Name: Voorbijgaande expressie van buitenlandse genen in Insect cellen (sf9) voor eiwit functionele Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Leer een warmteschok-geïnduceerd eiwitexpressiesysteem om anti-apoptotische activiteit te evalueren in Sf9-insectcellen. Deze methode biedt gecontroleerde genexpressie voor biotechnologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken Dr. Jian-Horng Leu van Instituut van mariene biologie, National Taiwan Oceaan University voor het verstrekken van 3 plasmide constructies. Dit onderzoek werd gesteund door Grant 106-2311-B-197-001 - van het ministerie van wetenschap en technologie (MOST).

1. voorbereiding
<ol><li>Insect celkweek<ol>
<li>50 mL cel kweekmedium voor te bereiden. Om dit te doen, voeg 500 µL van antibiotica (Amfotericine B = 0,25 µg/mL penicilline = 100 eenheid/mL streptomycine = 100 µg/mL) en 5 mL van de warmte-geïnactiveerd foetale runderserum in cel serumvrij cultuurmedium (zonder FBS of antibiotica). Opmerking: Verwarm de foetale runderserum bij 65 ° C gedurende 30 minuten in een waterbad vóór gebruik.</li>
		<li>Spodoptera frugiperda handhaven (Lepidoptera: Noctuidae, de uilen), sf9 insect cellen. Ontkoppel ca. 80% van de cellen van de kolf van de cultuur van de cel van 25 cm2 door schudden de kolf en controleer onder de lichte microscopie. Vervolgens 50% van de celsuspensie overbrengen in een nieuwe cultuur maatkolf van 25 cm2 cel en de cellen te voegen gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur toestaan. Het medium te vervangen door 5 mL verse cel kweekmedium en groeien in een incubator bij 28 ° C. Passage cellen elke 2 tot 3 dagen afhankelijk van de celgroei.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voorbereiding van plasmiden, cel transfectie<ol>
<li>Invoegen de target-DNA-fragmenten (bijvoorbeeld Lymantria xylina MNPV (LyxyMNPV) iap3 gen en de constructies van de schrapping) pDHsp/V5-zijn door PCR-gebaseerde klonen methode11. Controleer de groei van getransformeerde kolonies door kolonie PCR met behulp van PCR Master Mix (2 X) en de pDhsp-F2/Op-IE2R primer instellen. Bevestig de plasmide sequenties door commerciële sequencing-service. Opmerking: Tabel 1 bevat de inleidingen voor PCR en de bijbehorende constructies gebruikt.</li>
		<li>Cultuur één gesequenceerd bacteriële kolonies, waarin de bovengenoemde plasmide constructies (stap 1.2) in 200 mL LB middellange bevattende geselecteerd antibiotica (50 µg/mL), respectievelijk.</li>
		<li>Pak de plasmiden uit de gekweekte E. coli met behulp van Midi plasmide Kit volgens fabrikant instructies12.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereid plating medium door het mengen van 1,5 mL cel kweekmedium en 8,5 mL cel serumvrij cultuurmedium.</li>
	<li>Actinomycin D (ActD) cel kweekmedium bereiden door 1,5 µL van ActD voorraad (1 mg/mL) toe te voegen in 10 mL cel kweekmedium (eindconcentratie = 150 ng/mL). Bewaren bij 4 ° C.</li>
</ol>2. eiwituitdrukking voorbijgaande
<ol><li>Cel zaaien<ol>
<li>Oogst van de sf9 cellen door schudden de kolf van de cultuur, omver vallen de celsuspensie aan tube 50 mL en hemocytometer 10 µL overbrengen door een pipet P10. Het nummer van de cel onder een lichte Microscoop te tellen.</li>
		<li>Plaat 3 × 105 sf9 cellen in elk putje in een 24-well plaat gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Vervang het medium met 0,5 mL medium plating.</li>
	</ol>
</li>
	<li>De transfectie van plasmiden<ol>
<li>Verdunde cel transfectiereagens: Verdun 8 µL van cel transfectiereagens in 100 µL cel serumvrij cultuurmedium en meng door de vortexing voor 1 s.</li>
		<li>2 µg plasmide DNA (pDHsp70-Ac-P35/V5-zijn of pDHsp70-Ly-IAP3/V5-zijn of pDHsp70-Ly-IAP3-BIR/V5-zijn of pDHsp70-Ly-IAP3-RING/V5-Hsi) in 100 µL van cel serumvrij cultuurmedium en mix toevoegen door de vortexing voor 1 s (Figuur 2).</li>
		<li>Combineer de verdunde plasmide DNA en verdunde cel transfectiereagens (210 µL), en meng door de vortexing voor 1 s. Incubate gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Voeg 210 µL van DNA transfectie reagens mengsel ontkleuring op de cellen door een pipet P1000. Incubeer bij 28 ° C gedurende 5 uur.</li>
		<li>Vervang het medium beplating met 0,5 mL van cel kweekmedium met behulp van een precisiepipet P1000. Zegel van de 24-well plaat met tape en Incubeer de cellen bij 28 ° C gedurende 16 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Warmte schok transfected cellen: zet de plaat in een waterbad van 42 ° C (drijvend op het watervlak). Verwarm gedurende 30 minuten en de 24-well plaat terug te keren naar de 28 ° C incubator.</li>
	<li>Detectie van eiwit expressie<ol>
<li>Spoel de cellen met 0,5 mL 1 x PBS buffer kort driemaal na 1 h of 5 h warmte schok. Opmerking: Verdun 10 x PBS buffer op 1 x PBS buffer door toevoeging van 1 mL 10 x PBS buffer 9 mL gesteriliseerd ddH2O</li>
		<li>Lyse de cellen met 40 µL 1 x SDS laden kleurstof door pipetteren omhoog en omlaag. Opmerking: Verdun 4 x SDS laden kleurstof door het mengen van 30 µL 1 x PBS buffer en 10 µL van 4 x SDS monster Buffer.</li>
		<li>Verwarm de eiwitsteekproeven bij 98 ° C gedurende 10 minuten in een warmte blok spin down voor 1 min en ijs voor westelijke vlek assay zetten.</li>
		<li>Western blot test Volg de procedure voor westelijke vlek assay van Eslami en Lujan13. SDS-pagina14gels worden uitgevoerd: één gel onderworpen aan Coomassie blue kleuring (controle op laden om te controleren dat de hoeveelheid EiwitSteekproeven geladen in elk goed gelijke bedragen is) en de andere onderworpen aan de Western blot assay, volgens Eslami en Lujan13 .</li>
		<li>Detecteren van fusion V5-gelabelde proteïnen met konijn anti-V5 antilichaam (5 mg/mL) (1:5000 verdunning in de buffer TBST te werken concentratie 1 µg/mL) en geit anti-konijn IgG-horseradish peroxidase (HRP) geconjugeerde (0,8 mg/mL) (1:10000 verdunning in de buffer TBST te werken concentratie 0.08 µg/mL). Opmerking: Aanpassen van het percentage van polyacrylamide tot 17,5% wanneer het molecuulgewicht van de eiwitten als < 17 kDa.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. anti-apoptotic activiteit assay
<ol><li>Cel gen-veroorzaakte apoptosis: Herhaal de bovengenoemde procedure van 2.1 tot 2.3. Co transfect 1 microgram van pDHsp/D-rpr/vlag-Hsi plasmide DNA (met apoptosis inductor gene) met 1 µg plasmide DNA [pDHsp70/V5-Hsi vector (negatieve controle), pDHsp70-Ac-P35/V5-zijn (positieve controle), pDHsp70-Ly-IAP3/V5-zijn, pDHsp70-Ly-IAP3-BIR/V5-Hsi of pDHsp70-Ly-IAP3-RING/V5-zijn, respectievelijk.]. Voeren op 5 h post-warmtebehandeling schok, de cel levensvatbaarheid assay (Figuur 2).</li>
	<li>Chemische-geïnduceerde cel apoptosis: Herhaal de bovengenoemde procedure van 2.1 tot 2.3. Plaat in stap 2.1.2, 1 x 106 sf9 cellen in elk putje in een 6-well-plate. Transfect 4 µg plasmide DNA [pDHsp70/V5-Hsi vector (negatieve controle), pDHsp70-Ac-P35/V5-zijn (positieve controle), pDHsp70-Ly-IAP3/V5-zijn, pDHsp70-Ly-IAP3-BIR/V5-zijn of pDHsp70-Ly-IAP3-RING/V5-zijn, respectievelijk.]. 5 h na warmte schok, sf9 cellen met 2 mL gestolde voedingsbodem van de cel van de ActD voor 16 h behandelen en uitvoeren van de cel levensvatbaarheid assay (Figuur 2). Opmerking: Minimumhoeveelheid ter dekking van een put van 6-well plaat is 1 mL.</li>
	<li>Het uitvoeren van de bovenstaande anti-apoptotic activiteit assay experimenten, met inbegrip van 3.1 en 3.2 in triplicates.</li>
</ol>4. cel levensvatbaarheid assay
<ol><li>Het wassen van de behandelde cellen door toevoeging van 1 mL 1 x PBS buffer voor 1 min 3 keer. Resuspendeer de cellen door 1 mL 1 x PBS buffer met 0,04% trypan blauwe pipetteren en vlek gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur. Breng de celsuspensie in een 1,5 mL microtube. Opmerking: Verdun 0,4% trypan blauwe oplossing door het mengen van 9 mL 1 x PBS buffer en 1 mL 0,4% trypan blauwe oplossing.</li>
	<li>10 µL trypan blauw gebeitste celsuspensie overbrengen in de hemocytometer met een pipet P10 en levensvatbare intact cellen onder een lichte Microscoop tellen.</li>
	<li>Statistische analyse<ol>
<li>De opgenomen gegevens berekenen en presenteren als de middelen ± S.D. voor alle tellingen.</li>
		<li>Het analyseren van de gegevens van de Student tweezijdige t-test door met Microsoft Excel. Statistisch significante gegevens definiëren als P-waarde < 0.05.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Miller, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baculoviruses+as+gene+expression+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Baculoviruses as gene expression vectors.</a> Annual Reviews in Microbiology. 42 (1), 177-199 (1988).</li>
<li>Theilmann, D. A., et al. Family Baculoviridae. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTheilmann%2C+DA+%22Virus+Taxonomy%3A+Eighth+Report+of+the+International+Committee+on+Taxonomy+of+Viruses%22">Virus Taxonomy: Eighth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses</a>. Fauquet, C. M., Mayo, M. A., Maniloff, J., Desselberger, U., Ball, L. A. , Springer Press. New York. 1129-1185 (2005).</li>
<li>Nai, Y. S., Huang, Y. F., Chen, T. H., Chiu, K. P., Wang, C. H. Determination of nucleopolyhedrovirus' taxonomic position. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNai%2C+YS+%22Biological+Control+of+Pest+and+Vector+Insects%22">Biological Control of Pest and Vector Insects</a>. Shields, V. D. C. , InTech Press. Rijeka. 169-200 (2017).</li>
<li>Friesen, P. D. Regulation of baculovirus early gene expression. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFriesen%2C+PD+%22The+Baculoviruses%22">The Baculoviruses</a>. Miller, L. K. , Plenum Press. New York. 141-170 (1997).</li>
<li>Smith, G. E., Summers, M., Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+human+beta+interferon+in+insect+cells+infected+with+a+baculovirus+expression+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Production of human beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expression vector.</a> Mol. Cell. Biol. 3 (12), 2156-2165 (1983).</li>
<li>Luckow, V. A., Summers, M. D. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/nbt0188-47">Trends in the development of baculovirus expression vectors.</a> Nature Biotechnol. 6 (1), 47-55 (1988).</li>
<li>Jarvis, D. L., Finn, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modifying+the+insect+cell+N-glycosylation+pathway+with+immediate+early+baculovirus+expression+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Modifying the insect cell N-glycosylation pathway with immediate early baculovirus expression vectors.</a> Nature Biotechnol. 14 (1996), 1288-1292 (1996).</li>
<li>Clem, R. J., Miller, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+programmed+cell+death+by+the+baculovirus+genes+p35+and+iap%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Control of programmed cell death by the baculovirus genes p35 and iap.</a> Mol. Cell. Biol. 14, 5212-5222 (1994).</li>
<li>Leu, J. H., Kuo, Y. C., Kou, G. H., Lo, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+and+characterization+of+an+inhibitor+of+apoptosis+protein+%28IAP%29+from+the+tiger+shrimp%2C+Penaeus+monodon%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Comp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning and characterization of an inhibitor of apoptosis protein (IAP) from the tiger shrimp, Penaeus monodon.</a> Dev. Comp. Immunol. 32, 121-133 (2008).</li>
<li>Zhao, Y. G., Eggleston, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+promoters+for+transient+gene+expression+in+cultured+mosquito+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of promoters for transient gene expression in cultured mosquito cells.</a> Insect Mol. Biol. 8 (1), 31-38 (1999).</li>
<li>Nai, Y. S., Yang, Y. T., Kim, J. S., Wu, C. Y., Chen, Y. W., Wang, C. H. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s13355-016-0403-x">Baculoviral IAP2 and IAP3 encoded by Lymantria xylina multiple nucleopolyhedrovirus (LyxyMNPV) suppress insect cell apoptosis in a transient expression assay.</a> Appl. Entomol. Zool. 51, 305-316 (2016).</li>
<li>Geneaid™. Geneaid™ Midi Plasmid Kit & Geneaid™ Midi Plasmid Kit (Endotoxin Free) Instruction Manual Ver. 05.11.17. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.geneaid.com/sites/default/files/PI13_0.pdf">http://www.geneaid.com/sites/default/files/PI13_0.pdf</a> (2017).</li>
<li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+Blotting%3A+Sample+Preparation+to+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Western Blotting: Sample Preparation to Detection.</a> J. Vis. Exp. (44), e2359(2010).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. , Cambridge, MA. Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page">https://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page</a> (2017).</li>
<li>Vucic, D., Kaiser, W. J., Harvey, A. J., Miller, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+reaper-induced+apoptosis+by+interaction+with+inhibitor+of+apoptosis+proteins+%28IAPs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Inhibition of reaper-induced apoptosis by interaction with inhibitor of apoptosis proteins (IAPs).</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 10183-10188 (1997).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Het concept van warmte schok gebaseerde pDHsp/V5-zijne/sf9 cel systeem werd voor het eerst beschreven door Clem et al. in 19948. Vergelijking van de baculoviral gen promotor (IE1) en Drosophila hsp70 toonde aan dat hsp70 had een hogere efficiëntie in mug cellen10. Bovendien, als gevolg van de hitte schok inductie, de timing van eiwit expressie kan worden gecontroleerd juist na de schok van de warmtebehandeling. Dit systeem werd vervolgens...

Twee eiwit expressiesystemen zijn meestal gebruikt voor de productie van eiwitten: prokaryote eiwit expressie (Escherichia coli gen expressie systeem) en eukaryote eiwit expressiesystemen. Een populaire eukaryote eiwit expressie systeem is de baculovirus expressie vector systeem (BEVS)1. Baculoviruses werden voor het eerst gebruikt als wereldwijd biologische bestrijders van landbouw en bosbouw van ongedierte. In de afgelopen decennia, werden baculoviruses ontwikkeld als biotechnologische instrumenten voor eiwit expressievectoren evenals. Het genoom van de baculoviruses bestaan uit circulaire dubbelstrengig DNA en omhuld nucleocapsids2. Tot op heden meer dan achtenzeventig baculovirus geweest isolaten gesequenceerd3. Op basis van de temporele cascade van baculoviral gen expressies in insect cellen van de gastheer, kan de transcriptie van het gen worden ingedeeld in vier temporele cascades, met inbegrip van direct-vroege, vertraagd-vroege, late en erg laat genen4.
BEVSs werden aangewezen, zodat het zeer laat gene initiatiefnemers (d.w.z., veelvlak of p10 promotor) werden gebruikt om te rijden de doelgenen, terwijl de recombinante baculovirus werd gegenereerd door homologe recombinatie. Uitdrukking van vreemde proteïnen in insect cellen door recombinant baculovirus is vergelijkbaar met die van zoogdieren eiwitten in posttranslationele modificaties (geschikt voor de productie van glycoproteïne). Aldus, is de baculovirus gebruikte5,6,7. Een beperking is echter de aanwezigheid van verschillende N-glycosylation routes in insect cellen7.
Daarom werd een nieuwe baculovirus expressie systeem, het voorbijgaande gen expressie systeem, ontwikkeld. Dit systeem geeft uiting aan buitenlandse genen onder de schijf van baculoviral onmiddellijk-vroege initiatiefnemers (dwz 1 promotor) in insect cellen. Met behulp van dit systeem, kan de doel-eiwit worden onmiddellijk uitgedrukt onder de controle van ie-1 promotor tijdens het wijzigen van de route van de N-glycosylation in insect cellen, wat resulteert in betere N-linked oligosacchariden7. Bovendien, baculoviral onmiddellijke-vroege genen worden getranscribeerd door de gastheercel RNA polymerase II en vereisen geen enige virale factor voor activering4. Daarom kunnen vreemde eiwitten worden uitgedrukt in insect cellen binnen een korte tijd. Tot op heden, de voorbijgaande is gen expressie systeem een van de belangrijkste technologieën voor het uitvoeren van functionele testen van eiwit in de baculovirus in vitro celcultuur. Het systeem kan worden toegepast om de functie van baculovirus of vreemde eiwitten te analyseren. Een van de verkrijgbare voorbijgaande gen expressiesystemen is gebaseerd op de onmiddellijke-vroege gen (IE) initiatiefnemers van Orgyia pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrovirus (OpMNPV) (OpIE2 en OpIE1 initiatiefnemers).
Het lagere niveau van de expressie van buitenlandse genen in insect cellen was echter nog steeds een probleem toen het OpIE promotor gebaseerde voorbijgaande gen expressie systeem gebruikte8,9,10. Dus, een ander voorbijgaande gen expressie systeem werd gebouwd op basis van de promotor van de Drosophila warmte schok eiwit 70 (hsp70) gen8,9. De promotor van hsp70 werkt efficiënter dan baculoviral IE promotor wanneer geïnduceerd door warmte schok in insect cellen10. In dit systeem, werden de doelgenen uitgedrukt onder het station van Drosophila warmte schok 70 (Dhsp70) promotor. Buitenlandse genen kunnen gemakkelijk worden gekloond in het voorbijgaande gen expressie plasmide door PCR-gebaseerde klonen methoden. Bovendien is de controle van de timing voor de expressie van genen kan worden uitgevoerd door warmte schok inductie.
In dit verslag, we volgen de aanpak en uiten van drie verschillende opschoningen van het baculoviral gen (remmer van apoptosis 3, iap3 vanaf Lymantria xylina MNPV) met behulp van de warmte schok gebaseerde voorbijgaande eiwit expressie systemen en Verder gelden deze uitgedrukte proteïnen op anti-apoptotic activiteit analyse. Dit systeem kan ofwel express vreemde eiwitten snel of verder worden toegepast op de evaluatie van eiwit anti-apoptotic activiteit in sf9 cellen, terwijl ook het potentieel om te worden toegepast op andere eiwit activiteit testen te hebben.

<table><tbody><tr><td>Antibiotic-Antimycotic, 100X</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td>voor insectencelcultuur</td></tr><tr><td>Certified Foetal Bovine Serum</td><td>Bioind</td><td>04-001-1A</td><td></td></tr><tr><td>Sf-900 II SFM</td><td>Thermo Fisher</td><td>10902096</td><td>serum-vrij celcultuurmedium</td></tr><tr><td>Sf9 cellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-1711</td><td></td></tr><tr><td>25cm2 celcultuurkolf</td><td>Nunc, Thermo Fisher</td><td>156340</td><td></td></tr><tr><td>Omgekeerd lichtmicroscoop</td><td>WHITED</td><td>WHITED WI-400</td><td></td></tr><tr><td>RBC HIT Competent Cell</td><td>Bioman</td><td>RH618-J80</td><td>Escherichia coli (DH5&alpha;)</td></tr><tr><td>L.B. Broth (Miller)</td><td>Bioman</td><td>LBL407</td><td></td></tr><tr><td>Agar, bacteriologisch graad</td><td>Bioman</td><td>AGR001</td><td></td></tr><tr><td>Zeocin</td><td>Invitrogen</td><td>ant-zn-1</td><td>selectieantibioticum</td></tr><tr><td>PCR Master Mix (2X)</td><td>ThermoFisher</td><td>K0171</td><td></td></tr><tr><td>Geneaid Midi Plasmid Kit (endotoxine vrij)</td><td>Geneaid</td><td>PIE25</td><td></td></tr><tr><td>Actinomycine D</td><td>SIGMA</td><td>A9415</td><td></td></tr><tr><td>Corning 50 mL centrifugebuizen</td><td>SIGMA</td><td>CLS430829-500EA</td><td>50 mL buizen</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Gizmo Supply Co</td><td>B-CNT-SLDE-V2</td><td></td></tr><tr><td>24-Well Multidish</td><td>Nunc, Thermo Fisher</td><td>142475</td><td>24-well plate</td></tr><tr><td>Cellfectin II Reagens</td><td>Thermo Fisher</td><td>10362100</td><td>celtransfectie reagens</td></tr><tr><td>PBS-fosfaat-bufferoplossing (10X) pH 7.4</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9624</td><td></td></tr><tr><td>4&times;SDS-ladingenbeits</td><td>Bioman</td><td>P1001</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon-P (PVDF-blotmembranen)</td><td>Merck Milipore</td><td>IPVH00010</td><td>PVDF-membranen</td></tr><tr><td>Mini Trans-Blot Cell-systeem</td><td>BIO-RED</td><td>1703930</td><td>blotapparaat</td></tr><tr><td>Ponceau S-oplossing</td><td>SIGMA</td><td>6226-79-5</td><td></td></tr><tr><td>Anti-V5</td><td>SIGMA</td><td>V8137</td><td>konijnenanti-V5-antilichaam</td></tr><tr><td>Geitenanti-konijn IgG-paardenradish-peroxidase (HRP)</td><td>Jackson</td><td>111-035-003</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Merck</td><td>817072</td><td></td></tr><tr><td>6-Well Multidish</td><td>Nunc, Thermo Fisher</td><td>145380</td><td></td></tr><tr><td>0,4 % trypanblauw oplossing</td><td>AMRESCO</td><td>K940-100ML</td><td></td></tr><tr><td>P10 pipetman</td><td>Gilson</td><td>F144802</td><td></td></tr><tr><td>P1000 pipetman</td><td>Gilson</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>Tape</td><td>Symbio</td><td>PPS7</td><td>24 well tape ( 19 mm&times;36 M)</td></tr></tbody></table>

voorbijgaande expressie van buitenlandse genen in insect cellen (sf9) voor eiwit functionele assay

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells (sf9) for Protein Functional Assay

Het voorbijgaande gen expressie systeem is een van de belangrijkste technologieën voor het uitvoeren van de functionaalanalyse eiwit in de baculovirus in vitro celcultuur. Dit systeem werd ontwikkeld om de uitdrukkelijke buitenlandse genen onder de controle van de promotor van de baculoviral in voorbijgaande expressie plasmiden. Dit systeem kan bovendien worden toegepast op een functionele test van de baculovirus zelf of vreemde eiwitten. Het meest algemeen en commercieel beschikbare voorbijgaande gen expressie systeem is ontwikkeld op basis van de promotor van de onmiddellijke-vroege gen (IE) van Orgyia pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrovirus (OpMNPV). Echter werd een lage expressie niveau van buitenlandse genen in insect cellen waargenomen. Dus werd een voorbijgaande gen expressie systeem gebouwd om eiwituitdrukking te verbeteren. In dit systeem, werden recombinante plasmiden gebouwd om bevatten de volgorde van de doelgroep onder de controle van de Drosophila warmte schok 70 (Dhsp70) promotor. Dit protocol stelt de toepassing van deze warmte schok gebaseerde pDHsp/V5-Hsi (V5 epitoop met 6 histidine) /Spodoptera frugiperda cel (sf9 cel) systeem; Dit systeem is niet alleen beschikbaar voor de expressie van genen maar ook voor de evaluatie van de activiteiten van de anti-apoptotic van kandidaat-eiwitten in insect cellen. Bovendien, dit systeem ofwel kan zijn transfected met één recombinant plasmide of mede twee potentieel functioneel antagonistische recombinante plasmiden in insect cellen transfected. Het protocol toont de doeltreffendheid van dit systeem en biedt een praktisch voorbeeld van deze techniek.

De volledige lengte en andere twee opschoningen (BIR en RING domeinen) van Ly-IAP3 van LyxyMNPV werden overexpressie in sf9 cellen, op basis van de warmte schok gebaseerde pDHsp/V5-Hsi /Spodoptera frugiperda cel (sf9 cel) systeem. De pDHsp/V5-Hsi bevatte een Drosophila warmte schok eiwit promotor, die downstream genexpressie bij een temperatuur van 42 ° C aandoening rijdt met behulp van cellulaire transcriptionele factoren en de vertaling systeem (Fi...

Dit protocol beschrijft een warmte schok-geïnduceerde proteïne expressie systeem (pDHsp/V5-zijne/sf9 cel), die kan worden gebruikt voor het uitdrukken van vreemde proteïnen of evaluatie van de anti-apoptotic activiteit van potentiële buitenlandse eiwitten en hun afgeknotte amino zuren in insect cellen.

Voorbijgaande expressie van buitenlandse genen in Insect cellen (sf9) voor eiwit functionele Assay

The transient gene expression system is one of the most important technologies for performing protein functional analysis in the baculovirus in vitro cell ...

Het algemene doel van dit door warmteschok geïnduceerde eiwitexpressiesysteem is om de anti-apoptotische activiteit van eiwitten te evalueren in twee potentieel functioneel antagonistische eiwitten in insectencellen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over de functies en activiteiten van kandidaat-eiwitten in biotechnologie en proteomics, zoals hun anti-apoptotische activiteiten en eiwitinteracties. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het tijdstip van genexpressie wordt gecontroleerd door warmteschokinductie.Dus deze methode kan inzicht geven in de functionele status van eiwitten. Het kan ook worden toegepast op andere systemen, zoals eiwitexpressie bij zoogdieren. De Spodoptera frugiperda, of Sf9, insectencellen die in dit protocol worden gebruikt, worden gekweekt in celcultuurmedium in 25 vierkante centimeter celcultuurkolven bij 28 graden Celsius.Schud de celcultuurkolf om de cellen los te maken van de kolf. Controleer vervolgens onder een lichtmicroscoop om er zeker van te zijn dat ongeveer 80%van de cellen los is. Breng 50%van de celsuspensie over naar een nieuwe 25 vierkante centimeter celcultuurkolf en laat de cellen 15 minute

transient-expression-foreign-genes-insect-cells-sf9-for-protein

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Methoden voor het gebruik van Alphavirus transducing systemen om TL-verslaggevers uit te drukken in vitro en in volwassen muggen worden beschreven. Deze techniek kan worden aangepast aan een eiwit van belang uit te drukken in plaats van of naast een verslaggever.

Alphavirus Transducing System: Tools voor het visualiseren van besmetting in Mosquito Vector

Hier beschrijven we een manier om correct gevouwen en functionele oppervlak influenzavirus-antigenen afgeleid van de nieuwe Chinese H7N9 virus in insectencellen uiten. De techniek kan worden aangepast aan ectodomeinen van elke virale of cellulaire oppervlakte-eiwitten tot expressie.

Expressie van Functionele Recombinant Hemagglutinine en neuraminidase Eiwitten uit de roman H7N9 Influenza Virus Met de baculovirusexpressiesysteem

De expressie van recombinante eiwitten door zoogdiersystemen wordt een aantrekkelijke methode voor het produceren van eiwitcomplexen voor structurele biologie. Hier presenteren we een eenvoudig maar zeer efficiënt expressiesysteem dat gebruik maakt van in suspensie gekweekte zoogdiercellen om eiwitcomplexen te zuiveren voor structurele studies.

Recombinante eiwitexpressie voor Structurele Biologie in HEK 293F Suspension cellen: een nieuwe en toegankelijke aanpak

In deze studie werd de expressie van een doelgerichte humane recombinante eiwit in verschillende productieplatforms vergeleken. We concentreerden ons op traditionele fermentor-gebaseerde culturen en op planten, waarbij we de instelling van elk systeem beschreven en, op basis van de gerapporteerde resultaten, de inherente grenzen en voordelen voor elk platform benadrukten.

Een vergelijkende analyse van recombinant eiwit expressie in verschillende biofactories: Bacteriën, Insect Cells and Plant Systems

De productie op laboratoriumschaal van eukaryote eiwitten met passende post-translationele modificatie vormt een belangrijke barrière. Hier is een robuust protocol met snelle implementatie en doorlooptijd voor eiwitexpressie met behulp van een zoogdier-expressiesysteem. Dit systeem ondersteunt selectieve aminozuren, selectieve markering van eiwitten en kleine moleculaire modulatoren van glyconsamenstelling.

High Yield Expressie van recombinante humane eiwitten met de Transient Transfectie van HEK293 cellen in suspensie

Het bestuderen van ionkanalen via een heteroloog tot expressie brengen systeem is uitgegroeid tot een kern techniek in het biomedisch onderzoek. In dit manuscript presenteren we een tijd efficiënte methode om strak ionkanaal expressie te komen door het uitvoeren transiënte transfectie onder controle van een induceerbare promoter.

Controleerbaar Ion Channel Expression door middel Induceerbare tijdelijke transfectie

Nonlytic insectencel expressiesystemen onderbenut productie, cellulair transport / lokalisatie en recombinante eiwitten functionele analyse. We beschrijven werkwijzen voor expressievectoren en transiënte daaropvolgende eiwitexpressie genereren handel verkrijgbaar Lepidoptera cellijnen. De co-localisatie van Bemisia tabaci aquaporins met fluorescente subcellulaire markereiwitten wordt gepresenteerd.

Transiënte expressie en cellulaire lokalisatie van recombinante eiwitten in gekweekte insectencellen

Hier presenteren we een protocol om te produceren huis vliegen carboxylesterase eiwitten in vitro met een baculovirus gemedieerde insect cel expressie systeem en later functioneel karakteriseren van hun rollen in metaboliseringssysteem permethrin, daarmee overdracht van pyrethroïde weerstand door het uitvoeren van cel-gebaseerde MTT assay en in vitro metabole studies.

Functionele karakterisering van Carboxylesterases in Insecticide resistente huis vliegt, Musca Domestica

Hier presenteren we de protocollen voor het gebruik van het insect cel en baculovirus eiwit expressie systeem voor de productie van grote hoeveelheden uitgescheiden eiwithoudende gewassen voor eiwit kristallisatie. Een vector baculovirus expressie is gewijzigd met GP67 of insect hemolin signaal peptide voor plant secretie eiwituitdrukking in insect cellen.

Wijzigen Baculovirus expressievectoren voor de productie van plantaardige eiwitten in Insect cellen uitgescheiden

Het baculovirus expressie vectorsysteem (BEVS) is een robuust platform voor expressiescreening en productie van eiwit arginine methyltransferases (PRMT's) voor biochemische, biofysische en structurele studies. Milligram hoeveelheden materiaal kunnen worden geproduceerd voor de meerderheid van PRMT's en andere eiwitten van belang die een eukaryotische expressie platform vereisen.

Productie van recombinante PRMT-eiwitten met behulp van het Baculovirus Expression Vector System

Succesvolle kiembaantransformatie in de herfstlegerworm, Spodoptera frugiperda, werd bereikt met behulp van mRNA van hyperactief piggyBac transposase.

Hyperactief biggeBac Transposase-gemedieerde kiembaantransformatie in de herfst Legerworm, Spodoptera frugiperda

Leer een warmteschok-geïnduceerd eiwitexpressiesysteem om anti-apoptotische activiteit te evalueren in Sf9-insectcellen. Deze methode biedt gecontroleerde genexpressie voor biotechnologisch onderzoek.

Voorbijgaande expressie van buitenlandse genen in Insect cellen (sf9) voor eiwit functionele Assay

Meer video's verkennen