Een eenvoudige cel-gebaseerde immunofluorescentie Assay voor het detecteren van Autoantibody tegen de N-Methyl-D-aspartaat (NMDA)-Receptor in het bloed

Het algemene doel van deze test is om autoantilichamen tegen de NMDA-receptor in het bloed van patiënten met vermoedelijke auto-immuun encefalitis te detecteren. De meting helpt bij het beantwoorden van de belangrijkste vragen in de differentiële diagnose van patiënten met acute neuro-psychiatrische symptomen. Het grote voordeel van deze techniek is dat het een eenvoudige en betrouwbare screeningsmaatregel is.

Begin deze procedure door gelatine-gecoate kweekplaten voor te bereiden. Pipetteer 200 microliters van een 2% gelatine-oplossing in elk putje van een 48-putjes kweekplaat en incubeer de plaat gedurende minimaal 30 minuten bij 37 graden Celsius. Na 30 minuten aspireer de gelatine-oplossing uit de putjes.

Zaai in elk putje 5 keer 10 tot de 4e HEK293 cellen in 200 microliters celkweekmedium, dat 10%FBS bevat. Incubeer de plaat een nacht bij 37 graden Celsius in een bevochtigde incubator voorzien van 5% koolstofdioxide. De volgende dag vervang het uitgeputte kweekmedium in elk putje door 200 microliters vers kweekmedium, dat 10%FBS bevat.

Schaal op volgens het totale aantal putjes in het experiment. Bereid oplossing A door de NR1-GFP-plasmide te mengen met kweekmedium. Bereid oplossing B door de transfectiereagens te mengen met kweekmedium. Bereid oplossing C door oplossing A en oplossing B te mengen en het mengsel gedurende 20 tot 30 minuten bij kamertemperatuur te incuberen.

Pipetteer vervolgens 40 microliters van oplossing C in elk putje dat de HEK293 cellen bevat. Schud de plaat voorzichtig en incubeer de plaat een nacht bij 37 graden Celsius in een bevochtigde incubator voorzien van 5% koolstofdioxide. Controleer de expressie van het NR1-GFP recombinante eiwit in de gastheercellen onder een fluorescerende microscoop met 40 tot 200 keer vergroting, voordat je doorgaat naar de cel-gebaseerde immunofluorescentietest.

Om deze test te beginnen, aspireer eerst het uitgeputte medium uit de putjes van de kweekplaat en was vervolgens elk putje drie keer met 200 microliters PBS. Voeg 200 microliters 4% paraformaldehyde-oplossing toe aan elk putje en incubeer de plaat bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Aspireer de paraformaldehyde-oplossing uit de putjes en was elk putje drie keer met 200 microliters PBS.

Voeg vervolgens 200 microliters 10% mageremelk in PBST-oplossing toe aan elk putje en incubeer de plaat bij kamertemperatuur met voorzichtig schudden gedurende een uur. Aspireer de 10% mageremelk in PBST-oplossing uit de putjes en was de putjes met 200 microliters PBST een keer. Incubeer de putjes met plasma verdund een op 100 in PBST als primaire antilichaam met voorzichtig schudden bij kamertemperatuur gedurende een uur.

Na een uur aspireer het verdunde plasma uit de putjes en was elk putje drie keer met 200 microliters PBST. Voeg aan elk putje 200 microliters geit anti-humaan IgG, geconjugeerd met Alexa Fluor 594 toe en incubeer de kweekplaat bij kamertemperatuur met voorzichtig schudden gedurende een uur. Aspireer vervolgens de geit anti-humaan IgG geconjugeerd met Alexa Fluor 594-oplossing en was elk putje drie keer met 200 microliters PBST.

Na de derde PBST-was voeg 100 microliters glycerol-oplossing, die DAPI bevat, toe aan elk putje. Observeer en beeld de cellen af onder een fluorescerende microscoop met de juiste filter voor elke kleurstof en een 10 keer oculaire met vier keer, 10 keer en 20 keer objectieven. Deze representatieve beelden, genomen 24 tot 30 uur na transfectie, tonen HEK293 cellen die NR1-GFP tot expressie brengen.

Ongeveer 30% van de cellen had het groene signaal onder de fluorescerende microscoop. In de bijbehorende Alexa Fluor 594-beelden geeft het rode signaal in paneel B de binding van de anti-NMDA receptor-auto-antilichamen aan de NR1 die tot expressie wordt gebracht in de HEK293 cellen. Het zwakke rode signaal in paneel E geeft de achtergrondruis van de Alexa Fluor 594-beelden aan.

De cellen die NR1-GFP tot expressie brengen, werden gebruikt voor het screenen van de aanwezigheid van anti-NMDA receptor-auto-antilichamen in een menselijk plasmamonster. In deze samengestelde beelden geeft de gele kleur de colocalisatie van de NR1-GFP en anti-NMDA receptor-auto-antilichamen aan. De pijlen geven voorbeelden van cellen met prominente colocalisatie.

Een plasmamonster dat een overlapping van meer dan 30% van groene en rode signalen vertoont, zal in dit geval als positief worden geïnterpreteerd. In het samengestelde beeld van de negatieve controle is er weinig overlap van groene en rode signalen, wat de specifieke binding van de anti-NMDA receptor-auto-antilichamen aan de NR1-GFP in de test bevestigt. Eenmaal beheerst, kan de techniek in vier uur worden uitgevoerd als deze correct wordt uitgevoerd.

Wanneer je deze techniek probeert, is het belangrijk om te onthouden dat het slechts een screeningsmaatregel is. Na deze procedures kunnen andere maatregelen zoals western blot-analyse en weefsel-gebaseerde analyse worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de specificiteit van positieve gevallen. Na ontwikkeling, opent de techniek de weg voor onderzoekers op het gebied van de psychiatrie om differentiële diagnose van patiënten met een acute geestelijke gezondheidsnoodsituatie te verkennen.

Na het bekijken van deze video, zou je een goed begrip moeten hebben van hoe je de test uitvoert om te screenen op auto-antilichamen tegen NMDA-receptor in het bloed.