Het opbouwen van een High-throughput Screening Platform te beoordelen van de heterogeniteit van de HER2-gen Amplification in kanker van de borst
5 december 2017
Heterogene verdeling van de HER2-positieve cellen kan worden waargenomen in een subset van kanker van de borst en genereert klinische dilemma's. Hier introduceren we een betrouwbare en voordelige protocol definiëren, meten en vergelijken van HER2 intra-tumor genetische heterogeniteit in een groot aantal ongelijkmatig verwerkte borstkankers.
Het algemene doel van deze laboratoriumprocedure is om gelijktijdig HER2 intra-tumor genetische heterogeniteit te definiëren, kwantificeren en vergelijken in een grote reeks heterogeen verwerkte borstkankers door middel van hoogdoorvoer zilver in situ hybridisatie. Deze methode kan helpen bij het kiezen van belangrijke borstkankertranslatie en onderzoek zoals de studie van HER2-genamplificatieheterogeniteit, een grote cohort van gevallen die zijn opgehaald uit pathologiearchieven. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het hoogdoorvoer HER2-schisanalyse mogelijk maakt over verschillende topografische gebieden van meerdere en heterogeen verwerkte borstkankers.
Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn in in situ hybridisatie worstelen omdat retrospectieve studies doorgaans de analyse vereisen van archiefmonsters die verschillende fixatie-, verwerkings- en opslagprocedures hebben ondergaan. We hadden voor het eerst het idee voor deze methode toen we besloten om alle borstkankers uit onze institutionele database sinds 2003 opnieuw te classificeren. Deze procedure zal worden gedemonstreerd door Giulia Ercoli, een technicus van ons laboratorium.
Begin dit protocol met de selectie van patiënten en weefselspecimens zoals beschreven in het tekstprotocol. Maak en open een nieuw spreadsheetbestand met de gegevens van de verschillende gebieden van elk geval. Voeg aparte kolommen toe voor geval-ID, blok-ID, gebied-ID, weefseltype, topografie, morfologie, biomarkerstatus en alle andere beschikbare immunohistochemische kenmerken.
Maak een TMA-project. Definieer de PMA-ontvangende blokken door naar bestand, nieuw, blok te navigeren. Klik op het eerste veld om in te vullen en typ de afmetingen van het paraffineblok.
Maak vervolgens een weefselarrayproject door naar bestand, nieuw, weefselarray te navigeren. Klik op het importpictogram en kies vervolgens het sjabloonbestand van het eerder gemaakte ontvangende blok. Klik op volgende.
Kies vervolgens één millimeter als de spotgrootte door op de ronde knop te klikken. Kies 500 micron als de spotafstand, dit is de ruimte tussen twee centra van naburige spots. Klik vervolgens op het rekenmachinepictogram om het totale aantal gemaakte spots te berekenen, wat 231 zou moeten zijn.
Klik vervolgens op de knop definiëren om rasters en subrasters te maken. Verwijder kolommen acht en 15 en de centrale lijn. Behoud drie spots van lijn één voor oriëntatie.
De uiteindelijke kaart moet een totaal aantal van 183 spots omvatten. Definieer de lijst met weefseltypen door naar bestand, nieuw, lijst van weefseltypen te navigeren. Definieer vervolgens het project door naar bestand, nieuw, boosterproject te navigeren.
Bereid vervolgens de acceptorblokken voor. Vul gereinigde metalen mallen met geelasticeerd paraffine bij 65 graden Celsius. Laat de paraffineblokjes overnacht afkoelen op kamertemperatuur in de metalen mallen.
De volgende dag, verwijder de paraffineblokjes uit de metalen mallen. Bouw de TMA op met behulp van een geautomatiseerde of semi-automatische arrayer door eerst de arrayer aan te zetten en vervolgens de acceptorblokjes in de arrayer-carrousel te plaatsen. Definieer de startpositie op elk ontvangende blok door de pijltoetsen te gebruiken om het laserlicht te verplaatsen en het uit te lijnen met de bovenste linkerrand op het paraffine van het ontvangende blok.
Klik op volgende en herhaal voor de verticale uitlijning. Klik opnieuw op volgende om automatisch een gat te maken in de eerder gedefinieerde coördinaat van het ontvangende blok. Leeg de pons.
Positioneer de donorblok voor bemonstering en verwijder een weefselkern uit het eerder geannoteerd gebied van belang. Plaats de donorweefselkern in het gat in het ontvangende blok. Verwijder vervolgens de donorblok van de arrayer.
Herhaal deze stappen totdat de TMA is voltooid. Leg de weefselzijde van de nieuw gegenereerde TMA-blok op een steriele blanco dia en plaats ze in de laboratoriumoven op 45 graden Celsius gedurende vijf minuten. Druk voorzichtig gedurende vijf seconden op de blok om de weefselkernen plat te drukken.
Herhaal eenmaal voor een totaal van twee keer. Bedek vervolgens het TMA-weefseloppervlak met een dunne laag geelasticeerde paraffine bij 65 graden Celsius. Laat de TMA-blok twee uur op kamertemperatuur staan.
Breng tenslotte de TMA-blok over bij vier graden Celsius gedurende 24 uur voordat histochemische en immunohistochemische analyses worden uitgevoerd zoals beschreven in het tekstprotocol. Plaats de TMA-dia's om te analyseren op 60 graden Celsius gedurende 10 minuten. Start vervolgens het immunostainer-instrument en de software.
Klik in de startweergave op de knop protocollen en klik vervolgens op protocollen maken/bewerken. Selecteer de dual ISH-cocktailprocedure om de basissjabloon aan te passen. Markeer het bakken in de lijst met vakken en stel de temperatuur in op 63 graden Celsius gedurende 20 minuten.
Markeer vervolgens deparaffinisatie. Markeer vervolgens celconditionering in de lijst met vakken. Markeer vervolgens celconditionering CC2 en stel de temperatuur in op 86 graden Celsius en de incubatietijd op vier minuten.
Markeer mild CC2 gedurende acht minuten, standaard gedurende 12 minuten en uitgebreid gedurende acht minuten. Markeer ISH-Protease drie in de lijst met vakken en stel de incubatietijd in op 16 minuten. Selecteer de sonde's HER2 dinitrofenyl en chromosoom 17 digoxigenine.
Incubeer gedurende 16 minuten en stel vervolgens de denaturatie in gedurende 20 minuten bij 80 graden Celsius. Stel de incubatietijd van de sonde in op zes uur. Stel vervolgens de SISH-multimeer incubatietijd in op 32 minuten.
Stel de zilverchromat en de incubatietijd in op vier minuten. Stel vervolgens de rode multimeer incubatietijd in op 24 minuten. Stel de rode chromat en de incubatietijd in op acht minuten.
Markeer vervolgens tegenkleuring in de lijst met vakken, selecteer hematoxylinen twee en stel de incubatietijd in op acht minuten. Markeer post tegenkleuring in de lijst met vakken, selecteer bluing reagens en stel de incubatietijd in op vier minuten. Voer ten slotte schizoanalyse voor HER2 uit
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een betrouwbaar en kosteneffectief protocol voor het definiëren, kwantificeren en vergelijken van de intratumorale genetische heterogeniteit van HER2 bij borstkanker. De methode maakt gebruik van high-throughput silver in situ hybridisatie om klinische dilemma's aan te pakken die voortvloeien uit de heterogene distributie van HER2-positieve cellen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Borstkankeronderzoek
- Genetische heterogeniteit
- In situ hybridisatietechnieken
Achtergrond
- HER2-positieve cellen vertonen een heterogene distributie in sommige borstkankers.
- Deze heterogeniteit vormt een uitdaging voor de klinische besluitvorming.
- Bestaande methoden kunnen problematisch zijn bij archiefmonsters vanwege variaties in de verwerking.
- High-throughputtechnieken kunnen de analyse van meerdere monsters verbeteren.
Doel van de studie
- Om een methode te ontwikkelen voor het analyseren van de heterogeniteit van HER2-genamplificatie.
- Om onderzoek naar borstkanker te faciliteren met behulp van een grote cohort uit pathologiearchieven.
- Om de betrouwbaarheid van HER2-analyse in klinische settings te verbeteren.
Gebruikte methoden
- High-throughput silver in situ hybridisatie.
- Analyse van een grote reeks borstkankergevallen.
- Vergelijking van HER2 genetische heterogeniteit in verschillende tumorgebieden.
- Gebruik van archiefmonsters met uiteenlopende fixatie en verwerking.
Belangrijkste resultaten
- De methode maakt een effectieve kwantificering van HER2-heterogeniteit mogelijk.
- High-throughput analyse onthult significante variaties in HER2-expressie.
- De resultaten kunnen bijdragen aan behandelbeslissingen bij de behandeling van borstkanker.
- Het protocol is aanpasbaar voor verschillende verwerkingscondities van monsters.
Conclusies
- Dit protocol vergroot het begrip van HER2-heterogeniteit bij borstkanker.
- Het biedt een waardevol hulpmiddel voor zowel onderzoekers als clinici.
- Toekomstige studies kunnen voortbouwen op deze methode om HER2-gerelateerde therapieën verder te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
HER2-heterogeniteit bij borstkanker compliceert behandelbeslissingen en draagt bij aan variabele klinische uitkomsten, waardoor er een behoefte is aan gestandaardiseerde, schaalbare beoordelingsmethoden. Dit high-throughput SISH-platform maakt gelijktijdige kwantificering van HER2-genamplificatie mogelijk over meerdere tumortopografieën en archiefmonsters, wat preklinische targetvalidatie en biomarkerstratificatie ondersteunt. Door een reproduceerbare, kwantitatieve mapping van de HER2-status te bieden, verbetert deze methode het voorspellende vertrouwen in workflows voor vroege ontdekking en translationeel onderzoek.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om HER2-amplificatiepatronen in verschillende tumorregio's te onderzoeken om de validiteit van het target en de biologische relevantie te verduidelijken.
- Operationele waarde: Ondersteunt functionele risicoreductie van targets door de intra-tumor genetische variabiliteit in archiefcohorten van borstkanker te kwantificeren.
- Voorspellende waarde: Genereert HER2/chromosoom 17-signaalratio's en drempelwaarden voor het kopie-aantal om go/no-go-beslissingen bij de selectie van targets te onderbouwen.
Screening & assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Produceert gestandaardiseerde TMA-formaten geoptimaliseerd voor SISH, wat schaalbare screening van de HER2-status in heterogene monsters mogelijk maakt.
- Kwantitatieve output: Levert de HER2/chromosoom 17-ratio en het gemiddelde HER2-kopiegetal per cel als meetbare eindpunten voor assay-validatie.
- Hergebruik van het platform: Aanpasbaar aan andere kankertypen (bijv. maagkanker) waarbij HER2-heterogeniteit de therapeutische respons beïnvloedt, wat de overdraagbaarheid van de assay tussen verschillende indicaties ondersteunt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Brengt de HER2-status in kaart van de ontdekkingsfase tot preklinische modellen door ruimtelijke heterogeniteit in FFPE-weefsels te behouden.
- Afstemming van biomarkers: Integreert met IHC voor ER, PR, Ki67 en HER2 om multimodale biomarkerprofilering in archiefcohorten mogelijk te maken.
- Risico-gecorrigeerde progressie: Identificeert HER2-negatieve subpopulaties binnen ogenschijnlijk HER2-positieve tumoren, wat bijdraagt aan combinatietherapiestrategieën en inzicht in resistentiemechanismen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het continuüm van ontdekking naar translationele toepassing, waardoor HER2-heterogeniteit kan worden beoordeeld na target-identificatie en vóór preklinische efficiëntietests, in het bijzonder bij biomarker-gestuurde stratificatie.
- Discovery Biology: Faciliteert hypothesetoetsing van HER2-amplificatiepatronen en pathway-heterogeniteit in primaire tumorstalen.
- Screening: Garandeert de reproduceerbaarheid van de assay via gestandaardiseerde TMA-constructie en uitvoering van het SISH-protocol over verschillend verwerkte specimens.
- Analytics: Levert kwantitatieve HER2/chromosoom 17-ratio's en drempelwaarden voor het kopiegetal om een objectieve vergelijking van genetische heterogeniteit mogelijk te maken.
- Translationeel Onderzoek: Ondersteunt de continuïteit naar preklinisch werk door ruimtelijke HER2-patronen te koppelen aan functionele uitkomsten in modelsystemen.
- Enterprise Reuse: Vestigt een schaalbaar, gestandaardiseerd platform voor HER2-beoordeling dat toepasbaar is op meerdere kankerindicaties en archiefsets van stalen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit in HER2-gestuurde pathways door intratumorale genetische heterogeniteit op te lossen.
- Operationele waarde: Garandeert standaardisatie en reproduceerbaarheid door geautomatiseerde TMA-arraying en geoptimaliseerde SISH-condities.
- Strategische waarde: Verbetert de efficiëntie van go/no-go-beslissingen door kwantitatieve HER2-drempelwaarden te bieden voor patiëntenstratificatie in preklinische studies.
- Impact op portfolio: Maakt risicogecorrigeerde prioritering van HER2-gerichte kandidaten mogelijk door tumoren met heterogene amplificatieprofielen te identificeren.
Overwegingen voor Implementatie
- Vereist expertise in de constructie van weefselmicroarrays, in situ hybridisatie en digitale pathologieanalyse.
- Afhankelijk van automatische kleurapparaten, TMA-arrayers en beeldvormingssystemen die in staat zijn tot SISH-signaaldetectie.
- Vereist standaardisatie tussen teams van pathologie, moleculaire biologie en bio-informatica voor een consistente interpretatie van gegevens.
- Variaties in fixatie, verwerking en opslag moeten in overweging worden genomen bij het vergelijken van HER2-signalen in archiefmonsters.
- Beperkt tot de beoordeling van HER2-amplificatie op DNA-niveau; legt geen eiwitexpressie of signaleringsactiviteit vast zonder aanvullende IHC of functionele assays.
Veelgestelde vragen over Biofarmacie
Chapters in this video
0:05
Title
1:24
Design and Construct Tissue Microarrays (TMAs) Based on the Kononen Technique
6:20
Silver In Situ Hybridization (SISH) Analysis of Human Epidermal Growth Factor Receptor 2 (HER2)
9:11
Results: Analysis of Heterogeneity of HER2 Gene Amplification in Breast Cancers
10:00
Conclusion
