Name: Percutane Contrast echocardiografie geleide Intramyocardial injectie en cel levering in een grote preklinische Model (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 24 s
Description: Leer een percutane contrast echocardiografie-geleide intramyocardiale injectietechniek in konijnen voor cardiale regeneratieve geneeskunde. Deze methode maakt veilige en nauwkeurige levering van therapeutische middelen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs bedanken Sheila Monfort, Brenda Martínez, Carlos Micó, Alberto Muñoz en Manuel Molina voor uitstekende ondersteuning geboden bij het verzamelen van gegevens en Carlos Bueno voor het verstrekken van de EGFP(+) HEK-293-cellen. Dit werk werd gedeeltelijk door ondersteund: Fundación Séneca, Agencia de Ciencia y Tecnología, Región de Murcia, Spanje (JT) (verlenen van nummer: 11935/PI/09); Red de Terapia Celular, ISCIII-Sub. Gral. Redes, VI PN de ik + D + ik 2008-2011 (verlenen neen. RD12/0019/0001) (JMM), mede gefinancierd met de structuurfondsen van de Europese Unie (EFRO) (JMM); en, de Universiteit van Reading, Verenigd Koninkrijk (AG, GB) (centrale financiering). De financiers had geen rol in de studie ontwerp, gegevensverzameling en analyse, besloten tot bekendmaking of voorbereiding van het manuscript.

De experimenten die hierin worden beschreven werden goedgekeurd door de ethische commissie van het onderzoek van de Universiteit van Murcia, Spanje, en werden uitgevoerd overeenkomstig richtlijn 2010/63/EG van de EuropeseCommissie. De stappen die beschreven werden uitgevoerd onder operationele standaardprotocollen die deel uitmaakten van het werkplan en niet uitsluitend met het oog op het filmen van de begeleidende video op dit papier zijn uitgevoerd.
1. bereiding van de cellen en zoogdieren expressie Vector
Opmerking: Hier, kort beschrijven we een protocol voor de voorbereiding en de transfectie van een cellijn (menselijke embryonale nier 293 (HEK-293)); specifieke protocollen van de juiste cel voor het celtype van belang moet echter geoptimaliseerde (bijvoorbeeldstamcellen).
<ol><li>Handhaven HEK-293 cellen in hoge glucose Dulbecco gewijzigd van Eagle's medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal kalfsserum (FCS), 1% natrium pyruvaat, 2 mM Glutamine, penicilline/streptomycine 1%, en geïncubeerd bij 37 ° C in een bevochtigde sfeer met 5% CO2 . Zodra de cellen zijn sub confluente, gesplitst in een verhouding van 1:3.</li>
	<li>Start de cellen splitsen door aspirating van de media, dan wassen eenmaal met steriele fosfaat zoutoplossing (PBS gebufferde), verwijderen van overtollige PBS en vervolgens met 2,5 mL 0,5 x trypsine-ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) (5 min, 37 ° C) incuberen.<ol>
<li>Toevoegen van een volume van DMEM media (aangevuld zoals hierboven beschreven) zet de reactie stop, en vervolgens het loskoppelen van de cellen door langzaam en zachtjes zuigen op en neer met een elektronische pipet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Breng de celsuspensie naar een passende container (bijvoorbeeld, 15-50 mL conische centrifugebuis). Centrifugeer in een schommel emmer (100 x g), verwijder het supernatant en wassen van de pellet tweemaal met steriel PBS.</li>
	<li>Resuspendeer de pellet in verse DMEM media en zaad bij een dichtheid van de gewenste cel (bijvoorbeeld, 1 x 106 cellen in een maatkolf van 75 cm2 ) in verse cultuur kolven of grote gerechten volgens lokale laboratoriumpraktijken.<ol>
<li>Vervang bestaande media met verse media om de 2 dagen. Opmerking: De expressie vector was afgeleid van pIRES1hyg en gebruikt volgens de instructies van de fabrikant als eerder beschreven21. p(EGFP) IRES1hyg werd gegenereerd door het subcloning EGFP cDNA zoals een BamHI + kennisgevingen van pEGFP-N1 in de BamHI invoegen + kennisgevingen verteerd pIRES1hyg21.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1 dag vóór de transfectie, cellen zaad HEK-293 bij een dichtheid van 0,5 x 105 cellen/cm2 in 12 - of 24-well weefselkweek platen.</li>
	<li>Bereiden op de dag van de transfectie, DNA-lipide transfectie reagens complexen in aparte 1,5 mL microcentrifuge buizen (1 buis per putje).<ol>
<li>Beginnen met het toevoegen van 250 µL van verminderde serum medium in elk buisje en voeg vervolgens 4 µg DNA (meng zachtjes).</li>
		<li>Daarna, voeg 250 µL van een eerder bereid mix van 10 µL lipide transfectiereagens en 250 µL van verminderde serum medium, aan elke buis (weer voorzichtig mengen).</li>
		<li>Ten slotte gaan met transfections, door het HEK-293 cellen met DNA lipide transfectie reagens complexen voor 4 uur, aan het broeden vervangen met DMEM medium aangevuld zoals hierboven (stap 1.1) beschreven en incubeer gedurende een ander 48 h. uitvoeren drug selectie van stal transfectants met 100 µg/mL hygromycin B.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Loskoppelen van HEK-293 cellen met trypsine zoals hierboven (stap 1.2) beschreven. Na het wassen van de cellen in steriele PBS, resuspendeer in een geschikt vehiculum (bijvoorbeeld10% v/v in PBS InI), tot een concentratie van de laatste cel van 5 x 106/mL.</li>
</ol>2. voorbereiding van het konijn
Opmerking: De plaatsing van het konijn en de transducer voor IMI is niet optimaal morfologie en functie van het hart van het dier te evalueren. Het is dus aan te raden om een volledig echocardiographic onderzoek20 vóór de IMI (zie hieronder), en op latere tijdstippen uit te voeren, zoals gedefinieerd door de proefopzet. Dit zal streven naar het evalueren van de basislijn anatomische en functionele kenmerken van het hart in het dier die worden ontvangen van een injectie en ook het evalueren van de effecten van IMI in de functie van het hart.
<ol><li>Het uitvoeren van dit onderzoek in een geblindeerde mode en naar aanleiding van de richtsnoeren van de Commissie van de echocardiografie van de American College of Veterinary interne geneeskunde en de Amerikaanse maatschappij van echocardiografie/Europese vereniging voor cardiovasculaire Imaging 22 , 23 , 24.</li>
	<li>Het verkrijgen van de tracering van een gelijktijdige 1-voorsprong elektrocardiogram (ECG) gedurende de gehele echocardiographic studie.</li>
	<li>Het konijn met ketamine anesthetize 10 mg/kg, gecombineerd met medetomidine 200 µg/kg, intramusculaire injectie (I.M.).</li>
	<li>Controleer of het niveau van de narcose na 10-20 minuten na toediening van de verdoving.</li>
	<li>De haren van de borst breed met behulp van een haartrimmer verwijderen (bijvoorbeeldonder de hals naar de sub xiphoid regio) (figuur 1A).</li>
	<li>Scheren van extra gebieden voor 1-2 cm2 in het binnenvlak van de rechter voorpoot (mediocubital regio) en beide hind ledematen (mediotibial regio) (figuur 1B).</li>
	<li>Zelfklevende elektroden van de ECG op de geschoren gebieden van de ledematen synchroon volgen het hartritme tijdens de procedure (Figuur 1 c) plaatsen.</li>
	<li>Plaats het dier in de liggende positie van de decubitus op een thermische deken, met de benen gestrekt met behulp van chirurgische tape gekoppeld aan de tabel (Figuur 1 c).<ol>
<li>Zorg ervoor dat de oren naar achteren zijn gebogen achter de hoofd/rug van het konijn, en op een positie die lager is dan de voorpoten, omdat dit helpt bij het handhaven van de juiste positionering van de thorax van het dier tijdens de gehele procedure.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Laat het dier te ademen spontaan terwijl beheren van zuurstof door gezichtsmasker gedurende de hele procedure (100%, 2-3 L/min).</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56699/56699fig1.jpg"> Figuur 1. Voorbereiding van het konijn voor IMI. (A) Clip van haar van de thorax; (B) knippen haar van ledematen; (C) Bevestig elektroden en de positie van het konijn met benen gestrekt op een thermische deken. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56699/56699fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
3. percutane Contrast echocardiografie geleide IMI techniek in het konijn
<ol><li>Reinig en Desinfecteer de huid van de borstkas met een oplossing op basis van chloorhexidine.<ol>
<li>Gebruik een aseptische techniek gedurende de hele procedure, overeenkomstig de huidige beste praktijken.</li>
		<li>Waar mogelijk, en als redelijkerwijs mogelijk is, een volledig steriel procedure, met inbegrip van, maar niet beperkt tot, het gebruik van steriel materiaal zoals jassen, handschoenen, chirurgische wond gordijnen, steriele omhoog het kleden van materiaal voor de tabel, evenals een steriele echografie uitvoeren transducer dekking en steriele ultrageluid-gel. Dit zal verminderen tot een minimum te beperken het risico dat ziekteverwekkers aan het dier IMI ontvangen, en is gebruikelijk in de klinische setting (b.v.tijdens cardiale punctie). Opmerking: Het wordt aanbevolen om altijd in overeenstemming met de lokale en nationale regelgeving van dierlijk onderzoek voor de lokale instelling en land van de praktijk.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Echografie transmissie gel van toepassing op de borst en/of op de transducer en met de transducer koord om de nek van de experimentator, uitvoeren van een scan van het snelle venster van het hart van het dier, die vaak nuttig voor het visualiseren van anatomie en te plannen voor de IMI.</li>
	<li>De transducer handmatig plaatsen op de 4th-6th intercostale ruimte, 2-3 cm afstand van de lijn van de juiste parasternal met een invalshoek van ~ 90 ° ten opzichte van de rechterkant van de thoracale muur (figuur 2A).</li>
	<li>Pas de locatie van de transducer ten opzichte van de intercostale ruimte zowel als zijn anteroposterior en dorsoventral hoek te optimaliseren van een gemodificeerde korte axis Bekijk op het niveau van de papillaire spieren. Identificeren in deze weergave de rechterventrikel (RV), linker ventrikel (LV), hart septum (IVS), achterste muur (PW), evenals anterolateral (AL) en posteromedial (PM) papillaire spieren (figuur 2B).<ol>
<li>Hebben een breed gezichtsveld door de diepte met behulp van het desbetreffende besturingselement op het systeem (bijvoorbeeld, knop, dial) aanzienlijk te verhogen.</li>
		<li>Bijzondere aandacht besteden aan het verkrijgen van een symmetrische afbeelding in deze weergave, evenals de juiste differentiatie van endocardial en epicardial contouren en, indien nodig, aanpassen door besturingselementen voor afbeelding optimalisatie (bijvoorbeeldwinst).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zodra de optimale echocardiographic weergave is verkregen (figuur 2B), behouden deze positie in de rest van de procedure, terwijl een tweede exploitant de IMI (zie hieronder voert).<ol>
<li>Terwijl het houden van de transducer, Vermijd verhullen de transducer oriëntatie mark, die moet altijd worden naar voren, waardoor de uitlijning met de naald in opeenvolgende stappen (figuur 2A, C).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Plaats de naald dicht bij de huid van de linker hemithorax in een symmetrische mirroring positie ten opzichte van de transducer met een 24-G naald gekoppeld aan een spuit van 1 mL. Vervolgens handmatig uitlijnen de naald met de transducer oriëntatie mark onder een hoek van ~ 90° (figuur 2C), en langzaam verder de naald door de huid en in de borstholte. Opmerking: De plaatsingskosten percutane naald in deze positie en oriëntatie vergemakkelijkt de visualisatie van de naald in het vlak van de lichtbundel van de echografie (figuur 2D, E), waardoor real-time monitoring en, zo nodig, aanpassing van de locatie van de naald ten opzichte van de regio van de doelstelling van het myocardium (Figuur 2 G, H).</li>
	<li>Met het puntje op de doelvestiging, langzaam leveren de injectate (maximaal 0,25 mL per injectieplaats) binnen 10-30 s (figuur 2E), terwijl langzaam en voorzichtig de naald intrekken tijdens de injectie te vergroten van de omvang van het myocardium behandeld.<ol>
<li>Gebruik van InI 10% (v/v) verdund in PBS voor normalisatie van de techniek, en als een tracer in situ terwijl het verwerven van competentie, evenals over het bevestigen van de succesvolle targeting van alle vier IMI sites binnen het myocardium door bruto pathologie en histopathologisch onderzoek (Zie Vertegenwoordiger resultaten). Zodra competentie is bereikt, kon InI worden vervangen door een geschikte commerciële echografie contrast agent indien gewenst. Opmerking: Levering van 10% (v/v) InI verdund in PBS met of zonder cellen in de resultaten van het myocard in Transmurale hyperechogenicity (d.w.z., heldere weergave van de echo) op de doelsite van injectie (figuur 2E, F). Voorbijgaande vertraging of een versnelling van de hartslag, gekoppeld aan voortijdige ventriculaire contracties (b.v., geïsoleerd, coupletten en drieling) worden vaak waargenomen zelfs vanaf het eerste contact van de naald met de Epicard, evenals tijdens en/of kort na de IMI. Echter geen levensbedreigende ritmestoornissen zijn ontwikkeld, en acute bijwerkingen zijn zelden waargenomen met behulp van maximaal 0,25 mL (1.25 x 106 cellen) van injectate per IMI injectieplaats (Zie Vertegenwoordiger resultaten en discussie).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Subtiele veranderingen in de invalshoek van de naald zonodig te voltooien injecties van 0,25 mL aan elk van de vier doelstelling IMI sites (drie in de linker ventriculaire vrije muur (LVFW) en één in het IVS) uitvoeren.</li>
	<li>Na het voltooien van de percutane contrast echocardiografie geleide IMI procedure gaat evalueren (bijvoorbeelddoor middel van seriële ECG traceren en/of 24-uurs Holter-ECG) hartritme en seriële venster echocardiographic scans om te controleren of het ontbreken van uitvoeren complicaties, totdat het dier is volledig hersteld van de verdoving, en alleen dan overdracht naar een lichte cyclus kamer.<ol>
<li>Hier, gebruiken we 24-uurs Holter-ECG om te controleren van de effecten van IMI met InI op hartritme gedurende 24 uur. Voor dit vergeleken we een groep van 6 konijnen met normale fenotype (normale groep) en een groep van 6 konijnen waarvoor intraveneuze toediening van Doxorubicine (een cardiotoxische anthracycline drug, meestal gebruikt voor de behandeling van kanker; DOX groep) bij een dosis van 2 mg/kg/week voor 8 weken, en vervolgens beide cohorten ontvangen IMI met InI.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56699/56699fig2.jpg"> Figuur 2 . Percutane contrast echocardiografie geleide intramyocardial injectie in het konijn. (A) plaatsing van de transducer in de juiste hemithorax onder een hoek van ~ 90 °. (B) representatieve foto van een parasternal korte as (PSSX) van het hart op het niveau van de papillaire spieren in het konijn. (C) uitlijning van de naald onder een hoek van ~ 90 ° ten opzichte van de transducer oriëntatie mark. (D) de locatie van de naald op de doelsite in een weergave van de PSSX van het hart (merk op dat de naald gemakkelijk is gevisualiseerd in het vlak van de lichtbundel echografie). (E en F) demonstratie van hyperechogenicity op de doelsite op intramyocardial injectie met Oost-Indische inkt (pijlpunten markeren de Transmurale hyperechogenicity). (G) toevallige locatie van de naald in de zaal LV (pijlpunten markeren de schacht van de naald). (H) Repositioning van de naald tegen de vrije muur van LV (pijlpunten markeren de schacht van de naald). RV = rechterventrikel; LV = linkerventrikel; IVS = hart septum; PW = achterste muur; AL = anterolateral papillaire spier; PM = posteromedial papillaire spier. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56699/56699fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
4. post IMI Analyses
<ol><li>Histopathologische analyses van hart weefselmonsters van konijnen uit te voeren.<ol>
<li>Weefsel gedurende 24 uur in 10% formaldehyde, gevolgd door uitdroging met toenemende ethanol concentraties als volgt corrigeren: • 1 x in 70% (60 min) • 1 x in 95% ethanol/5% methanol (60 min) • 1 x in 100% (60 min) • 1 x in 100% (90 min) • 1 x in 100% (120 min) Opmerking: Alle van de bovenstaande incubations worden uitgevoerd bij kamertemperatuur (RT). Vervolgens substituut tweemaal met 100% xyleen (1 h, RT), en ten slotte inbedden in paraffine in twee stappen (60 min, 58 ° C)25.</li>
		<li>4-5 µm weefselsecties met een microtoom25uitvoeren. Secties op dia's koppelen.</li>
		<li>Uitvoeren van kleuring met Haematoxyline-eosine en Masson van trichrome methoden25,26,27.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voer in weefselsecties van getransplanteerde harten, immunohistochemistry te sporen EGFP(+) HEK-293 cellen (bijvoorbeeldmet behulp van de avidin-Biotine complexe (ABC) methode), kort:<ol>
<li>-Was 4-5 µm dik hart secties in 100% xyleen (10 min, bij RT). Hydrateren van weefsel door te wassen met afnemende ethanol concentratie oplossingen (2 x in 100% (2 min) 2 x 95% (2 min) 1 x in 70% (2 min), 1 x in 50% (2 min); 1 x in de 30% (2 min); 1 x ddH2O (2 min)) op RT.</li>
		<li>Remming van endogene peroxidase uitvoeren die betrekking hebben op de secties met 100 µL van 3% H2O2 verdund in methanol (bereid met 5 mL van de stockoplossing 30% H2O2en toevoegen methanol omhoog tot een totaal volume van 50 mL)) Incubeer 30 min, RT), en vervolgens wassen door onderdompeling met Tris gebufferde zoutoplossing (TBS; pH 7,6).</li>
		<li>Uitvoeren van antigeen ontmaskering via enzymatische behandeling, door het bestuderen van de secties met 100 µL van 0,1% Pronase (bereid met 0,01 g Pronase verdund in 10 mL TBS) (Incubeer 12 min, RT), daarna wassen met TBS (5 min, RT).</li>
		<li>Incubeer in het blokkeren van de oplossing (normale geit serum 10% in TBS) met behulp van 100 µL per dia (30 min, RT), en wassen met TBS (5 min, RT).</li>
		<li>Incubeer met kip anti-groen TL proteïne (GFP) als primair antilichaam (1:500 in TBS) (1 h, 30 ° C), en wassen met TBS (5 min, RT).</li>
		<li>Incubeer met secundair antilichaam biotinyleerd geit-anti-kip IgG (1:250 in TBS) (1 h, 30 ° C), en daarna wassen met TBS (5 min, RT).</li>
		<li>Incubeer met avidin-Biotine complex (20 min, 30 ° C) en vervolgens een label met behulp van 3,30-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) (RT, 5-10 min).</li>
		<li>Ten slotte, uitdrogen door wassen in toenemende ethanol concentraties (1 x in de 30% (2 min) 1 x in 50% (2 min) 1 x in 70% (2 min); 2 x 95% (2 min); 2 x in 100% (2 min)) op RT, counterstain secties met behulp van de methode Haematoxyline-eosine25, en dan mount cover dia's. Positieve, negatieve en isotype besturingselementen bevatten. Opmerking: Het korte protocol dat hierboven beschreven is niet bedoeld voor algemene immunohistochemistry gebruik; optimalisatie voor het weefsel van de rente en voorwaarden is noodzakelijk.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het primaire doel was het ontwikkelen van een minimaal invasieve techniek die worden voor de levering van stamcellen in het myocardium van konijnen (een groot formaat preklinische diermodel)17,18, gebruikt kan terwijl profiteren van het gebruik van een relatief goedkoop imaging systeem beschikbaar in veel klinische en onderzoekscentra. Hier laten we zien dat met behulp van een systeem van klinische echocardiografie, en geholpen door InI, een algemeen beschikbare ...

Cel en gen-therapieën zijn spannend en ooit het uitwerken van strategieën voor het regenereren/repareren van de gewonde myocard in HFrEF. Een paar studies vergeleken de effectiviteit (b.v., cel retentie tarief) van de verschillende routes van cel levering, die consequent is gebleken dat de superioriteit van IMI over intracoronary of intraveneuze routes1,2 , 3 , 4 , 5. het is dus niet verwonderlijk dat een groot aantal studies over translationeel modellen van stamcel therapie van de gewonde myocard, leveren de injectate via het IIM uitgevoerd onder directe weergave in een open borst procedure6,7 . Deze benadering heeft echter verschillende beperkingen, met inbegrip van het invasieve karakter van de procedure, die het risico van peri-procedurele sterfte (vaak onder-gerapporteerd)8 draagt. Daarnaast elimineert een IMI onder direct zicht niet de mogelijkheid voor onbedoelde injectie in de ventriculaire holte. In de klinische praktijk kan een IMI tijdens open borst chirurgie een geschikte methode voor therapeutische cel levering, bijvoorbeeld, tijdens de coronaire bypassoperatie graft (CABG); echter, deze aanpak mogelijk niet geschikt is voor de levering van de cel in global cardiomyopathie van niet-ischemische herkomst (b.v.HFrEF ondergeschikt aan anthracycline-geïnduceerde cardiomyopathie (AICM)).
Er is geen twijfel dat de ischemische hartziekte (IHD) is de meest voorkomende oorzaak van HFrEF (~ 66%)9,10; echter niet-ischemische cardiomyopathie, met inbegrip van AICM, geldt nog steeds een aanzienlijk deel van de patiënten met HFrEF (33%)9 . Inderdaad, de recente vooruitgang in klinische oncologie hebben geresulteerd in meer dan 10 miljoen overlevenden van kanker in de VS alleen al11, met schattingen van een vergelijkbaar aantal in Europa, consistent met een algemene trend naar betere overleving van kankerpatiënten12 ,,13. Dus, het verkennen van de voordelen van nieuwe therapieën, zoals stamcel transplantatie voor niet-ischemische cardiomyopathie, evenals de trialing van een doeltreffende en minimaal invasieve route van levering van de cel van de stam is van het allergrootste belang, gezien het toenemende aantal patiënten beïnvloed door cardiotoxicity ondergeschikt aan geneesmiddelen tegen kanker.
Van de nota impliceert hypothese testen studies met stamcel therapie gericht op het herstellen/regenereren de gewonde myocard vaak het gebruik van kleine knaagdieren (b.v., muizen en ratten). Deze modellen vereisen vaak dure hoogfrequente ultrasone systemen voor evaluatie van myocardiale functie, meestal uitgerust met lineaire matrix omvormers hebben sommige inherente bijbehorende beperkingen (bv, galm)14. Andere modellen zoals konijnen, dat een grote preklinische model, echter sommige voordelen voor hypothese testen van stamcellen therapieën in HFrEF. Dus, in tegenstelling tot de ratten en muizen, konijnen houden een Ca+ 2 vervoerssysteem en cellulaire electrofysiologie die lijkt op die van de mens en andere grote dieren (bijvoorbeeld, honden en varkens)15,16,17 ,18,19. Een ander voordeel, is hun inschikkelijkheid voor cardiale echografie beeldvorming met behulp van relatief goedkoop en overal verkrijgbaar klinische echocardiografie systemen uitgerust met relatief hoge frequentie fase matrix omvormers, bijvoorbeeld, 12 MHz, zoals die veelvuldig worden gebruikt bij Neonatale en pediatrische cardiologie. Deze systemen kunnen uitstekende echocardiographic beeldbewerking met state of the art technologie en zij profiteren van de superioriteit van harmonic imaging20. Bovendien uitgebreide hypothese testen van het potentieel van cardiale regeneratieve therapie (b.v., stamcel therapie), hun veiligheid, werkzaamheid, cardiomyogenic potentieel, alsmede evaluatie van het lot van de injectate eenmaal afgeleverd in de myocard, is verplicht, voordat ze voor menselijk gebruik kunnen worden beschouwd, en ze vereisen het gebruik van grote preklinische diermodellen, zoals het konijn17,19. Hier beschrijven we een minimaal invasieve techniek voor cel levering via percutane contrast-echocardiografie begeleide IMI een klinische echocardiografie-systeem, dat is gericht op stamcel transplantatie gebaseerde therapie voor niet-ischemische cardiomyopathie20 . Ook beschrijven we de voordelen van de Oost-Indische inkt (InI, ook bekend als China inkt) als een echografie contrast agent en in situ tracer van de injectate in het hart van het konijn.

<table><tbody><tr><td>HD11 XE Ultrasound System</td><td>Philips</td><td>10670267</td><td>Echocardiografiesysteem.</td></tr><tr><td>S12-4</td><td>Philips</td><td>B01YgG</td><td>4-12 MHz fase-array transducer</td></tr><tr><td>Ultrasound Transmision Gel (Aquasone)</td><td>Parket laboratories Inc</td><td>N 01-08</td><td></td></tr><tr><td>Vasovet 24G</td><td>Braun</td><td>REF 381212</td><td>&nbsp;over-the-needle catheter</td></tr><tr><td>Omnifix-F 1 ml spuit</td><td>Braun</td><td>9161406V</td><td></td></tr><tr><td>Imalgene (Ketamine)</td><td>Merial</td><td>RN 9767</td><td>Diergeneeskundig recept is noodzakelijk</td></tr><tr><td>Domtor (Medetomidine)</td><td>Esteve</td><td>CN 570686.3</td><td>Diergeneeskundig recept is noodzakelijk</td></tr><tr><td>Verwarmingskussen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Faber-Castel TG1</td><td>Faber-Castel</td><td>16 33 99</td><td>India (China) Ink</td></tr><tr><td>Holter Syneflash</td><td>Ela medical</td><td>SF0003044S</td><td>24 uur Holter ECG systeem.</td></tr><tr><td>Electrodes Blue Sensor&reg;</td><td>Ambu (NUMED)</td><td>VLC-00-S</td><td>Holter ECG elektroden.</td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica Biosystems</td><td>RM2155</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Olimpus</td><td>CO11</td><td></td></tr><tr><td>ABC Vector Elite</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-6200</td><td>Avidin Biotin Complex Kit.</td></tr><tr><td>Chicken anti-GFP antibody</td><td>Invitrogen</td><td>A10262</td><td>Primair antilichaam.</td></tr><tr><td>Biotinylated goat-anti-chicken IgG Antibody</td><td>Vector Laboratories</td><td>BA-9010</td><td>Secundair Antilichaam.</td></tr><tr><td>3,30-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB)</td><td>DAKO (Agilent)</td><td>S3000</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescentie Microscoop</td><td>Carl Zeiss MicroImaging</td><td>Zeiss AX10 Axioskop</td><td></td></tr><tr><td>Holter ECG</td><td>Elamedical</td><td>Syneflash SF0003044S</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s aangepast Eagle medium (DMEM)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>11965084</td><td></td></tr><tr><td>10% foetaal calf serum (FCS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>11573397</td><td></td></tr><tr><td>0.05% Trypsin-Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 (Lipid transfectie reagens)</td><td>Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Reduced serum medium (Opti-MEM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin B</td><td>Calbiochem (MERCK)</td><td>400051</td><td></td></tr><tr><td>Xyleen (histologisch)</td><td>Fisher Scientific</td><td>X3S-4</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen Peroxide Solution (H2O2)</td><td>Sigma</td><td>H1009</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Fisher Scientific</td><td>53-702-250KU</td><td></td></tr></tbody></table>

percutane contrast echocardiografie geleide intramyocardial injectie en cel levering in een grote preklinische model

Percutaneous Contrast Echocardiography-guided Intramyocardial Injection and Cell Delivery in a Large Preclinical Model

Cel en genetische therapie zijn spannende en veelbelovende strategieën met het oog op cardiale regeneratie in de omgeving van hartfalen met verminderd ejectie fractie (HFrEF). Voordat ze kunnen worden beschouwd voor gebruik en ten uitvoer gelegd bij de mens, zijn uitgebreide Preklinische studies verplicht in grote diermodellen te evalueren van de veiligheid, werkzaamheid, en het lot van de injectate (b.v., stamcellen) eenmaal in het myocardium overgeleverd. Kleine knaagdieren modellen bieden voordelen (bijvoorbeeld, kosteneffectiviteit, inschikkelijkheid voor genetische manipulatie); echter, gezien de inherente beperkingen van deze modellen, de bevindingen in dit zelden vertalen naar de kliniek. Omgekeerd, grote dierlijke modellen zoals konijnen, hebben voordelen (bijvoorbeeld, soortgelijke cardiale electrofysiologie t.o.v. mensen en andere grote dieren), met behoud van een goede kosteneffectieve balans. Hier, we laten zien hoe u kunt uitvoeren een percutane contrast echocardiografie geleide intramyocardial injectie (IMI) techniek, die minimaal invasieve, veilig, goed getolereerd, zeer effectief zijn in de beoogde levering van injectates en, met inbegrip van cellen, op verschillende locaties binnen het myocardium van een konijn-model. Voor de uitvoering van deze techniek, hebben wij ook geprofiteerd van een algemeen beschikbare klinische echocardiografie systeem. Na de invoering in de praktijk het protocol hier beschreven, een onderzoeker met fundamentele echografie kennis zal worden bevoegd zijn op de prestaties van deze veelzijdige en minimaal invasieve techniek voor routinematig gebruik in experimenten, gericht op de hypothese testen van de mogelijkheden van cardiale regeneratieve therapeutics in het konijn-model. Zodra competentie is bereikt, kan de hele procedure kan worden uitgevoerd binnen 25 minuten na het konijn te verdoven.

Percutane Contrast echocardiografie geleide IMI met InI:
Hierboven beschreven met behulp van het protocol, en zodra de optimale positionering van de punt van de naald werd bevestigd door echocardiografie en de injectie gestart, transmurale hyperechogenicity werd waargenomen tijdens de levering van InI (10% v/v in PBS) (figuur 2E) , ook zo kort na het IMI aan de target-regio (<strong...

Nieuwe therapeutische strategieën in cardiale regeneratieve geneeskunde vereisen uitgebreide en gedetailleerde studies in grote preklinische diermodellen voordat zij kunnen worden beschouwd voor gebruik bij de mens. We laten hier zien een percutane contrast echocardiografie geleide intramyocardial injectietechniek bij konijnen, die is waardevol voor de hypothese testen van de werkzaamheid van dergelijke nieuwe therapieën.

Percutane Contrast echocardiografie geleide Intramyocardial injectie en cel levering in een grote preklinische Model

Cell and gene therapy are exciting and promising strategies for the purpose of cardiac regeneration in the setting of heart failure with reduced ejection ...

Het algemene doel van deze procedure is om veilig en nauwkeurig een volume injectaat in het linkerventrikelmyocard van het konijnenhart af te geven. En dit te doen door gebruik te maken van percutane contrastechocardiografie. Dit wordt bereikt door het dier eerst te verdoven en vervolgens de borst voor de procedure voor te bereiden.Vervolgens, nadat het konijn op een thermisch deken is geplaatst en geverifieerd dat een ECG-signaal correct wordt weergegeven, gebruikt u een klinisch echografiesysteem om een geschikt akoestisch venster te verkrijgen en optimaliseert u het beeld in een breed gezichtsveld. Dan, nadat de spuit is geladen met gemarkeerde cellen gemengd met een geschikt contrastmiddel en onder echografiebegeleiding, lijnt u de naald voorzichtig uit tegenover de transducer en plaatst u deze dicht bij de huid van de linker hemithorax, voordat u de naald langzaam naar het doelgebied van het myocard laat avanceren. Ten slotte wordt het injectaat veilig afgegeven, zoals gedemonstreerd door transmurale hyperechogeniteit op de injectieplaats in het echocardiografische beeld.Uiteindelijk wordt de bevestiging ex vivo van succesvolle afgifte van injectaat gedemonstreerd door de aanwezigheid van kleurstof in het myocard, terwijl dwarsdoorsnede immunohistochemische analyse van myocardweefselsneden wordt gebruikt om de succesvolle afgifte van een celmarker en kleurstof in het doelmyocard te tonen. Het doel van deze video is om te demonstreren hoe deze techniek veilig en nauwkeurig kan worden uitgevoerd, voor onze mogelijkheid, op het konijn van vandaag, met behulp van een klinisch echografiesysteem. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn de minimale en basale aard van de machine en de mogelijkheid om contrastechocardiografische begeleiding te gebruiken voor nauwkeurige visualisatie van de doelinjectieplaatsen, waardoor het risico van accidentele interkamerlijke afgifte tot een minimum wordt beperkt.Voordat u doorgaat met intramyocardial injectie, begint u met het injecteren van een combinatie van ketamine en medetomidine om het dier te verdoven. Zoals gedemonstreerd, blijft het konijn kalm wanneer de kop bedekt is met een chirurgisch deken. Zodra het dier is verdoofd, gebruikt u een haartrimmer om het haar van de huid van de thorax te verwijderen, beginnend onder de nek, en vervolgens verplaatsend naar het subxiphoide gebied.Scheer extra regio's van een tot drie centimeter van de interne kant van de rechter voorpoot, evenals de mediale tibiale regio's van zowel de rechter als linker achterpoten. Breng vervolgens een geschikte geleidende gel aan op de elektroden en plaats deze in de geschoren regio's van de ledematen. Bevestig de elektroden met chirurgische tape om het verlies van contact te voorkomen tijdens het bewegen van het dier tijdens de procedure.Plaats vervolgens het dier op een thermisch deken, verifieer dat een correct ECG-signaal wordt weergegeven op het scherm van het systeem, houd het dier in een rugligging en laat het dier spontaan ademen terwijl u zuurstof toedient door een gelaatmasker gedurende de hele procedure. Reinig en desinfecteer de geschoren huid van de borst grondig met een chloorhexidine-oplossing. Om een goed contact van de huid met de transducer te behouden en om artefacten te verminderen en de algehele beeldkwaliteit te verbeteren, brengt u een voldoende hoeveelheid echografiegel aan op de transducer.Plaats vervolgens handmatig de transducer op de vierde tot zesde intercostale ruimte twee tot drie centimeter van de rechter parasternale lijn, en op een invalshoek van de ultrasone straal van ongeveer 90 graden, ten opzichte van de borstwand. Zorg ervoor dat de transduceroriëntatiemarkering naar voren is gericht om de uitlijning met de naald in de volgende stappen te vergemakkelijken. U zou een parasternal korte asbeeld van het hart moeten verkrijgen op het niveau van de papillaire spieren.En het is belangrijk om een breed gezichtsveld te hebben door de diepte met de juiste controle in het systeem te verhogen. Pas indien nodig de locatie van de transducer ten opzichte van de intercostale ruimte aan, evenals de anteroposterieure en dorsoventrale hoek om het beeld te optimaliseren, en identificeer vervolgens in deze weergave de rechter ventrikel, RV, linker ventrikel, LV, interventriculair septum, IVS, achterste wand, PW, evenals antero en posteromediale papillaire spieren. Besteed bijzondere aandacht aan het verkrijgen van een symmetrisch beeld in deze weergave, evenals geschikte differentiatie van endocardiale en epicardiale contouren, en pas indien nodig aan door middel van beeldoptimalisatiecontroles zoals gain control.Zodra de juiste echocardiografische weergave is verkregen, houdt u deze positie gedurende de rest van de procedure terwijl een tweede operator de intramyocardial injectie uitvoert. Gebruik hiervoor een voorgeladen spuit met een naald die moet worden geplaatst in de buurt van de huid van de linker hemithorax in een symmetrische spiegelpositie ten opzichte van de transducer. Richt vervolgens de naald handmatig uit met de transduceroriëntatiemarkering onder een hoek van ongeveer 90 graden en laat de naald langzaam door de huid en de borstholte binnendringen.De percutane naaldatinbrenging in deze positie en oriëntatie maakt de visualisatie van de naald in het vlak van de ultrasone straal mogelijk, waardoor realtime monitoring mogelijk is, en indien nodig aanpassing van de locatie van de naald ten opzichte van het doelgebied van het myocard, zoals hier getoond. Merk in deze afbeelding de aanwezigheid van de naald in de linker ventrikelholte op, aangegeven door de pijltjes. Deze kan gemakkelijk worden herpositioneerd door de naald voorzichtig terug te trekken en opnieuw te positioneren op de gewenste locatie.Met de punt op de doellocatie, levert u het injectaat langzaam af gedurende een periode van 20 tot 30 seconden, terwijl u de naald langzaam en voorzichtig terugtrekt om de behandelde omvang van het myocard te vergroten. Voer subtiele veranderingen in de invalshoek van de naald uit indien nodig om injecties te voltooien op vier intramyocardial injectieplaatsen. Een in het interventriculaire septum en drie in de vrije wand van de linker ventrikel, en lever een volume van 250 microliter injectaat per injectieplaats af.Na voltooiing van de procedure, blij

percutaneous-contrast-echocardiography-guided-intramyocardial

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Intramyocardial cel levering in muriene modellen van cardiovasculaire ziekten, zoals hypertensie of myocardiaal infarct, wordt veel gebruikt om het therapeutisch potentieel van verschillende celtypes in regeneratieve studies testen. Daarom zal een gedetailleerde beschrijving en een duidelijke visualisatie van deze chirurgische procedure helpen om de beperkingen en voordelen van cardiovasculaire cel therapeutische analyses in kleine knaagdieren te definiëren.

Intramyocardiale Cell Levering: Waarnemingen in Muizen Harten

Echocardiografie-geleide percutane intramyocardiale injectie vertegenwoordigt een efficiënte, betrouwbare en richtbare modaliteit voor de levering van genoverdracht agentia of cellen in muizen hart. Naar aanleiding van de stappen in dit protocol, kan de operator snel bevoegd in deze veelzijdige, minimaal invasieve techniek geworden.

Echogeleide Transthoracale intramyocardiale Injectie in Muizen

Echogeleide celafgifte rond de plaats van myocardinfarct bij muizen is een veilige, effectieve en handige manier van celtransplantatie.

Echogeleide geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocytenimplantatie bij myocardinfarct muizen

Dit protocol beschrijft drie methoden voor het toedienen van cardioactieve therapeutische middelen in een varkensmodel. Vrouwelijke landrasvarkens werden behandeld door middel van: (1) thoracotomie en transepicardiale injectie, (2) transendocardiale injectie op basis van katheter, of (3) intraveneuze infusie via halsaderosmotische minipomp.

Levering van cardioactieve therapieën in een model voor een myocardinfarct bij varkens

Dit artikel beschrijft een geoptimaliseerd protocol voor echocardiografie-geleide intramyocardiale injecties in rattenmodellen van een myocardinfarct met behulp van een naald van 29 G x 88 mm. Deze techniek zorgt voor een robuuste, nauwkeurige en reproduceerbare toediening van therapeutische middelen rechtstreeks in de peri-infarctzone.

Echocardiografiegeleide injectie voor gerichte en betrouwbare intramyocardiale stamcelafgifte in een rattenmodel van een myocardinfarct

Tal van genetische manipulaties en / of intramyocardial injecties van genen, eiwitten, cellen en / of biomaterialen wordt toegevoegd aan de dimensie van de tijd in studies van de acute ischemie / reperfusie schade en chronische remodeling bij muizen. Deze video illustreert de microchirurgische procedures voor ischemie / reperfusie, permanent coronaire ligatie, en intramyocardial injectie studies.

Kransslagader Ligatie en Intramyocardial Injectie in een muizenmodel van Infarction

Een preklinische, muizenmodel van levermetastasen uitgevoerd via een hemispleen injectietechniek.

Een preklinisch muizenmodel van levermetastasen

Het algemene doel van deze procedure is om met succes een deel van het bot van de rib van een muis te reseceren. De procedure is ontwikkeld als een model om grootschalige reparatie van lange botten te bestuderen.

Een chirurgische ingreep voor resecting de muis Rib: Een Model Grootschalige Long Botherstel

Spontaan verdragsluitende syncytia van cardiomyocytes afgeleid van mens-geïnduceerde pluripotente zijn stamcellen nuttige modellen van menselijke cardiale fysiologie en farmacologie. Hier presenteren we een high-throughput screening systeem voor het kwantificeren van de effecten van exogene verbindingen op het verslaan van de frequentie, met behulp van een Ca-gevoelige fluorescente kleurstof en een temperatuurgevoelig imaging multi goed afleesapparaat.

Contracties van mens-iPSC-afgeleide Cardiomyocyte Syncytia gemeten met een Ca-gevoelige fluorescente kleurstof in temperatuurgevoelig 384-Wells-platen

Wij beschrijven een chirurgische procedure die wordt gebruikt om perifere ischemie in konijnen met hyperlipidemie en diabetes te veroorzaken. Deze operatie fungeert als een preklinisch model voor aandoeningen ervaren in perifeer vaatlijden bij patiënten. Angiografie wordt ook beschreven als een middel om de omvang van de geïntroduceerde ischemie en het herstel van de doorbloeding te meten.

Preklinisch model van de achterste ledematen ischemie bij diabetische konijnen

Leer een percutane contrast echocardiografie-geleide intramyocardiale injectietechniek in konijnen voor cardiale regeneratieve geneeskunde. Deze methode maakt veilige en nauwkeurige levering van therapeutische middelen mogelijk.

Percutane Contrast echocardiografie geleide Intramyocardial injectie en cel levering in een grote preklinische Model

Meer video's verkennen