Voorbijgaande expressie van buitenlandse genen in Insect cellen (sf9) voor eiwit functionele Assay
22 februari 2018
Dit protocol beschrijft een warmte schok-geïnduceerde proteïne expressie systeem (pDHsp/V5-zijne/sf9 cel), die kan worden gebruikt voor het uitdrukken van vreemde proteïnen of evaluatie van de anti-apoptotic activiteit van potentiële buitenlandse eiwitten en hun afgeknotte amino zuren in insect cellen.
Het algemene doel van dit door warmteschok geïnduceerde eiwitexpressiesysteem is om de anti-apoptotische activiteit van eiwitten te evalueren in twee potentieel functioneel antagonistische eiwitten in insectencellen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over de functies en activiteiten van kandidaat-eiwitten in biotechnologie en proteomics, zoals hun anti-apoptotische activiteiten en eiwitinteracties. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het tijdstip van genexpressie wordt gecontroleerd door warmteschokinductie.
Dus deze methode kan inzicht geven in de functionele status van eiwitten. Het kan ook worden toegepast op andere systemen, zoals eiwitexpressie bij zoogdieren. De Spodoptera frugiperda, of Sf9, insectencellen die in dit protocol worden gebruikt, worden gekweekt in celcultuurmedium in 25 vierkante centimeter celcultuurkolven bij 28 graden Celsius.
Schud de celcultuurkolf om de cellen los te maken van de kolf. Controleer vervolgens onder een lichtmicroscoop om er zeker van te zijn dat ongeveer 80%van de cellen los is. Breng 50%van de celsuspensie over naar een nieuwe 25 vierkante centimeter celcultuurkolf en laat de cellen 15 minuten bij kamertemperatuur hechten.
Na 15 minuten, vervang het medium met vijf milliliter vers kweekmedium en kweek in een incubator bij 28 graden Celsius. Afhankelijk van de celgroei, passeer de cellen elke twee tot drie dagen. Voordat de Sf9-cellen worden geoogst, is het belangrijk om de cellen onder de lichtmicroscoop te controleren om er zeker van te zijn dat er geen besmetting is door bacteriën of andere micro-organismen.
Om de Sf9-cellen te oogsten, schud de kweekkolf om de cellen los te maken en breng vervolgens de celsuspensie over naar een 15-milliliter buis. Gebruik een P10 pipette en breng 10 microliter van de celsuspensie over naar een hemacytometer en tel het aantal cellen onder de lichtmicroscoop. Plateer drie keer 10 tot de vijfde cellen in elk putje van een 24-well plate en laat het 15 minuten bij kamertemperatuur staan.
Na 15 minuten, vervang het medium met 0,5 milliliter plateermedium. Bereid het celtransfectiereagens voor. Voor elke transfectie, verdun acht microliter celtransfectiereagens met 100 microliter serumvrij celkweekmedium en vortex gedurende één seconde om te mengen.
In deze studie zullen drie verschillende verkortingen van het baculovirusgen, remmer van apoptose 3, of IAP3, worden geëxpresseerd onder de controle van de Drosophila warmteschok 70 promotor, het volledige IAP3, een verkorting zonder de RING-domein en een verkorting zonder de BIR-domein. Voeg twee microgram van elk plasmide-DNA toe aan 100 microliter serumvrij celkweekmedium en meng door kort te vortexen. Bereid ook een positieve controle voor.
Combineer het verdunde plasmide-DNA en het verdunde celtransfectiereagens, en meng door te vortexen. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Gebruik een P1000 pipette om 210 microliter van elk DNA transfectiereagensmengsel druppelsgewijs op de cellen toe te voegen.
Incubeer bij 28 graden Celsius gedurende vijf uur. Na vijf uur, vervang het plateermedium met 0,5 milliliter celkweekmedium en sluit vervolgens de 24-well plate af met tape. Incubeer bij 28 graden.
De volgende dag, schok de celplaat met warmte om eiwitexpressie te induceren door de plaat 30 minuten in een waterbad van 42 graden Celsius te laten drijven. Na 30 minuten, zet de 24-well plate terug in de 28 graden Celsius incubator. Eiwitexpressie wordt vervolgens bevestigd door Western blot zoals beschreven in het tekstprotocol.
Om gen-geïnduceerde celapoptose te onderzoeken, bereid eerst Sf9-cellen zoals eerder aangetoond. Transfecteer vervolgens de cellen op dezelfde manier als eerder, maar voeg één microgram van een plasmide met een apoptose-inducerende gen in elke transfectiereactie toe. Incubeer gedurende vijf uur bij 28 graden Celsius, vervang het medium en incubeer gedurende 16 uur.
Schok de getransfecteerde cellen met warmte bij 42 graden Celsius gedurende 30 minuten. Incubeer de cellen gedurende vijf uur bij 28 graden Celsius voordat u de celassay voor levensvatbaarheid uitvoert. Voor chemisch-geïnduceerde celapoptose, plateer een keer 10 tot de zesde Sf9-cellen in elk putje van een zes-well plate.
Laat het bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten staan en vervang vervolgens het medium met één milliliter plateermedium. Transfecteer de cellen met vier microgram van elk plasmide-DNA. Na vijf uur, vervang het plateermedium met één milliliter celkweekmedium en incubeer de cellen gedurende 16 uur bij 28 graden Celsius.
Schok vervolgens met warmte bij 42 graden Celsius gedurende 30 minuten. Incubeer de cellen gedurende vijf uur na warmteschok bij 28 graden Celsius. Behandel vervolgens de getransfecteerde cellen met actinomycine D om apoptose te induceren.
Incubeer gedurende 16 uur bij 28 graden Celsius voordat u de celassay voor levensvatbaarheid uitvoert. Begin deze procedure door de behandelde cellen te wassen. Verwijder het medium uit elk putje, voeg één milliliter PBS toe en laat het een minuut staan.
Was de cellen op deze manier drie keer met PBS. Resuspendeer de cellen in elk putje met één milliliter PBS bevattend 04%trypan blue en kleur op kamertemperatuur gedurende drie minuten. Breng de celsuspensie over in een 1,5 milliliter microfugebuis.
Breng 10 microliter van de met trypan blue gekleurde celsuspensie over naar een hemacytometer en tel de levensvatbare intacte cellen onder een lichtmicroscoop. Voer tenslotte statistische analyse uit zoals beschreven in het tekstprotocol. De volledige lengte en twee verkortingen van IAP3 van Lymantria xylina MNPV werden overgeexprimeerd in Sf9-cellen en Western blot werd uitgevoerd op cellysaten om eiwitexpressie te bevestigen.
Het anti-apoptotische eiwit Ac-P35 werd opgenomen als positieve controle. Alle eiwitten konden worden gedetecteerd in getransfecteerde cellen bij één uur of
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een hitte-shock-geïnduceerd eiwitexpressiesysteem (pDHsp/V5-His/sf9-cel-systeem) dat wordt gebruikt voor het evalueren van de anti-apoptotische activiteit van vreemde eiwitten in insectencellen. De methode maakt een gecontroleerde timing van genexpressie mogelijk via hitte-shock-inductie.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Biotechnologie
- Proteomics
- Celbiologie
Achtergrond
- Eiwitexpressiesystemen geïnduceerd door hittestress zijn waardevol voor het bestuderen van eiwitfuncties.
- Insectencellen, zoals Sf9, worden veelvuldig gebruikt voor eiwitexpressie.
- Deze methode kan ook worden aangepast voor eiwitexpressie in zoogdiercellen.
- Inzicht in anti-apoptotische activiteiten is essentieel voor diverse toepassingen in het onderzoek.
Doel van de studie
- Om de anti-apoptotische activiteit van kandidaateiwitten te evalueren.
- Om eiwitinteracties in een gecontroleerde omgeving te onderzoeken.
- Om inzicht te verschaffen in de functionele status van eiwitten.
Gebruikte methoden
- Hitte-shock-inductie voor controle van genexpressie.
- Gebruik van Sf9-insectencellen gekweekt in celkweekmedium.
- Evaluatie van vreemde eiwitten en hun getrunceerde aminozuren.
- Analyse van eiwitinteracties en -activiteiten.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle expressie van vreemde eiwitten in insectencellen.
- Aangetoonde anti-apoptotische activiteiten van kandidaateiwitten.
- Er zijn inzichten verkregen in de functionele status van de eiwitten.
- Potentiële toepassingen in de biotechnologie en proteomica werden belicht.
Conclusies
- Het hitte-shock-geïnduceerde eiwitexpressiesysteem is effectief voor het bestuderen van eiwitfuncties.
- Deze methode biedt een gecontroleerde aanpak om eiwitactiviteiten te evalueren.
- Verdere toepassingen in andere expressiesystemen zijn mogelijk.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Dit hitte-shock-induceerbare expressiesysteem maakt een gecontroleerde temporele expressie van vreemde eiwitten in insectencellen mogelijk, wat functionele assays voor anti-apoptotische activiteit ondersteunt. Het biedt een reproduceerbaar platform voor het evalueren van eiwitfuncties in een ziekte-relevant systeem, wat bijdraagt aan target-validatie en mechanistishe risicoreductie in de vroege ontdekkingsfase. De aanpasbaarheid van het systeem voor co-transfectie van antagonistische eiwitten maakt het mogelijk om eiwitinteracties te onderzoeken, wat het voorspellende vertrouwen bij de identificatie van lead-verbindingen vergroot.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt functionele analyse van kandidaate eiwitten mogelijk door gecontroleerde expressie van volledige en getrunceerde varianten.
- Operationele waarde: Ondersteunt de beoordeling van anti-apoptotische activiteit met behulp van apoptose-inductoren zoals Drosophila Reaper of chemische agentia zoals actinomycine D.
- Strategische waarde: Faciliteert de vergelijking van eiwitvarianten om structuur-functie-relaties te verduidelijken en targets met de gewenste functionele profielen te prioriteren.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve proteinexpressiegegevens, bevestigd via Western blot op gedefinieerde tijdstippen na inductie.
- Operationele waarde: Standaardiseert transfectie- en heatshock-protocollen voor zowel 24-wells als zes-wells plaatformaten voor een consistente assay-prestatie.
- Strategische waarde: Maakt schaalbare evaluatie van proteinvarianten onder identieke condities mogelijk, wat de hit-to-lead progressie in proteomics-workflows ondersteunt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Maakt gebruik van Sf9-cellen als een ziekterelevant systeem om apoptotische pathways te modelleren en proteïne-gemedieerde celoverleving te beoordelen.
- Operationele waarde: Levert levensvatbare celtellingen via trypaanblauw-uitsluiting, wat een functionele readout biedt voor anti-apoptotische effectiviteit.
- Strategische waarde: Ondersteunt risico-gecorrigeerde voortgang door moleculaire activiteit te koppelen aan het cellulaire fenotype in een reproduceerbaar insectencelmodel.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen de fase van vroege ontdekking tot lead-identificatie, waarbij functionele validatie van de eiwitactiviteit bijdraagt aan de selectie van targets en de assay-bereidheid voor downstream screening.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothese-testen door eiwitvarianten tot expressie te brengen om de anti-apoptotische functie en het interactiepotentieel te evalueren.
- Screening: Biedt reproduceerbare transfectie- en inductieworkflows die compatibel zijn met multi-well plate-formaten voor functionele screening met een medium doorvoersnelheid.
- Analytics: Levert Western blot-bevestiging van expressie en viabiliteitsassays om eiwitactiviteit en cellulaire uitkomsten te kwantificeren.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt moleculaire functie met fenotypische output in insectencellen, wat bijdraagt aan het mechanistische begrip van de apoptotische regulatie.
- Bedrijfsbrede Hergebruik: Vestigt een herbruikbaar platform voor het evalueren van diverse eiwitkandidaten in projecten binnen de biotechnologie en proteomica.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Maakt mechanisch risicobeheer mogelijk door eiwitdomeinen (bijv. RING, BIR) via truncatieanalyse te koppelen aan anti-apoptotische activiteit.
- Operationele waarde: Biedt gestandaardiseerde protocollen voor celkweek, transfectie, hitte-shock-inductie en levensvatbaarheidsbeoordeling.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door functionele gegevens over eiwitvarianten te verschaffen vóór arbeidsintensieve validatie.
- Impact op portfolio: Ondersteunt de prioritering van kandidaten met aangetoonde activiteit in een gecontroleerd, induceerbaar expressiesysteem.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in insectencultuur, transfectietechnieken en protocollen voor hittechock-inductie.
- Afhankelijk van toegang tot incubators of waterbaden van 28°C en 42°C voor temperatuurgecontroleerde expressie.
- Vereist gestandaardiseerde bereiding en menging van reagentia om een consistente transfectie-efficiëntie tussen de wells te waarborgen.
- Vereist aanpassing van het plasmide-ontwerp en de selectie van de promoter op basis van het doeleiwit en de expressiedoelen.
- Beperkt door de noodzaak van biosafety-voorzorgsmaatregelen bij het werken met gevaarlijke stoffen zoals actinomycine D.
