Intraperitoneaal Glucose tolerantie Test, meting van de longfunctie, en fixatie van de longen om te bestuderen van de gevolgen van obesitas en verminderde stofwisseling op pulmonaire resultaten
15 maart 2018
De incidentie van obesitas stijgt en verhoogt het risico van chronische longziekten. De onderliggende mechanismen en preventieve strategieën, welomschreven dier vast te stellen modellen nodig zijn. Hier bieden wij drie methoden (glucose-tolerantie-test, lichaam plethysmography en fixatie van de Long) te bestuderen van het effect van obesitas op pulmonaire resultaten in muizen.
Het algemene doel van de volgende drie methoden is om de impact van obesitas en metabole stoornissen op de longstructuur en -functie te bestuderen. Deze methoden kunnen helpen om belangrijke vragen in het ademhalingsonderzoeksveld te beantwoorden over de impact van metabole stoornissen op longstructuur en longfunctie. Het voordeel van deze technieken is dat ze kunnen worden gecombineerd om de functionele rol van metabolisme op de pathogenese van chronische longziekten te beoordelen en om verschillende therapeutische benaderingen te testen.
De implicaties van deze technieken strekken zich uit van fenotypering tot wat de specifieke functionele rol van metabole doelen in de pathogenese van longziekten verduidelijkt. Deze methoden kunnen ook worden toegepast op de studie van structuur en functie bij zowel gezonde dieren met genetische modificaties, maar ook bij diermodellen van COPD en astma. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methoden worstelen, omdat het inbrengen van de tracheaalbuis, de insufflatie van de long en de toediening van de diepe anesthesie allemaal ervaring en training vereisen.
We hadden eerst het idee voor deze methoden toen we ontdekten dat vroeg beginnende obesitas bij muizen maar ook bij mensen nauw verbonden was met de invloed op metabolisme en op chronische longziekten buiten de kindertijd. Om de intraperitoneale glucosetolerantie te meten, beperk dan voorzichtig een 12 uur vastende volwassen muis door de staart en gebruik steriele schaar om de staartpunt in te snijden. Breng onmiddellijk een vrij vloeiende druppel bloed aan op de teststrip van de bloedglucosemeter om het vastenbloedglucoseniveau te meten.
Het testresultaat verschijnt na vier seconden op het glucometerscherm. Na het meten van de glucose voor elk dier, label ze afzonderlijk met gekleurde markeerstiften en weeg de dieren. Gebruik vervolgens een naald van 27 gauge verbonden aan een spuit van één milliliter om 100 microliters glucose per ton gram lichaamsgewicht toe te dienen aan elk dier via intraperitoneale injectie en meet de bloedglucosewaarden 15, 30, 60 en 120 minuten later met nieuwe teststrips zoals zojuist is gedemonstreerd.
Om de longfunctie te beoordelen, plaats een volwassen muis in de rugligging op een kussen en breng zalf aan op de ogen van het dier. Nadat u een gebrek aan reactie op teenprik hebt bevestigd, maakt u het haar in de schildklierstreek nat met 70% ethanol en gebruikt u een pincet om de huid op te tillen in het midden tussen de jukbeensnede bij het borstbeen en het tuber symphysis van het mentum. Gebruik stompe schaar om voorzichtig een huidsnede van één centimeter te maken in de gespannen huid om het onderliggende subcutane vetweefsel en de schildklier te visualiseren en de luchtpijp bloot te leggen met zorgvuldige stompe scheiding van beide schildklierkwabben bij het isthmus en dissectie van de sternothyroid en sternothyroid spieren.
Gebruik scherpe pincetten om een 4-0 gevlochten chirurgische naald tussen de luchtpijp en de slokdarm te passeren en snij voorzichtig de luchtpijp dicht bij het strottenhoofd tussen de tracheakraakbeen met microschaar. Intubeer met een tracheaalbuis en bevestig de buis met een chirurgische naald en verplaats het dier naar het verwarmde bed van een lichaamskamer. Verbind de tracheaalbuis met de gezichtsplaat en zet de ventilator aan.
Bevestig de beweging van de borstkas tegelijkertijd met de ventilatiesnelheid om de juiste plaatsing van de tracheaalbuis te bevestigen en observeer het druksignal op het computerscherm. Om veranderingen in de transpulmonale druk tijdens ventilatie te beheersen, steekt u een slokdarmsonde in tot op het niveau van de longen en bekijkt u het scherm om de plaatsing van de sonde te vergemakkelijken waar maximale drukdeflectie en minimale hartslag kunnen worden waargenomen. Begin de gegevensverzameling volgens de instructies van de fabrikant en breng 10 microliters PBS aan op de vernevelaar.
Begin met vernevelen na vijf minuten acclimatisatie gevolgd door een responsfase van drie minuten waarin de luchtwegweerstand en de compliantie van het ademhalingssysteem worden gemeten. Laat het dier drie minuten herstellen voordat u begint met de volgende vernevelen en volg de software-instructies voor stapsgewijze toepassing van toenemende 10-microliterconcentraties van methacholin op de ventilator. Voor een kwantitatieve histomorphometrische analyse van het longweefsel, maakt u een kleine incisie in het diafragma van een volwassen muis met stompe schaar en gebruikt u gekromde stompe schaar om een peristernaalincisie te maken over de gehele lengte van de ribbenkast om de borstholte voorzichtig te openen.
Til de ribbenkast op om de pleuraholte bloot te leggen en verwijder de thymus. Nadat u het hart hebt verwijderd, gebruikt u scherpe pincetten om de luchtpijp voor te bereiden en bloot te leggen om een 4-0 gevlochten chirurgische naald tussen de luchtpijp en de slokdarm te passeren, gevolgd door een zorgvuldige incisie van de luchtpijp dicht bij het strottenhoofd tussen de tracheakraakbeen. Intubeer met een intraveneuze canule van 26 gauge en gebruik een fixeermiddel om de longen op te blazen door drukfixatie bij een constante druk van 20 centimeter water.
Na 30 minuten bij kamertemperatuur, bind de luchtpijp en verwijder de canule tegelijkertijd. Vervolgens snijdt u de longen voorzichtig uit zonder het weefsel te beschadigen en bewaart u de longen in vers fixeermiddel bij vier graden Celsius een nacht. Obese muizen vertonen een verhoging van serumglucosewaarden 15 en 30 minuten na intraperitoneale glucose-injectie, wat wijst op een verminderde cellulaire glucoseopname in vergelijking met muizen die een standaarddieet krijgen.
Invasieve longfunctieanalyse toont een tot 1,5 keer hogere luchtwegweerstand bij obese muizen die een vetrijk dieet krijgen na stimulatie met methacholin in vergelijking met controledieren. Hematoxyline en eosinekleuring van longparenchymsecties na intratracheale installatie toont meerdere niet opgeblazen gebieden, dikke alveolaire septa en veelhoekige alveoli in longen die met te weinig druk zijn geïnstilleerd. Daarentegen leidt te veel instillatiedruk tot overgeblazen gebieden met vernietigde alveolaire septa.
Toepassing van de juiste hoeveelheid druk tijdens longfixatie leidt echter tot een volledig opgeblazen long met rondvormige alve
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel bespreekt methoden om de impact van obesitas op de longstructuur en -functie te bestuderen met behulp van diermodellen. Het benadrukt het belang van deze technieken voor het begrijpen van chronische longziekten.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Respiratoir onderzoek
- Metabole stoornissen
Achtergrond
- Obesitas is gekoppeld aan chronische longziekten.
- Het begrijpen van de mechanismen vereist goed gedefinieerde diermodellen.
- Het onderzoek is erop gericht de functionele rol van het metabolisme bij de pathogenese van de longen te verkennen.
- Technieken kunnen worden toegepast op zowel gezonde als zieke modellen.
Doel van de studie
- Om de impact van obesitas op pulmonale uitkomsten te beoordelen.
- Om preventieve strategieën voor chronische longziekten vast te stellen.
- Om de functionele rol van metabole targets te verduidelijken.
Gebruikte methoden
- Glucose-tolerantietest
- Lichaamsplethysmografie
- Fixatie van de longen
- Combinatie van technieken voor een uitgebreide beoordeling
Belangrijkste resultaten
- Methoden bieden inzicht in de structuur en functie van de longen.
- Technieken kunnen helpen bij het testen van therapeutische benaderingen.
- Resultaten dragen bij aan het begrip van COPD en astma.
- Ervaring is vereist voor een juiste uitvoering van de techniek.
Conclusies
- Deze methoden zijn cruciaal voor het bestuderen van de effecten van obesitas op de longgezondheid.
- Ze vergemakkelijken het onderzoek naar metabole stoornissen bij respiratoire aandoeningen.
- Training is essentieel voor een effectieve toepassing van deze technieken.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Metabole dysfunctie gerelateerd aan obesitas vormt een groeiende risicofactor voor chronische longziekten, waardoor er behoefte is aan preklinische modellen die het systemische metabolisme mechanistisch kunnen koppelen aan pulmonale uitkomsten. De geïntegreerde beoordeling van glucosetolerantie, longfunctie en histologische structuur maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen te stroomlijnen door kwantitatieve, reproduceerbare resultaten te verschaffen over metabole en respiratoire domeinen heen. Deze aanpak ondersteunt de validatie van targets en het voorspellend vertrouwen in vroege ontdekkingsfasen door te verduidelijken of metabole interventies de longpathologie beïnvloeden in ziekterelevante systemen.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt de functionele rol van metabole targets bij longpathogenese door glucoseintolerantie te meten als biomarker voor een verminderde cellulaire opname.
- Operationele waarde: Maakt pathway-verduidelijking mogelijk via gestandaardiseerde ipGTT-procedures die dieetgeïnduceerde metabole dysregulatie in obese modellen detecteren.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfolio-triage door metabole beperkingen te koppelen aan functionele longresultaten via gelijktijdige metingen van luchtwegweerstand en compliantie.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream workflows door longen bij een gestandaardiseerde druk te fixeren, om zo een reproduceerbare alveolaire morfologie voor histomorfometrische analyse te garanderen.
- Operationele waarde: Pakt assay-standaardisatie aan via stapsgewijze methacholine-challenge-protocollen die dosisafhankelijke bronchoconstrictie kwantificeren in obese dieren versus controledieren.
- Schaalbaarheid: Benadrukt de herbruikbaarheid van het platform in COPD- en astmamodellen, waardoor consistente beoordeling van de longstructuur-functie mogelijk is in genetisch gemodificeerde of zieke cohorten.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Bespreekt de relevantie voor ziekten door systemische inflammatoire en metabole ontregeling te koppelen aan structurele veranderingen in de longen, zoals verdikte septa en polygonale alveoli.
- Operationele waarde: Beschrijft de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door aan te tonen hoe longfixatie bij een druk van 20 cm H2O resulteert in rondvormige alveoli, wat betrouwbare kwantitatieve eindpunten mogelijk maakt.
- Risico-gecorrigeerde vooruitgang: Pakt mechanische risicovermindering aan door aan te tonen dat een passende insufflatiedruk overinflatie of collaps voorkomt, waardoor artefact-gedreven variabiliteit in histologische beoordelingen wordt verminderd.
Integratie van pipeline & workflow
De methode positioneert zich binnen het ontdekkingscontinuüm, van hypothesetoetsing tot lead-identificatie, ter ondersteuning van iteratieve evaluatie van metabole interventies op de longstructuur en -functie in preklinische modellen.
- Discovery Biology: Legt uit hoe de methode hypothesetesten ondersteunt door serumglucosewaarden te meten op 15 en 30 minuten na injectie om de cellulaire glucoseopname in obesitasmodellen te evalueren.
- Screening: Beschrijft de gereedheid van de assay via reproduceerbare metingen van de luchtwegweerstand en compliantie na nebulisatie en methacholine-provocatie, waardoor de effecten van verbindingen kunnen worden vergeleken.
- Analytics: Benadrukt kwantitatieve metingen van afhankelijke variabelen, zoals een verhoogde luchtwegweerstand (tot 1,5-voudig) en een veranderde alveolaire morfologie, die teams helpen om metabole en pulmonale fenotypes te vergelijken.
- Translationeel onderzoek: Verbindt de methode met preklinische continuïteit door protocollen voor longpreparatie en fixatie te demonstreren die de weefselintegriteit behouden voor histologische analyse over verschillende studiegroepen.
- Enterprise Reuse: Presenteert de methode als een herbruikbare capaciteit in plaats van een eenmalige techniek, toepasbaar op zowel gezonde dieren met genetische modificaties als ziektemodellen van COPD en astma.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellende betrouwbaarheid, doelwitvalidatie, vermindering van mechanistische ambiguïteit in de verbanden tussen obesitas en longziekten.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van metabole en functionele pulmonale beoordelingen.
- Strategische waarde: Betere go/no-go beslissingen, kapitaalefficiëntie en verminderd biologisch risico in een laat stadium door vroege stratificatie van het metabole fenotype.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering en beslissingen over verdere ontwikkeling op basis van concordante glucosetolerantie, longfunctie en histologische resultaten.
Overwegingen voor implementatie
- Vereiste wetenschappelijke expertise in chirurgische procedures, waaronder tracheale intubatie, longinsufflatie en glucose-toediening.
- Behoeften aan instrumentatie en analytische infrastructuur, zoals glucometers, ventilatoren, drukmonitoringsystemen en vernevelaars voor de toediening van methacholine.
- Vereisten voor standaardisatie tussen teams voor consistent vasten van dieren, injectiedosering en de timing van metabole en functionele read-outs.
- Overwegingen voor aanpassing over verschillende modelsystemen, waaronder gezonde, genetisch gemodificeerde en door ziekte geïnduceerde obese muizen.
- Praktische beperkingen ondersteund door bronmateriaal: training van de onderzoeker en stressarme omgevingen worden aanbevolen voor optimale data-acquisitie vanwege de technische complexiteit van de chirurgische stappen.
