Auditieve Brainstem Response en buitenste Haarcel geheel-cel Patch klem opname bij postnatale ratten

Het algemene doel van deze elektrofysiologische test is om de morfologische en functionele veranderingen van haarcellen in het cochlea tijdens de postnatale ontwikkeling te onderzoeken. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het veld van de audiologische assistentie, zoals wanneer onze haarcellen hun functies verwerven tijdens het begin van het gehoor? Het grote voordeel van deze techniek is dat we in staat zijn om de functie van individuele haarcellen te evalueren, geïsoleerd van de postnatale rattenpups.

De procedure wordt gedemonstreerd door Wenlu Pan, Shasha Guo en Nana Xu, die studenten van ons laboratorium waren. Om deze procedure te beginnen, plaats je het verdoofde dier in een polyethyleen schuimvorm om het lichaam van het dier te immobiliseren. Plaats vervolgens het dier op een trillingsvrije tafel in een geluidsdempingskamer.

Houd de lichaamstemperatuur van het dier op 37,5 graden Celsius met een verwarmingskussen. Veeg vervolgens het hoofdgebied schoon met 70% ethanol. Maak een incisie van één tot twee millimeter ventraal-lateraal aan de buitenzijde van het oor om de referentie-elektrode of grondelektrode te plaatsen.

Plaats vervolgens een subdermaal opname-elektrode over de vertex van de schedel. Gebruik de functiegenerator om gekalibreerde toonbursten van verschillende frequenties en intensiteiten te genereren. Lever de geluidsstimuli af via een elektrostatische luidspreker op 10 centimeter afstand van het hoofd van het dier.

Om de auditieve stamhersenreacties te verkrijgen, worden de door geluid opgewekte potentialen gefilterd, versterkt en gemiddeld met behulp van een multifunctionele processor. De 40 minuten durende ABR-opname wordt online gemonitord en opgeslagen voor offline analyse. In deze sectie steriliseer je het hoofd van het dier door het te besproeien met 70% ethanol.

Vervolgens open je de schedel langs de sagittale middenlijn met schaar en verwijder je de hersenen om het binnenoor bloot te leggen. Breng vervolgens het binnenoor over in een 35 millimeter petrischaal gevuld met drie milliliter ijskoud Leibovitz's L-15 Medium. Gebruik onder de dissectiemicroscoop fijne pincetten om de botachtige capsule van het cochlea te verwijderen.

Ontdoe vervolgens het OC en SV van de modiolus. Door de basale portie van SV met pincetten vast te houden, scheid je OC volledig van SV door het langzaam van basis naar apex uit te winden. Snijd vervolgens OC gelijkmatig in drie stukken met fijne schaar.

Alle stappen moeten zo snel mogelijk in ijskoud L-15 worden uitgevoerd om degradatie en weefseldeterioratie te minimaliseren. Gebruik in deze stap een 200 microliter pipettentip om de segmenten van OC op een glazen plaatje te brengen. Fixeer ze met 100 microliter 4% paraformaldehyde gedurende minimaal vier uur bij vier graden Celsius.

Was vervolgens het weefsel door de paraformaldehyde te vervangen door 100 microliter vers PBS. Was het weefsel vervolgens drie keer gedurende 10 minuten per keer. Incubeer daarna het weefsel met 0,3% permeabiliteitsmiddel in PBS gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.

Gooi na 30 minuten het permeabiliteitsmiddel weg en was het weefsel drie keer met PBS. Blokkeer vervolgens het weefsel met 10% normaal geitenserum en PBS gedurende een uur bij kamertemperatuur. Incubeer het weefsel met anti-prestin C-terminus antilichaam en blokkeringsoplossing gedurende twee uur bij kamertemperatuur of gedurende de nacht bij vier graden Celsius.

Was vervolgens het weefsel drie keer met PBS gedurende vijf minuten per keer. Incubeer daarna het weefsel met Alexa 488-geconjugeerd secundair antilichaam in blokkeringsoplossing gedurende een uur bij kamertemperatuur in het donker. Was het weefsel drie keer met PBS gedurende vijf minuten per keer in het donker.

Incubeer vervolgens het weefsel met rodamine-phalloidine gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Was het weefsel drie keer met PBS gedurende vijf minuten in het donker. Monteer vervolgens het monster op een glazen plaatje met montagemiddel.

Beeld het af met confocale microscopie met behulp van 405 nanometer, 488 nanometer en 594 nanometer lasers. Gebruik in deze procedure de pipettentrekkern en microforger. Maak patchpipetten met een tipdiameter van twee tot drie microns.

Vul vervolgens de pipetten met intracellulaire oplossing. Gebruik een 200 microliter pipettentip om een stuk OC over te brengen naar een 35 millimeter petrischaal. Verhit het weefsel gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur met 100 microliter enzymatisch vergistingsmedium.

Verplaats vervolgens het enzymatisch vergistingsmedium door 100 microliter L-15. Snijd het weefsel in kleine stukken met een microscalpel om de haarcellen te isoleren. Na zacht pipetten, breng je de cellen over naar een zelfgemaakte kleine plastic kamer gevuld met enzymvrije badoplossing.

Plaats vervolgens de kamer op het podium van een omgekeerd microscoop en zoek de gezond uitziende solitair OHCs. Laad vervolgens de patchpipet in de hoofdfase van een 700B versterker. Positioneer de patchpipet rond de onderkant van de buitenste haarcel.

Patch clamp vervolgens de gehele OHC door de laterale wand van het cellichaam te verzegelen. Breng lichte zuiging aan totdat het celmembraan scheurt. Zet vervolgens het holdingpotentiaal op 70 millivolt.

Cellen met een toegangsweerstand variërend van 10 tot 17 megaohm en een membraanweerstand variërend van 100 tot 500 megaohm worden beschouwd als een succesvolle gehele celconfiguratie. Pas hyperpolariserende en depolariserende spanning toe op de cel om gehele celstromen op te wekken. Meet de membraancapaciteit van OHCs met behulp van een twee sinusgolf spanningsstimuleringsprotocol dat wordt geregeld door de patch clamp software.

Stel het stimulerende spanningsbereik in van 140 tot 110 millivolt en sla de gegevens op voor offline analyse. Na zachte vertering werden de OHCs geïsoleerd van de OC. Gehele cel spanningsclamp opnames werden uitgevoerd van OHCs die acuut werden geï