Intraperitoneaal Glucose tolerantie Test, meting van de longfunctie, en fixatie van de longen om te bestuderen van de gevolgen van obesitas en verminderde stofwisseling op pulmonaire resultaten
March 15th, 2018
De incidentie van obesitas stijgt en verhoogt het risico van chronische longziekten. De onderliggende mechanismen en preventieve strategieën, welomschreven dier vast te stellen modellen nodig zijn. Hier bieden wij drie methoden (glucose-tolerantie-test, lichaam plethysmography en fixatie van de Long) te bestuderen van het effect van obesitas op pulmonaire resultaten in muizen.
Het algemene doel van de volgende drie methoden is om de impact van obesitas en metabole stoornissen op de longstructuur en -functie te bestuderen. Deze methoden kunnen helpen om belangrijke vragen in het ademhalingsonderzoeksveld te beantwoorden over de impact van metabole stoornissen op longstructuur en longfunctie. Het voordeel van deze technieken is dat ze kunnen worden gecombineerd om de functionele rol van metabolisme op de pathogenese van chronische longziekten te beoordelen en om verschillende therapeutische benaderingen te testen.
De implicaties van deze technieken strekken zich uit van fenotypering tot wat de specifieke functionele rol van metabole doelen in de pathogenese van longziekten verduidelijkt. Deze methoden kunnen ook worden toegepast op de studie van structuur en functie bij zowel gezonde dieren met genetische modificaties, maar ook bij diermodellen van COPD en astma. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methoden worstelen, omdat het inbrengen van de tracheaalbuis, de insufflatie van de long en de toediening van de diepe anesthesie allemaal ervaring en training vereisen.
We hadden eerst het idee voor deze methoden toen we ontdekten dat vroeg beginnende obesitas bij muizen maar ook bij mensen nauw verbonden was met de invloed op metabolisme en op chronische longziekten buiten de kindertijd. Om de intraperitoneale glucosetolerantie te meten, beperk dan voorzichtig een 12 uur vastende volwassen muis door de staart en gebruik steriele schaar om de staartpunt in te snijden. Breng onmiddellijk een vrij vloeiende druppel bloed aan op de teststrip van de bloedglucosemeter om het vastenbloedglucoseniveau te meten.
Het testresultaat verschijnt na vier seconden op het glucometerscherm. Na het meten van de glucose voor elk dier, label ze afzonderlijk met gekleurde markeerstiften en weeg de dieren. Gebruik vervolgens een naald van 27 gauge verbonden aan een spuit van één milliliter om 100 microliters glucose per ton gram lichaamsgewicht toe te dienen aan elk dier via intraperitoneale injectie en meet de bloedglucosewaarden 15, 30, 60 en 120 minuten later met nieuwe teststrips zoals zojuist is gedemonstreerd.
Om de longfunctie te beoordelen, plaats een volwassen muis in de rugligging op een kussen en breng zalf aan op de ogen van het dier. Nadat u een gebrek aan reactie op teenprik hebt bevestigd, maakt u het haar in de schildklierstreek nat met 70% ethanol en gebruikt u een pincet om de huid op te tillen in het midden tussen de jukbeensnede bij het borstbeen en het tuber symphysis van het mentum. Gebruik stompe schaar om voorzichtig een huidsnede van één centimeter te maken in de gespannen huid om het onderliggende subcutane vetweefsel en de schildklier te visualiseren en de luchtpijp bloot te leggen met zorgvuldige stompe scheiding van beide schildklierkwabben bij het isthmus en dissectie van de sternothyroid en sternothyroid spieren.
Gebruik scherpe pincetten om een 4-0 gevlochten chirurgische naald tussen de luchtpijp en de slokdarm te passeren en snij voorzichtig de luchtpijp dicht bij het strottenhoofd tussen de tracheakraakbeen met microschaar. Intubeer met een tracheaalbuis en bevestig de buis met een chirurgische naald en verplaats het dier naar het verwarmde bed van een lichaamskamer. Verbind de tracheaalbuis met de gezichtsplaat en zet de ventilator aan.
Bevestig de beweging van de borstkas tegelijkertijd met de ventilatiesnelheid om de juiste plaatsing van de tracheaalbuis te bevestigen en observeer het druksignal op het computerscherm. Om veranderingen in de transpulmonale druk tijdens ventilatie te beheersen, steekt u een slokdarmsonde in tot op het niveau van de longen en bekijkt u het scherm om de plaatsing van de sonde te vergemakkelijken waar maximale drukdeflectie en minimale hartslag kunnen worden waargenomen. Begin de gegevensverzameling volgens de instructies van de fabrikant en breng 10 microliters PBS aan op de vernevelaar.
Begin met vernevelen na vijf minuten acclimatisatie gevolgd door een responsfase van drie minuten waarin de luchtwegweerstand en de compliantie van het ademhalingssysteem worden gemeten. Laat het dier drie minuten herstellen voordat u begint met de volgende vernevelen en volg de software-instructies voor stapsgewijze toepassing van toenemende 10-microliterconcentraties van methacholin op de ventilator. Voor een kwantitatieve histomorphometrische analyse van het longweefsel, maakt u een kleine incisie in het diafragma van een volwassen muis met stompe schaar en gebruikt u gekromde stompe schaar om een peristernaalincisie te maken over de gehele lengte van de ribbenkast om de borstholte voorzichtig te openen.
Til de ribbenkast op om de pleuraholte bloot te leggen en verwijder de thymus. Nadat u het hart hebt verwijderd, gebruikt u scherpe pincetten om de luchtpijp voor te bereiden en bloot te leggen om een 4-0 gevlochten chirurgische naald tussen de luchtpijp en de slokdarm te passeren, gevolgd door een zorgvuldige incisie van de luchtpijp dicht bij het strottenhoofd tussen de tracheakraakbeen. Intubeer met een intraveneuze canule van 26 gauge en gebruik een fixeermiddel om de longen op te blazen door drukfixatie bij een constante druk van 20 centimeter water.
Na 30 minuten bij kamertemperatuur, bind de luchtpijp en verwijder de canule tegelijkertijd. Vervolgens snijdt u de longen voorzichtig uit zonder het weefsel te beschadigen en bewaart u de longen in vers fixeermiddel bij vier graden Celsius een nacht. Obese muizen vertonen een verhoging van serumglucosewaarden 15 en 30 minuten na intraperitoneale glucose-injectie, wat wijst op een verminderde cellulaire glucoseopname in vergelijking met muizen die een standaarddieet krijgen.
Invasieve longfunctieanalyse toont een tot 1,5 keer hogere luchtwegweerstand bij obese muizen die een vetrijk dieet krijgen na stimulatie met methacholin in vergelijking met controledieren. Hematoxyline en eosinekleuring van longparenchymsecties na intratracheale installatie toont meerdere niet opgeblazen gebieden, dikke alveolaire septa en veelhoekige alveoli in longen die met te weinig druk zijn geïnstilleerd. Daarentegen leidt te veel instillatiedruk tot overgeblazen gebieden met vernietigde alveolaire septa.
Toepassing van de juiste hoeveelheid druk tijdens longfixatie leidt echter tot een volledig opgeblazen long met rondvormige alve
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel bespreekt methoden om de invloed van obesitas op de longstructuur en -functie te bestuderen met behulp van diermodellen. Het benadrukt het belang van deze technieken bij het begrijpen van chronische longziekten.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Ademhalingsonderzoek
- Metabole stoornissen
Achtergrond
- Obesitas is gekoppeld aan chronische longziekten.
- Het begrijpen van de mechanismen vereist goed gedefinieerde diermodellen.
- Onderzoek richt zich op het onderzoeken van de functionele rol van metabolisme in longpathogenese.
- Technieken kunnen worden toegepast op zowel gezonde als zieke modellen.
Doel van de studie
- Om de impact van obesitas op pulmonaire uitkomsten te beoordelen.
- Om preventieve strategieën voor chronische longziekten vast te stellen.
- Om de functionele rol van metabole doelen te verduidelijken.
Gebruikte methoden
- Glucosetolerantietest
- Bodyplethysmografie
- Longfixatie
- Combinatie van technieken voor een uitgebreide beoordeling
Belangrijkste resultaten
- Methoden geven inzicht in longstructuur en -functie.
- Technieken kunnen helpen bij het testen van therapeutische benaderingen.
- Resultaten breiden zich uit tot het begrijpen van COPD en astma.
- Ervaring is vereist voor de juiste uitvoering van de techniek.
Conclusies
- Deze methoden zijn cruciaal voor het bestuderen van de effecten van obesitas op de gezondheid van de longen.
- Ze vergemakkelijken de exploratie van metabole stoornissen bij ademhalingsziekten.
- Training is essentieel voor een effectieve toepassing van deze technieken.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Obesity-related metabolic dysfunction represents a growing risk factor for chronic lung diseases, creating a need for preclinical models that can mechanistically link systemic metabolism to pulmonary outcomes. The integrated assessment of glucose tolerance, lung function, and histological structure enables de-risking of therapeutic hypotheses by providing quantitative, reproducible readouts across metabolic and respiratory domains. This approach supports target validation and predictive confidence in early discovery by elucidating whether metabolic interventions modify lung pathology in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates the functional role of metabolic targets in lung pathogenesis by measuring glucose intolerance as a biomarker of impaired cellular uptake.
- Operational Value: Enables pathway clarification through standardized ipGTT procedures that detect diet-induced metabolic dysregulation in obese models.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by linking metabolic impairment to functional lung outcomes via concurrent airway resistance and compliance measurements.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by fixing lungs at standardized pressure to ensure reproducible alveolar morphology for histomorphometric analysis.
- Operational Value: Addresses assay standardization through stepwise methacholine challenge protocols that quantify dose-dependent bronchoconstriction in obese versus control animals.
- Scalability: Highlights platform reuse across COPD and asthma models, enabling consistent lung structure-function assessment in genetically modified or diseased cohorts.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance by connecting systemic inflammatory and metabolic dysregulation to lung structural changes such as thickened septa and polygonal alveoli.
- Operational Value: Describes continuity from discovery through preclinical validation by demonstrating how lung fixation at 20 cm H2O pressure yields round-shaped alveoli, enabling reliable quantitative endpoints.
- Risk-Adjusted Advancement: Addresses mechanistic de-risking by showing that appropriate insufflation pressure prevents overinflation or collapse, reducing artifact-driven variability in histological assessments.
Pipeline & Workflow Integration
The method positions itself within the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification, supporting iterative evaluation of metabolic interventions on lung structure and function in preclinical models.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing by measuring serum glucose levels at 15 and 30 minutes post-injection to evaluate cellular glucose uptake in obesity models.
- Screening: Describes assay readiness through reproducible airway resistance and compliance measurements following nebulization and methacholine challenge, enabling compound effect comparison.
- Analytics: Highlights quantitative dependent variable measurements such as increased airway resistance (up to 1.5-fold) and altered alveolar morphology that help teams compare metabolic and pulmonary phenotypes.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity by demonstrating lung preparation and fixation protocols that preserve tissue integrity for histological analysis across study groups.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability rather than a single-use technique, applicable to both healthy animals with genetic modifications and disease models of COPD and asthma.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in obesity-lung disease linkages.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of metabolic and functional pulmonary assessments.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early metabolic phenotype stratification.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on concordant glucose tolerance, lung function, and histological outcomes.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in surgical procedures including tracheal intubation, lung insufflation, and glucose administration.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs such as glucometers, ventilators, pressure monitoring systems, and nebulizers for methacholine delivery.
- Cross-team standardization requirements for consistent animal fasting, injection dosing, and timing of metabolic and functional readouts.
- Adaptation considerations across model systems including healthy, genetically modified, and disease-induced obese mice.
- Practical limitations supported by source material: investigator training and stress-reduced environments are recommended for optimal data acquisition due to technical complexity of surgical steps.
