voor toekomstig gebruik opslaan.</li>
	<li>Bereiden NR1-GFP expressie plasmide van de bacteriecultuur 250 mL<ol>
<li>De cellen verzamelen door centrifugeren bij 6.000 x g gedurende 15 min bij 4 ° C.</li>
		<li>Resuspendeer de pellet bacteriën in 10 mL resuspensie buffer met RNase A; Vortex grondig totdat geen klomp wordt gezien.</li>
		<li>Voeg toe 10 mL lysis-buffermengsel aan de bacteriële suspensie zachtjes omkeren van het mengsel 4 - 6 maal en Incubeer de lysate bij kamertemperatuur (RT) gedurende 5 minuten.</li>
		<li>Voeg toe 10 mL pre gekoeld neerslag buffer aan de lysate, voorzichtig omkeren het mengsel 4 - 6 keer.</li>
		<li>Giet de lysate in de loop van een filterelement met het GLB op; wachten op 10 min op RT.</li>
		<li>Verwijder de dop van de cartridge outlet mondstuk, een zuiger invoegen de cartridge en druk zachtjes op de plunjer. Verzamelen de gefilterde lysate in een tube van 50 mL.</li>
		<li>2,5 mL merkgebonden buffer van de fabrikant om de gefilterde lysate toevoegen, meng het mengsel door het omkeren van de buis ongeveer 10 keer en laat het mengsel op het ijs gedurende 30 minuten inwerken.</li>
		<li>Breng het gefilterde lysate mengsel op een filter kolom die vooraf werd geëquilibreerd met 10 mL evenwichtsinstelling buffer. Laat de kolom voor de afvoer door de zwaartekracht.</li>
		<li>Was de kolom met 30 mL was buffer tweemaal en elueer DNA uit de kolom met 15 mL elutie buffer.</li>
		<li>10,5 mL (0.7 volumes) isopropanol en toevoegen aan de eluted DNA-buffer, meng goed en Centrifugeer het mengsel bij 20.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 ° C.</li>
		<li>Giet het supernatant zorgvuldig wassen van de DNA-pellet met 5 mL endotoxine-gratis 70% ethanol eenmaal en centrifugeer bij 20.000 x g gedurende 10 minuten.</li>
		<li>De bovendrijvende vloeistof decanteren, droog de pellet gedurende 5-10 min. in een chemische kap, en los van de pellet in 300-500 µL van endotoxinen-vrije buffer.</li>
		<li>Bepaal de concentratie van de plasmide door het meten van de absorptie van de oplossing bij UV 260/280 nm met behulp van een spectrofotometer. Opmerking: Bereiden de expressie plasmide GFP hetzelfde protocol gebruiken.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. de transfectie van HEK293 cellen met NR1-GFP expressie plasmide
<ol><li>Aliquoot 200 µL van 2% gelatine oplossing voor elk goed van een 48-well cultuur-plaat en de plaat bij 37 ° C gedurende ten minste 30 minuten uit te broeden.</li>
	<li>De oplossing van de gelatine van de cellen in 200 µL van cel kweekmedium dat 10% foetale runderserum (FBS) in elk putje goed en zaad 5 x 104 HEK293 gecombineerd. Incubeer de plaat bij 37 ° C in een bevochtigde incubator geleverd met 5% CO2 's nachts. Opmerking: De cellen werden geteld met behulp van een hemocytometer.</li>
	<li>Op de volgende dag, vervangen door het gebruikte kweekmedium 200 µL van verse kweekmedium dat 10% FBS per putje.</li>
	<li>Voor elke single Nou, bereid oplossing A door het mengen van 100 ng van NR1-tGFP plasmide met 20 µL cultuurmedium en oplossing B door het mengen van 0.8 µL transfectiereagens met 20 µL cultuurmedium. Vermenigvuldig het aantal putten die nodig zijn ter voorbereiding van het totale volume van elk experiment.</li>
	<li>Bereid oplossing C door het mengen van oplossing A en B-oplossing, en het mengsel op RT voor 20-30 min uit te broeden.</li>
	<li>Aliquoot 40 µL van oplossing C aan elk putje met de cellen van de HEK293, zachtjes swirl van de plaat, en de plaat bij 37 ° C in een bevochtigde incubator geleverd met 5% CO2 's nachts uit te broeden.</li>
	<li>Controleer de expressie van NR1-GFP recombinante eiwitten in de cellen van de gastheer onder fluorescente microscoop met 40 X-200 X vergroting (excitatie/emissie: 482/502 nm), en gaat u verder met de bepaling van cel-gebaseerde immunofluorescentie. Opmerking: Transfect de expressie plasmide GFP in de cellen van de HEK293 met behulp van hetzelfde protocol.</li>
</ol>3. cel-gebaseerde immunofluorescentie Assay
<ol><li>Het gebruikte medium de putjes gecombineerd, dan wassen elk putje met 200 µL van fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) drie keer.</li>
	<li>Voeg 200 µL van 4% paraformaldehyde-oplossing aan elk putje; Incubeer de plaat duikt met RT gedurende 15 minuten.</li>
	<li>Gecombineerd de paraformaldehyde-oplossing van de putten en wassen elk goed met 200 µL van PBS driemaal.</li>
	<li>Voeg 200 µL van 10% magere melk in PBST (0,1% Tween-20 in PBS) oplossing voor elk goed, en de plaat duikt met RT voor 1 h met zacht schudden uit te broeden.</li>
	<li>De 10% magere melk in PBST oplossing uit de put gecombineerd, dan was de putjes met 200 µL PBST eens.</li>
	<li>Incubeer de putjes met verdunde plasma (1:100 in PBST) als het primaire antilichaam met zacht schudden bij RT gedurende 1 uur. Opmerking: Plasma wordt gehaald uit het bloed van patiënten verdacht te hebben van auto-immune encefalitis.</li>
	<li>Gecombineerd het verdunde plasma uit de putten en wassen elk goed met 200 µL van PBST driemaal.</li>
	<li>Voeg 200 µL van anti-menselijke geit IgG geconjugeerd met Alexa Fluor 594 (1:1, 000 verdunning in PBST) aan elk putje en Incubeer de plaat van de cultuur op RT met zacht schudden voor 1 h.</li>
	<li>De geit anti-menselijke IgG geconjugeerd met Alexa Fluor 594 oplossing gecombineerd, en was goed met 200 µL van PBST driemaal.</li>
	<li>Voeg 100 µL glycerol oplossing (50% glycerol in PBS en 1:100,000 van 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)) aan elk putje.</li>
	<li>Observeren en beeld van de cellen onder een fluorescente microscoop met behulp van een 10 X oculair, en 4 X, 10 X en 20 X doelstellingen. Opmerking: Gebruik het juiste filter voor elke kleurstof: voor NR1-GFP (excitatie/emissie = 482/502 nm), voor de Alexa Fluor 594 (excitatie/emissie = 561/594/nm), voor de DAPI (excitatie/emissie = 358/461 nm). Het gedrag van de negatieve controle de HEK cuvetten GFP op dezelfde manier uiten.</li>
</ol>

<ol><li>Linnoila, J. J., Rosenfeld, M. R., Dalmau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+surface+antibody-mediated+autoimmune+encephalitis%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neuronal surface antibody-mediated autoimmune encephalitis.</a> Semin Neurol. 34 (4), 458-466 (2014).</li>
<li>Lancaster, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diagnosis+and+treatment+of+autoimmune+Encephalitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Neurol%22%5BJournal%5D)">The diagnosis and treatment of autoimmune Encephalitis.</a> J Clin Neurol. 12 (1), 1-13 (2016).</li>
<li>Pruss, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrospective+analysis+of+NMDA+receptor+antibodies+in+encephalitis+of+unknown+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Retrospective analysis of NMDA receptor antibodies in encephalitis of unknown origin.</a> Neurology. 75 (19), 1735-1739 (2010).</li>
<li>Leypoldt, F., Armangue, T., Dalmau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmune+encephalopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Autoimmune encephalopathies.</a> Ann N Y Acad Sci. 1338, 94-114 (2015).</li>
<li>Dalmau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-NMDA-receptor+encephalitis%3A+case+series+and+analysis+of+the+effects+of+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Anti-NMDA-receptor encephalitis: case series and analysis of the effects of antibodies.</a> Lancet Neurol. 7 (12), 1091-1098 (2008).</li>
<li>Titulaer, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+and+prognostic+factors+for+long-term+outcome+in+patients+with+anti-NMDA+receptor+encephalitis%3A+an+observational+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Treatment and prognostic factors for long-term outcome in patients with anti-NMDA receptor encephalitis: an observational cohort study.</a> Lancet Neurol. 12 (2), 157-165 (2013).</li>
<li>Chapman, M. R., Vause, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-NMDA+receptor+encephalitis%3A+diagnosis%2C+psychiatric+presentation%2C+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Anti-NMDA receptor encephalitis: diagnosis, psychiatric presentation, and treatment.</a> Am J Psychiatry. 168 (3), 245-251 (2011).</li>
<li>Gable, M., Glaser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-n-methyl-d-aspartate+receptor+encephalitis+appearing+as+a+new-onset+psychosis%3A+disease+course+in+children+and+adolescents+within+the+california+encephalitis+project%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Neurol%22%5BJournal%5D)">Anti-n-methyl-d-aspartate receptor encephalitis appearing as a new-onset psychosis: disease course in children and adolescents within the california encephalitis project.</a> Pediatr Neurol. 72, 25-30 (2017).</li>
<li>Dalmau, J., Lancaster, E., Martinez-Hernandez, E., Rosenfeld, M. R., Balice-Gordon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+experience+and+laboratory+investigations+in+patients+with+anti-NMDAR+encephalitis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Clinical experience and laboratory investigations in patients with anti-NMDAR encephalitis.</a> Lancet Neurol. 10 (1), 63-74 (2011).</li>
<li>Dalmau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraneoplastic+anti-N-methyl-D-aspartate+receptor+encephalitis+associated+with+ovarian+teratoma%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Paraneoplastic anti-N-methyl-D-aspartate receptor encephalitis associated with ovarian teratoma.</a> Ann Neurol. 61 (1), 25-36 (2007).</li>
<li>Irani, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-methyl-D-aspartate+antibody+encephalitis%3A+temporal+progression+of+clinical+and+paraclinical+observations+in+a+predominantly+non-paraneoplastic+disorder+of+both+sexes%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">N-methyl-D-aspartate antibody encephalitis: temporal progression of clinical and paraclinical observations in a predominantly non-paraneoplastic disorder of both sexes.</a> Brain. 133 (Pt 6), 1655-1667 (2010).</li>
<li>Suh-Lailam, B. B., Haven, T. R., Copple, S. S., Knapp, D., Jaskowski, T. D., Tebo, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-NMDA-receptor+antibody+encephalitis%3A+performance+evaluation+and+laboratory+experience+with+the+anti-NMDA-receptor+IgG+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Anti-NMDA-receptor antibody encephalitis: performance evaluation and laboratory experience with the anti-NMDA-receptor IgG assay.</a> Clin Chim Acta. 421, 1-6 (2013).</li>
<li>Mayer, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+biology+of+glutamate+receptor+ion+channel+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural biology of glutamate receptor ion channel complexes.</a> Curr Opin Struct Biol. 41, 119-127 (2016).</li>
<li>Ramberger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+diagnostic+accuracy+of+microscopy+and+flow+cytometry+in+evaluating+n-methyl-d-aspartate+receptor+antibodies+in+serum+using+a+live+cell-based+assay%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparison of diagnostic accuracy of microscopy and flow cytometry in evaluating n-methyl-d-aspartate receptor antibodies in serum using a live cell-based assay.</a> PLoS One. 10 (3), e0122037(2015).</li>
<li>Wandinger, K. P., Saschenbrecker, S., Stoecker, W., Dalmau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-NMDA-receptor+encephalitis%3A+a+severe%2C+multistage%2C+treatable+disorder+presenting+with+psychosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Anti-NMDA-receptor encephalitis: a severe, multistage, treatable disorder presenting with psychosis.</a> J Neuroimmunol. 231 (1-2), 86-91 (2011).</li>
<li>Dahm, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seroprevalence+of+autoantibodies+against+brain+antigens+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Seroprevalence of autoantibodies against brain antigens in health and disease.</a> Ann Neurol. 76 (1), 82-94 (2014).</li>
<li>Jézéquel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-+and+single+molecule-based+methods+to+detect+anti-n-methyl-d-aspartate+receptor+autoantibodies+in+patients+with+first-episode+psychosis+from+the+OPTiMiSE+project%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Cell- and single molecule-based methods to detect anti-n-methyl-d-aspartate receptor autoantibodies in patients with first-episode psychosis from the OPTiMiSE project.</a> Biol Psychiatry. , (2017).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Er zijn verschillende cel-gebaseerde immunologische tests op het scherm van de aanwezigheid van Autoantilichamen tegen NMDA receptor gemeld in de literatuur, met inbegrip van de levende cel-gebaseerde immunofluorescentie assay11, vaste cel-gebaseerde immunofluorescentie assay9 , en stroom cytometry gebaseerde assay14. De levende cel-gebaseerde immunofluorescentie bepaling moet kort na de voorbereiding van cellen die zijn ectopically uiting geven aan ...

Anti-NMDA receptor auto-immune encefalitis is een nieuw herkende ziekte-entiteit die kan optreden bij patiënten van alle leeftijden, en beïnvloedt overwegend vrouwelijke patiënten1,2. Het is een van de meest frequent gediagnosticeerde encefalopathie bij patiënten met eerste onbekende etiologie van encefalitis3. Patiënten getroffen met anti-NMDA receptor encefalitis meestal hebben prodromal symptomen van een hoofdpijn of koorts, gevolgd door de snelle ontwikkeling van de wijzigingen in bewustzijn en een verscheidenheid aan acute neuropsychiatrische symptomen, met inbegrip van agitatie, prikkelbaarheid , angst, slapeloosheid, hallucinaties, wanen, agressie, bizar gedrag, afwijkingen van de beweging, autonome disregulatie en inbeslagneming aanvallen4,5. Vroege erkenning van deze aandoening en tijdige behandeling met immunotherapie zijn belangrijk voor een beter resultaat en zelfs volledig herstel in getroffen patiënten6. Vandaar, wordt voorgesteld dat de anti-NMDA receptor auto-immune encefalitis moet worden beschouwd als een belangrijke differentiële diagnose van patiënten met acute of nieuwe-onset psychotische kenmerken7,8te presenteren.
Naast klinische eigenschappen is detectie van autoantibody tegen de NMDA-receptor in het bloed of LIQUOR essentieel voor de accurate diagnose van anti-NMDA receptor auto-immune encefalitis9. De meeste van de immunologische tests voor de opsporing van de anti-NMDA receptor autoantibody zijn beschikbaar in een paar onderzoek laboratoria-10,11, en er is slechts één verkrijgbare cel-gebaseerde immunofluorescentie assay voor screening de anti-NMDA receptor autoantilichamen12. Het doel van deze studie is het ontwikkelen van een eenvoudige in-house cel-gebaseerde immunofluorescentie-bepaling die op het scherm van de aanwezigheid van anti-NMDA receptor autoantilichamen ter vergemakkelijking van het klinische onderzoek van anti-NMDA receptor gunstig in het laboratorium kan worden gebruikt auto-immune encefalitis. De NMDA-receptor is een heterotetramer ion kanaal eiwit complex specifiek uitgedrukt in de hersenen. Het bestaat uit twee verplichte NR1 subeenheden, en de combinatie van een of twee subeenheden van NR2A, NR2B, NR2C of NR2D13. Een eerdere studie gemeld dat de belangrijkste epitoop door de antilichamen gericht op het extracellulaire N-terminale domein van de NR1 subeenheid5 was. Vandaar, in dit protocol, we uiten het menselijke recombinante eiwitten van de NR1-subunit van NMDA receptor gelabeld met groen fluorescente proteïne (GFP) in de menselijke embryonale nier epitheliale cellijn (HEK293), en ontwikkelen van een cel-gebaseerde immunofluorescentie assay te detecteren de IgG-klasse van anti-NMDA receptor autoantilichamen in het bloed.

<table><tbody><tr><td>GRIN1 (GFP-gelabeld) - Humaan glutamate receptor, ionotropisch, N-methyl D-aspartaat 1 (GRIN1), transcript variant NR1-1</td><td>Origene (Rockville, MD, USA)</td><td>RG219368</td><td>NR1-cDNA-kloon gelabeld met C-terminale tGFP-sequenties</td></tr><tr><td>pCMV6-AC-GFP</td><td>Origene (Rockville, MD, USA)</td><td>PS100010</td><td>zoogdiervector met C-terminale tGFP-tag</td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>Qiagen (Hilden, Duitsland)</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Transfectie Reagens</td><td>Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td><td>Thermo Fisher</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, Hoge Glucose, Pyruvaat</td><td>Thermo Fisher</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Gekarakteriseerde foetaal bovien serum, US-origine</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30071.01</td><td></td></tr><tr><td>Geit anti-Humaan IgG (H+L) Secundair Antilichaam, Alexa Fluor 594-conjugaat</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-11014</td><td></td></tr><tr><td>Positieve controle: anti-glutamaat receptor (type NMDA)</td><td>Euroimmun AG, Lübeck, Duitsland</td><td>CA 112d-0101</td><td></td></tr><tr><td>Euroimmun Assay Kit</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

een eenvoudige cel-gebaseerde immunofluorescentie assay voor het detecteren van autoantibody tegen de n-methyl-d-aspartaat (nmda)-receptor in het bloed

A Simple Cell-based Immunofluorescence Assay to Detect Autoantibody Against the N-Methyl-D-Aspartate (NMDA) Receptor in Blood

De aanwezigheid van anti-NMDA receptor autoantibody kan verschillende neuropsychiatrische symptomen veroorzaken in de betrokken patiënten, genoemd anti-NMDA receptor auto-immune encefalitis. Opsporing van de specifieke autoantibody tegen de NMDA-receptor in het bloed of de cerebrospinale vloeistof (CSF) is essentieel voor de accurate diagnose van deze aandoening. De NMDA-receptor is een ion kanaal eiwit complex dat vier subeenheden bevat, waaronder twee verplichte NMDA receptor subeenheid 1 (NR1) en één of twee NMDA receptor subeenheid 2A (NR2A), NMDA receptor subeenheid 2B (NR2B), NMDA receptor subeenheid 2C (NR2C), of NMDA receptor subeenheid 2D (NR2D). De epitoop van anti-NMDA receptor autoantibody werd gemeld om aanwezig te zijn bij het extracellulaire N-terminale domein van de NR1 subeenheid van de NMDA-receptor. Het doel van deze studie is het ontwikkelen van een eenvoudige cel-gebaseerde immunofluorescentie-test die kan worden gebruikt als een screeningtest voor het detecteren van de aanwezigheid van Autoantilichamen tegen NR1 subeenheid van de NMDA-receptor in het bloed te vergemakkelijken van de klinische en fundamentele onderzoek van anti-NMDA receptor auto-immune encefalitis.

We kunnen gemiddeld 200-300 µg endotoxine-vrije expressie plasmide NR1-GFP en GFP krijgen van 250 mL bacteriecultuur na de procedures in sectie 1 van het protocol. Een bedrag van 100 ng/putje van de expressie plasmide werd gebruikt voor de transfectie van de HEK293 cellen gekweekt in de 48-well plaat zoals beschreven in de sectie 2 van het protocol. 24-30 uur na de transfectie, de cellen uitgesproken de NR1-GFP en GFP recombinante eiwitten onder fluorescente microscoop kon worden opgespoo...

Wij hebben ectopically NR1 subeenheid van NMDA receptor gelabeld met groen fluorescent proteïne in menselijke embryonale cellen (HEK293) als antigeen te detecteren autoantilichamen tegen NMDA receptor in het bloed van patiënten verdacht met auto-immune encefalitis. Deze eenvoudige methode kan geschikt voor screeningonderzoek in klinische instellingen zijn.

Een eenvoudige cel-gebaseerde immunofluorescentie Assay voor het detecteren van Autoantibody tegen de N-Methyl-D-aspartaat (NMDA)-Receptor in het bloed

The presence of anti-NMDA receptor autoantibody can cause various neuropsychiatric symptoms in the affected patients, termed anti-NMDA receptor autoimmune ...

Het algemene doel van deze test is om autoantilichamen tegen de NMDA-receptor in het bloed van patiënten met vermoedelijke auto-immuun encefalitis te detecteren. De meting helpt bij het beantwoorden van de belangrijkste vragen in de differentiële diagnose van patiënten met acute neuro-psychiatrische symptomen. Het grote voordeel van deze techniek is dat het een eenvoudige en betrouwbare screeningsmaatregel is.Begin deze procedure door gelatine-gecoate kweekplaten voor te bereiden. Pipetteer 200 microliters van een 2% gelatine-oplossing in elk putje van een 48-putjes kweekplaat en incubeer de plaat gedurende minimaal 30 minuten bij 37 graden Celsius. Na 30 minuten aspireer de gelatine-oplossing uit de putjes.Zaai in elk putje 5 keer 10 tot de 4e HEK293 cellen in 200 microliters celkweekmedium, dat 10%FBS bevat. Incubeer de plaat een nacht bij 37 graden Celsius in een bevochtigde incubator voorzien van 5% koolstofdioxide. De volgende dag vervang het uitgeputte kweekmedium in elk putje door 200 microliters vers kweekmedium, dat 10%FBS bevat.Schaal op volgens het totale aantal putjes in het experiment. Bereid oplossing A door de NR1-GFP-plasmide te mengen met kweekmedium. Bereid oploss

a-simple-cell-based-immunofluorescence-assay-to-detect-autoantibody

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

This video demonstrates a technique for identifying antibodies against specific antigens in a sample using a rat hippocampal neuronal culture. By exposing cultured neurons to patient samples containing autoantibodies targeting N-Methyl-D-aspartate receptors (NMDARs), the presence of autoantibodies bound to the neuronal surface is revealed through immunostaining.

An Assay to Detect Autoantibodies in Human Serum using a Hippocampal Neuronal Culture

In de afgelopen jaren zijn levende celgebaseerde proeven met succes gebruikt om antilichamen tegen oppervlak en conformationele antigenen. Hier beschrijven we een werkwijze met hoge doorvoer flowcytometrie waardoor de analyse van grote patiëntencohorten. Detectie van nieuwe antilichamen verbetert diagnose en behandeling van immuun-gemedieerde aandoeningen.

High-throughput flowcytometrie-Cell gebaseerde test voor opsporing van antilichamen tegen N-methyl-D-aspartaat receptor of dopamine-2 receptor in het menselijk serum

We beschrijven hier een methode om aanpasbare antigeen-microarrays te genereren die kunnen worden gebruikt voor de gelijktijdige detectie van serum IgG en IgM auto-antilichamen van mensen en muizen. Deze arrays maken een doorvoer en kwantitatieve detectie mogelijk van antilichamen tegen willekeurige antigenen of epitopen van belang.

Genereren van tweekleurige Antigen Microarrays voor de simultane detectie van IgG en IgM Autoantistoffen

DFS70 autoantilichamen nabootsen gemeenschappelijk ziekte-geassocieerde antinuclear antilichaam patronen maken nauwkeurige interpretatie uitdaging bij het gebruik van conventionele HEp-2 substraten. Het protocol beschrijft de voordelen van roman gemanipuleerde HEp-2 substraat ten opzichte van conventionele HEp-2 in ANA screening en het registratienummer van de DFS70 patronen met hoge vertrouwen in zowel monospecifieke als gemengde ANA positieve gevallen.

Gelijktijdige onderscheid van monospecifieke en gemengde DFS70 patronen tijdens ANA Screening met een roman HEp-2 ELITE/DFS70 Knockout substraat

Het doel van dit protocol is te vergemakkelijken van de studie van NMDA-receptoren (NMDAR) op een grotere schaal en het onderzoek van f effecten van kleine moleculen en hun therapeutische toepassingen.

Een High-throughput Calcium-flux Assay te studeren NMDA-receptoren met gevoeligheid voor Glycine/D-serine en glutamaat

Cel-gebaseerde bepaling is een veel gebruikte methode om te detecteren serum anti-aquaporin-4 immunoglobulin G. Deze methode kan worden toegepast op de klinische diagnose en wetenschappelijk onderzoek van neuromyelitis optisch spectrum stoornissen.

Menselijk Serum Anti-aquaporin-4 Immunoglobulin G detectie van cel-gebaseerde Assay

We modelleren een eenvoudige multiplexed ECL-test die 7 autoantilichaamtests samen combineert. De test is in staat om tegelijkertijd te screenen op T1D en meerdere andere auto-immuunziekten, waaronder coeliakie, auto-immuun schildklierziekte en auto-immuun polyglandulair syndroom 1.

Een high-throughput elektrochemiluminescentie 7-Plex-test die tegelijkertijd screent op type 1 diabetes en meerdere auto-immuunziekten

Auto-immune encefalitis is een nieuwe categorie van antilichaam-gemedieerde ziekten van het centrale zenuwstelsel. Hippocampusneuronen kunnen worden gebruikt om deze antilichamen te ontdekken en te karakteriseren. Dit artikel biedt een protocol voor primaire celkweek en immunostaining om auto-antilichamen in het serum en cerebrospinale vloeistof van patiënten te bepalen.

Hippocampale neuronale culturen om nieuwe pathogene antilichamen te detecteren en te bestuderen die betrokken zijn bij auto-immune encefalitis

Experimentele auto-immuun encefalomyelitis (EAE) is een diermodel van multiple sclerose (MS), dat met de menselijke ziekte een robuuste humorale auto-immuunrespons deelt. Hier rapporteren we een eenvoudig en flexibel ELISA-protocol om auto-antilichamen in het serum van EAE-geïmmuniseerde muizen te kwantificeren.

Kwantificering van autoreactieve antilichamen bij muizen bij experimentele auto-immuunencefalomyelitis

We bieden een stapsgewijze immunocytochemie (ICC) methodologie voor het detecteren van anti-MDA5. Deze benadering omvat celfixatie, permeabilisatie, incubatie van antilichamen en beeldvormingstechnieken, die de nauwkeurige detectie van anti-MDA5-auto-antilichamen mogelijk maken, wat helpt bij de diagnose van snel voortschrijdende interstitiële longziekte bij patiënten met myositis.

Detectie van anti-MDA5 auto-antilichamen met behulp van HeLa-cellen en immunocytochemie met lichtmicroscopie

We beschrijven een recent ontwikkeld immunoassayplatform gebaseerd op de principes van celvrije synthetische biologie en de dot-blot-techniek voor aanpasbare detectie van antilichaamrespons in menselijke en dierlijke sera.

Celvrije dot blot als een praktisch en aanpasbaar immunoassayplatform voor de detectie van antilichaamrespons in menselijke en dierlijke sera

Leer een eenvoudige cel-gebaseerde immunofluorescentie-assay voor het detecteren van autoantilichamen tegen de NMDA-receptor in bloed van patiënten met vermoedelijke auto-immuun encefalitis.

Een eenvoudige cel-gebaseerde immunofluorescentie Assay voor het detecteren van Autoantibody tegen de N-Methyl-D-aspartaat (NMDA)-Receptor in het bloed (Video) | JoVE Journal

Een eenvoudige cel-gebaseerde immunofluorescentie Assay voor het detecteren van Autoantibody tegen de N-Methyl-D-aspartaat (NMDA)-Receptor in het bloed

Meer video's verkennen