Name: Subretinal transplantatie van menselijke embryonale stamcellen afgeleid-retinale Pigment epitheliale cellen in een grote-eyed Model van geografische atrofie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-22T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: Leer subretinale transplantatie van menselijke embryonale stamcel-afgeleide retinale pigment epitheelcellen in een grootogig konijnenmodel van geografische atrofie. Deze methode ondersteunt regeneratieve geneeskunde voor leeftijdsgebonden maculadegeneratie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd ondersteund door subsidies van het Karolinska Instituut, het kroonprinses Margareta van Stichting voor de slechtzienden, de Stichting Jordanië Edwin voor uitgevoerd oftalmologisch onderzoek, de Zweedse Eye Foundation, de koning Gustav V Foundation, de ARMEC Lindeberg Foundation, en de Cronqvist Foundation.

Het volgende protocol volgt de dierenverzorgers richtsnoeren van Karolinska Instituet. Alle dierproeven met behulp van Nieuw-Zeeland albino konijnen (Tabel of Materials) zijn goedgekeurd door het Comité regionale dierenethiek (Stockholms Norra Djurförsöksetiska Nämnd) (toestaan: dnr 56/15). Het gebruik van hESC (dnr 2011/745-31/3) en de overdracht en de manipulatie van hESC-RPE (dnr 2013/813-31/2) is ook in overeenstemming met de Zweedse wet- en regelgeving van het Karolinska Institutet, en is goedgekeurd door de regionale menselijke ethische Commissie ( 1regional Etikprövningsnämnden ik Stockholm).
1. subretinal injectie van natrium Kaliumjodaat (NaIO3) in een grote-eyed diermodel
<ol><li>Anesthetize van dieren door intramusculaire toediening in de dij met een mengsel van 35 mg/kg ketamine en 5 mg/kg xylazine in zout met behulp van een injectiespuit 30 G en verwijden van leerlingen met actuele oogdruppels gebruiken een mix van 0,75% Cyclopentolaat en 2,5% phenylephrine. Juiste afstomping wordt bevestigd als het dier niet op een harde snuifje haar rug been reageert.</li>
	<li>Plaats het konijn onder de chirurgische Microscoop met het hoofd geconfronteerd met de chirurg (figuur 1A). Gebruik een oprolmechanisme van het deksel te verwijderen van de oogleden en nictitans membraan met een steriele doek om te minimaliseren van het risico van besmetting. Gebruik evenwichtig zoutoplossing (BSS) om te voorkomen dat droogte terwijl onder verdoving in beide ogen.</li>
	<li>
Voor microchirurgie, gebruik een 2-poort (of optionele 3-poort) 25 G transvitreal pars plana techniek met niet-schuifkleppen trocars voor het inbrengen van microchirurgische instrumenten (figuur 1B). De multifunctionele Vitrectomie machine heeft poorten om verbinding te maken met een infusie canule, endoillumination, vitrector en endolaser. Voor subretinal injecties is alleen de endoillumination verplicht, waardoor een set-up 2-poort voldoende. Voeg de endoillumation door de bovenste linker trocar en gebruik van de bovenste rechts trocar voor de canule subretinal injectie.
	<ol>
<li>Voor een 3-poort set-up, gebruikt u de lagere temporele trocar voor de BSS infusie canule. Als optionele instrumenten (zoals een vitrector) zijn gebruikt, voegt u deze via de bovenste rechts trocar.</li>
		<li>De bovenste 2 trocars 1-2 mm uit de limbus klauwkikker pincet met pak en verdringen het bindvlies overliggende de invoeging site invoegen.</li>
		<li>Zorg ervoor dat de trocars zijn ingevoegde transsclerally onder een hoek van 30-45° limbus parallelle en ga naar het midden van het puntje van de trocar. Draai de trocar 90° en vooraf in het oog, die gericht zijn op de achterste paal van het oog. Deze procedure zal voorkomen na chirurgische lekkage uit de sclerotomies, en ook het verlagen van het risico op endophthalmitis (dat wil zeggen, bacteriële infectie in het oog). Zie ook figuur 2B voor trocar posities.</li>
		<li>Zet een éénpersoons gebruik platte contactlens op het hoornvlies te visualiseren van het netvlies, met synthetische tranen als contact gel tussen het oog en de contactlens (figuur 1A).</li>
		<li>Trekken 500 µL van NaIO3 in een spuit van 1 mL aangesloten op een verlenging buis (gerund door de Office-assistent) en een 38 G polytip canule (gerund door de chirurg).</li>
		<li>De sonde van de endoillumination door de bovenste linker trocar en de injectie canule via de bovenste rechts trocar invoegen, en verder de canule via het glasvocht ruimte naar het netvlies, streven naar het gebied net onder het hoofd van de oogzenuw.</li>
		<li>Laat het uiteinde van de canule te langzaam het netvlies raken totdat een focale whitening zichtbaar is. De injectie zelf zal doordringen in het netvlies, waardoor subretinal levering. Laat niet de canule doordringen van het netvlies, aangezien dit kan bloeding veroorzaken.</li>
		<li>Injecteren 50 µL van NaIO3 subretinally een periode van 5 s. Aangezien er een natuurlijke decolleté vliegtuig tussen het netvlies en de onderliggende vaatvlies, moet een duidelijk zichtbaar semi-transparante bleb geleidelijk vormen tijdens de injectie.</li>
		<li>Tijdens de injectie, langzaam intrekken van de naald, maar zorg ervoor dat het uiteinde wordt gehandhaafd binnen het bleb om te minimaliseren van reflux.</li>
		<li>Na verwijdering van de endoillumation en injectie canule, verwijder de trocars met behulp van klauwkikker pincet en toepassing lichte druk voor 30 s tot de zelfsluitende hechtdraad-minder sclerotomies met behulp van de tip of het botte uiteinde van de verlostang.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Had het geven van 10 mL zoutoplossing subcutaan om uitdroging te voorkomen. Geef niet na chirurgische topische steroïden of antibiotica. Voor pijnstillers 0,5 mL van buprenorfine 0,3 mg/ml subcutaan na chirurgie, evenals de dag na de operatie geven.</li>
	<li>Na gebruik, wassen alle instrumenten door het onder te dompelen hen voor een paar seconden in de eerste plaats in 70% ethanol, de tweede in ethanol 45%, en tot slot in gedistilleerd water. Droog ze goed met een papieren handdoek.</li>
	<li>Dieren wonen totdat zij weer voldoende bewustzijn en plaats ze allen één encaged. Indien nodig (bijvoorbeeldvoor doeleinden van immunohistochemistry), euthanaseren van dieren door intraveneuze injectie van 100 mg/kg pentobarbital (Zie Tabel van materialen).</li>
	<li>7 dagen om verder te gaan met de transplantatie van cellen van de hESC-RPE wachten.</li>
</ol>2. subretinal transplantatie van cellen van de hESC-RPE in dieren behandeld
<ol><li>Beheren van 2 mg (100 µL) van intravitreal Triamcinolon in narcose dieren met behulp van een naald van 30 g injectie ingevoegd van 1-2 mm van de limbus in de lagere temporele kwadrant 1 week voor transplantatie van hESC-RPE en opnieuw beheren het elke 3 maanden. Zorg ervoor dat punt van de tip naar de achterste paal van het oog om te voorkomen dat de aanraking van een lens.</li>
	<li>Cultuur een hESC-RPE enkelgelaagde zoals eerder beschreven1.</li>
	<li>Verwijderen van cel differentiatie media (Zie Tabel van materialen) van een 24-well confluente hESC-RPE enkelgelaagde en wassen elk goed met 500 µL van PBS zonder Ca2 + en Mg2 +. Herhaal deze actie nogmaals, voor een totaal van 2 wasbeurten.</li>
	<li>Vloeistof wordt weggeworpen, voeg 500 µL van trypsine per putje en incubeer gedurende 12 minuten bij 37 ° C.</li>
	<li>Kantelen van de plaat en verwijder voorzichtig trypsine (cellen moeten blijven gekoppeld aan de plaat). Cellen in 800 µL van vers 37 ° C voorverwarmde differentiatie media verzamelen door zachte pipetteren, of zelfs schrapen indien nodig, te verkrijgen van de schorsing van een enkele cel. Opmerking: Gebruik een zeef 40 µm cel als cel klontjes in acht worden genomen.</li>
	<li>Cellen tellen in een hemocytometer kamer met 0,2% Trypan blauw, volgens de instructies van de fabrikant.</li>
	<li>Voeg 5 mL van de media en centrifuge cellen differentiatie bij kamertemperatuur, 300 x g gedurende 5 minuten.</li>
	<li>Verwijder supernatant en resuspendeer de pellet in vers filter-gesteriliseerde PBS (doorgegeven door middel van een 25 mm spuit filter), om een eindconcentratie van 1000 cellen/µL.</li>
	<li>Aliquot de vorige celsuspensie in 600 µL aliquots en houd op ijs tot en tijdens de operatie.</li>
	<li>Anesthetize dieren door intramusculaire toediening in de dij met een mengsel van 35 mg/kg ketamine en 5 mg/kg xylazine in zout met behulp van een injectiespuit 30 G. Verwijden leerlingen met actuele oogdruppels gebruiken amix van 0,75% Cyclopentolaat en 2,5% phenylephrine. Juiste afstomping wordt bevestigd als het dier niet op een harde snuifje in zijn achterste been reageert.</li>
	<li>Plaats het konijn met het hoofd geconfronteerd met de chirurg. Gebruik een oprolmechanisme van het deksel te verwijderen van de oogleden en nictitans membraan met een steriele doek om te minimaliseren van het risico van besmetting. Met BSS voorkomen dat droogte terwijl onder verdoving in beide ogen.</li>
	<li>
Voor microchirurgie, gebruik een 2-poort (of optionele 3-poort) 25 G transvitreal pars plana techniek met trocars in dezelfde positie geplaatst, zoals beschreven in stap 1.3 en Figuur 2. Als de vorige sclerotomies zichtbaar zijn, voeren trocar inbrengen net naast, maar niet via deze, tot een minimum beperken van het risico van postoperatieve lekkage.
	<ol>
<li>Zet een éénpersoons gebruik platte contactlens op het hoornvlies te visualiseren van het netvlies, met synthetische tranen als het contact gel tussen het oog en de contactlens (figuur 1A).</li>
		<li>Na goede tip (zie stap 1.3.5 en 1.3.6) positionering, injecteren 50 µL van een voorzichtig-gemengde hESC-RPE schorsing (50.000 cellen) subretinally. Streven naar het midden van de NaIO3 voorbehandeld gebied onderscheidt zich door een karakteristieke "metalen" endo-verlichting-reflex. Het hormoonfuncties netvlies moet scheiden gemakkelijk maken een duidelijk zichtbare bleb. Flush de naald met steriele H2O daartussenin konijnen/na gebruik te voorkomen van naald verstoppingen als gevolg van cel samengeklonterd. Verandering de naald bij verstopping is opgemerkt.</li>
		<li>Tijdens de injectie, langzaam intrekken van de naald, maar zorg ervoor dat het uiteinde wordt gehandhaafd binnen het bleb om te minimaliseren van reflux.</li>
		<li>Na verwijdering van de endoillumation en injectie canule, verwijder de trocars met behulp van klauwkikker pincet en toepassing lichte druk voor 30 s tot de zelfsluitende hechtdraad-minder sclerotomies met behulp van de tip of het botte uiteinde van de verlostang.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Had het geven van 10 mL zoutoplossing subcutaan om uitdroging te voorkomen. Geef niet na chirurgische topische steroïden of antibiotica. Voor pijnstillers 0,5 mL van buprenorfine 0,3 mg/ml subcutaan na chirurgie, evenals de dag na de operatie geven.</li>
	<li>Na gebruik, wassen alle instrumenten door het onder te dompelen hen voor een paar seconden, om te beginnen in 70% ethanol, de tweede in ethanol 45%, en tot slot in gedistilleerd water. Droog ze goed met een papieren handdoek.</li>
	<li>Dieren wonen totdat zij weer voldoende bewustzijn en plaats ze allen één encaged. Indien nodig (bijvoorbeeld voor doeleinden van immunohistochemistry) euthanaseren van dieren door intraveneuze injectie van 100 mg/kg pentobarbital.</li>
</ol>3. in Vivo Retina en Subretinal Imaging
<ol><li>
Een spectrale domein optische coherentie tomografie (SD-OCT) apparaat gebruiken met de meegeleverde software (zie tabel van materialen) te verkrijgen van transversale b-scans van de behandelde dieren, volgens de instructies van de fabrikant. Om te vermijden vervagen van de afbeelding, ervoor te zorgen het hoornvlies om vochtig te houden door te spoelen met actuele saline elke 30-60-s.
	<ol>
<li>Plaats de narcose en leerling-uitgezet dieren (zie stap 1.1 en 2.10) in een verstelbare mount te verkrijgen van een onbelemmerde pad van de lichtbron instrument aan het netvlies konijn.</li>
		<li>Het verkrijgen van ten minste 3 OCT scans met gelijktijdige infrarood-confocale scanning laser ophthalmoscopy (IR-cSLO) reflectiecoëfficiënt referentie afbeeldingen vertegenwoordigen het bovenste, Centraal en onderste gedeelte van het geïnjecteerde gebied.</li>
		<li>Verkrijgen van nl-gezicht fundus beelden met cSLO blauwe, groene, infrarood en multicolor laser reflectie (d.w.z., meerdere gelijktijdige laser kleuren), respectievelijk.</li>
		<li>Blauw licht autofluorescence (BAF) opnamen met behulp van het vermogen van de blauw-licht laser van de SD-OCT-apparaat.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Plaza Reyes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xeno-Free+and+Defined+Human+Embryonic+Stem+Cell-Derived+Retinal+Pigment+Epithelial+Cells+Functionally+Integrate+in+a+Large-Eyed+Preclinical+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Xeno-Free and Defined Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells Functionally Integrate in a Large-Eyed Preclinical Model.</a> Stem Cell Rep. 6 (1), 9-17 (2016).</li>
<li>Bartuma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Imaging+of+Subretinal+Bleb-Induced+Outer+Retinal+Degeneration+in+the+Rabbit%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">In Vivo Imaging of Subretinal Bleb-Induced Outer Retinal Degeneration in the Rabbit.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (4), 2423-2430 (2015).</li>
<li>Petrus-Reurer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+Subretinal+Suspension+Transplants+of+Human+Embryonic+Stem+Cell-Derived+Retinal+Pigment+Epithelial+Cells+in+a+Large-Eyed+Model+of+Geographic+Atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Integration of Subretinal Suspension Transplants of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells in a Large-Eyed Model of Geographic Atrophy.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (2), 1314-1322 (2017).</li>
<li>Carido, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+mouse+model+with+complete+RPE+loss+and+its+use+for+RPE+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Characterization of a mouse model with complete RPE loss and its use for RPE cell transplantation.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (8), 5431-5444 (2014).</li>
<li>Lund, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+cells+rescue+visual+function+in+dystrophic+RCS+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Cloning+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived cells rescue visual function in dystrophic RCS rats.</a> Cloning Stem Cells. 8 (3), 189-199 (2006).</li>
<li>Vugler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+the+phenomenon+of+HESC-derived+RPE%3A+anatomy+of+cell+genesis%2C+expansion+and+retinal+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Elucidating the phenomenon of HESC-derived RPE: anatomy of cell genesis, expansion and retinal transplantation.</a> Exp Neurol. 214 (2), 347-361 (2008).</li>
<li>Schwartz, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+trials+for+macular+degeneration%3A+a+preliminary+report%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report.</a> Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).</li>
<li>Hughes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+schematic+eye+for+the+rabbit%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">A schematic eye for the rabbit.</a> Vision Res. 12 (1), 123-138 (1972).</li>
<li>Blanch, R. J., Ahmed, Z., Berry, M., Scott, R. A., Logan, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22603978">Animal models of retinal injury.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (6), 2913-2920 (2012).</li>
<li>Nork, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+anatomic+consequences+of+subretinal+dosing+in+the+cynomolgus+macaque%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Functional and anatomic consequences of subretinal dosing in the cynomolgus macaque.</a> Arch Ophthalmol. 130 (1), 65-75 (2012).</li>
</ol>

De auteurs geen strijdige belangen of belangenconflicten.

In dit protocol, wordt de generatie van een grote-eyed model van GA en het preklinische gebruik voor het evalueren van hESC-RPE integratie in vivo beschreven.
Vertaling van regeneratieve therapieën voor GA en de verwante ziekten in de kliniek7is het belangrijk te ontwikkelen en optimaliseren van methoden die getrouw de klinische methoden voor transplantatie en beeldbewerking vangen. Het konijn is in dit aantrekkelijke aspect: het heeft een relatief grote oog da...

Dit protocol beschrijft de generatie van een grote-eyed preklinische model van geografische atrofie (GA), waarmee de evaluatie van de integratie van getransplanteerde hESC-RPE in de subretinal ruimte. De in detail hier beschreven methoden zijn gebruikt in 3 recente publicaties die aantonen de productie van een verrijkte, zuivere en functionele bevolking van RPE cellen van hESC1, evenals de oprichting van buitenste retinale schade en een GA-achtige fenotype dat veroorzaakt door subretinal injectie van fysiologische zoutoplossingen (d.w.z., BSS en PBS) of NaIO3 in de konijn eye2,3. We verder aangetoond dat sub retinale schorsing transplantaties van hESC-RPE uitgebreide functionele monolayers met fotoreceptor redding capaciteit2vormen.
Verschillende voordelen vergezeld gaan van het gebruik van het konijn-oog voor de generatie van een GA model van ziekte. Ten eerste, de grootte van het konijn oog, die is 70% van het volume van een volwassen menselijk oog, kan klinisch zinvolle transplantatie met behulp van een celdichtheid die veel lager is dan routinematig gebruikt in kleine knaagdieren ogen (1000 cellen/µL vs. 50.000 cellen/µL)4 , 5. ten tweede chirurgie bij knaagdieren is meestal transscleral via het vaatvlies, die het netvlies barrière in het gedrang brengt en potentieel triggers een ontstekingsreactie en een mogelijke afwijzing6. Beide factoren leiden samen tot multilayering en samendoen van getransplanteerde cellen, en een over het algemeen slechte integratie van de getransplanteerde cellen in een verstoorde inheemse retinale weefsel. Echter kunt het grote-eyed konijn model uitvoeren van een chirurgische techniek met instrumentatie identiek aan een klinische setting. Ten derde, een grote-eyed model tevens in staat hoge resolutie in vivo imaging en bewaking van de getransplanteerde cellen en het bovenliggende netvlies door tijd1,2,3. Dus beschrijven we een klinisch relevante en kosten-efficiënte preklinische model dat een aantrekkelijk alternatief voor knaagdieren voor iedereen met een interesse in onderzoek van het netvlies van normale en zieke en de sub retinale ruimte moet.

<table><tbody><tr><td>NutriStem hESC XF differentiatiemedium &ndash;bFGF en &ndash;TGFb</td><td>Biological Industries</td><td>06-5100-01-1A</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Select 1x</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific Corp</td><td>12563-011</td><td></td></tr><tr><td>PBS zonder Ca2+ en Mg2+</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific Corp</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Cell strainer 40 &mu;m Nylon</td><td>VWR</td><td>732-2757</td><td></td></tr><tr><td>Naald 30 G 0.5&rsquo;&rsquo;; 0.3 mm x 13 mm</td><td>BD Microlance</td><td>304827</td><td></td></tr><tr><td>Acrodisc 25 mm spuitfilter</td><td>Acrodisc</td><td>PN4612</td><td></td></tr><tr><td>0,4% trypanblauw</td><td>ThermoFisher Scientific Corp</td><td>15250061</td><td>Gebruik bij 0,2%</td></tr><tr><td>NaIO3</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>S4007</td><td></td></tr><tr><td>BSS</td><td>Alcon Nordic A/S</td><td>65079550</td><td></td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td>Solveco AB</td><td>1047</td><td></td></tr><tr><td>Ketaminol, 100 mg/mL</td><td>Intervet, Boxmeer</td><td>511519</td><td>Gebruik 35 mg/kg ketamin</td></tr><tr><td>Rompun vet, 20 mg/mL</td><td>Bayer Animal Health</td><td>22545</td><td>Gebruik 5 mg/kg xylazine</td></tr><tr><td>Triescence, 40 mg/mL</td><td>Alcon Nordic A/S</td><td>412915</td><td>2 mg intraviterial</td></tr><tr><td>Cyklopentolaat-fenylephrine, 0,75% + 2,5%</td><td>APL</td><td>321968</td><td>Gebruik 1 druppel in elk oog</td></tr><tr><td>Viscotears</td><td>Laboratoires Théa</td><td>597562</td><td></td></tr><tr><td>Topische zoutoplossing</td><td>Apotea AB</td><td>7053249369080</td><td></td></tr><tr><td>Allfatal vet. 100 mg/mL</td><td>Omnidea</td><td>77168</td><td>Gebruik 100 mg/mL pentobarbital</td></tr><tr><td>Extensiebuis (Hammer)</td><td>MedOne Surgical Inc</td><td>3223</td><td></td></tr><tr><td>25 G/38 G polytip subretinale canule</td><td>MedOne Surgical Inc</td><td>3219</td><td>25 G/38 G</td></tr><tr><td>Single Use Flat Lens</td><td>Volk</td><td>#VWFD10</td><td></td></tr><tr><td>Barraquer Colibri ooglid retractor</td><td>AgnTho's AB</td><td>42-020-030</td><td></td></tr><tr><td>Trocars zonder klep</td><td>Alcon Nordic A/S</td><td>8065751448</td><td></td></tr><tr><td>Klauwtang</td><td>Bausch &amp; Lomb Nordic AB</td><td>ET1811</td><td></td></tr><tr><td>Alcon Accurus 400VS Vitrectomie machine</td><td>Alcon Nordic A/S</td><td>8065740238</td><td></td></tr><tr><td>Accurus 25+ Gauge Vitrectomie TotalL Plus Pak</td><td>Alcon Nordic A/S</td><td>8065751493</td><td></td></tr><tr><td>SD-OCT apparaat</td><td>Heidelberg Engineering</td><td>Spectralis HRA+OCT</td><td>Gebruik Heidelberg Eye Explorer versie 1.9.10.0</td></tr><tr><td>24 welplaten</td><td>Sarstedt</td><td>83.3922</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer hemocytometers</td><td>VWR</td><td>631-0925</td><td></td></tr><tr><td>New Zealand albino konijnen</td><td>Lidk&ouml;pings Konijnenboerderij, Zweden</td><td></td><td></td></tr><tr><td>hESC-RPE cellen</td><td></td><td></td><td>Zie referentienummer 1</td></tr><tr><td>Buprenodale Vet, 0,3 mg/ml</td><td>Dechra</td><td>660500</td><td>Gebruik 0,5 mL buprenorfine subcutaan</td></tr></tbody></table>

subretinal transplantatie van menselijke embryonale stamcellen afgeleid-retinale pigment epitheliale cellen in een grote-eyed model van geografische atrofie

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy

Geografische atrofie (GA), het late stadium van droge leeftijdsgebonden maculaire degeneratie wordt gekenmerkt door verlies van de retinale pigment epitheliale (RPE) laag, die tot verdere ontaarding van vitale retinale structuren (bijvoorbeeld, researchdieren leidt) veroorzaken ernstige visie bijzondere waardevermindering. Evenzo wordt RPE-verlies en daling van de gezichtsscherpte gezien in de lange termijn volgen omhoog van patiënten met geavanceerde natte leeftijdsgebonden Macula Degeneratie (LMD) die intravitreal anti-vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) behandeling. Dus, aan de ene kant, het is van fundamenteel belang voor het efficiënt afleiden RPE cellen uit een oneindige bron, die als substitutietherapie dienen kunnen. Aan de andere kant, het is belangrijk om te evalueren van het gedrag en de integratie van de afgeleide cellen in een model van de ziekte met als gevolg dat chirurgische en beeldvormende methoden als dicht mogelijk bij die worden toegepast bij de mens. Hier, wij bieden een gedetailleerd protocol op basis van onze eerdere publicaties die beschrijft de generatie van een preklinische model voor GA met behulp van het albino konijn oog, voor de evaluatie van de menselijke embryonale stamcellen afgeleid retinale pigment epitheliale cellen (hESC-RPE) in een klinisch relevante instelling. Gedifferentieerde hESC-RPE in naïef ogen of ogen met NaIO3worden getransplanteerd-geïnduceerde GA-achtige Retina degeneratie met behulp van een techniek met 25 G transvitreal pars plana. Beoordeling van gedegenereerd en getransplanteerde gebieden is uitgevoerd door multimodale high-resolution niet-invasieve real-time imaging.

Vertegenwoordiger in vivo afbeeldingen van BAF, IR-cSLO en SD-LGO van een normale albino konijn netvlies zijn afgebeeld in Figuur 2. Opmerking de verschillende retinale lagen met hun kenmerkende licht reflectie gevangen genomen door de SD-OCT-instrument.
In de figuren 1A en figuur 1B, de setup te creëren sub retinale blebs wordt ge...

Retinale pigment epitheliale cellen kunnen dienen als een cel-vervangende therapie voor de geavanceerde vorm van droge leeftijdsgebonden Macula degeneratie. Dit protocol beschrijft de generatie van een grote-eyed model van geografische atrofie en subretinal transplantatie van menselijke embryonale stamcellen cel afkomstige retinale pigment epitheliale cellen in dit model van ziekte.

Subretinal transplantatie van menselijke embryonale stamcellen afgeleid-retinale Pigment epitheliale cellen in een grote-eyed Model van geografische atrofie

Geographic atrophy (GA), the late stage of dry age-related macular degeneration is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, ...

Het algemene doel van deze procedure is om een diermodel met grote ogen te creëren voor geografische atrofie om menselijke embryonale afgeleide retinale pigmentepitheelcellen in het oog te transplanteren en de integratie van donorcellen te beoordelen met behulp van optische coherentietomografie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvraagstukken op het gebied van regeneratieve geneeskunde, zoals behandeling op basis van stamcellen voor degeneratieve ziekten. Het grote voordeel van deze chirurgische setting is de onbeperkte bron van gezonde cellen en de chirurgische setting voor subretinale injectie, die veel overeenkomsten heeft met een procedure die bedoeld is voor patiënten.De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie van leeftijdsgebonden maculaire degeneratie door de demonstratie van retinale pigmentepitheelcellen afgeleid van menselijke embryonale stamcellen. Onze diertechnicus, Monica Aronsson, houdt het konijn in positie zodat we de retina kunnen visualiseren en afbeelden met optische coherentietomografie. Na het anestheseren van een konijn volgens het tekstprotocol, plaats het konijn onder de operatiemicroscoop met de kop naar de chirurg gericht.Gebruik vervolgens een ooglidspreizer om de oogleden te verwijderen en een steriele doek om het nictitansmembraan te verwijderen. Voor microchirurgie gebruikt u een tweepoorts of optionele driepoorts 25-gauge transvitreale pars plana-techniek met niet-gevalveerde trocars voor het inbrengen van microchirurgische instrumenten. De multifunctionele vitrectomiemachine heeft poorten om een infuuscanule, endo-illuminatie, een vitrector en een endolaser aan te sluiten.Voor subretinale injecties is alleen de endo-illuminatie verplicht, wat een tweepoorts setup voldoende maakt. Gebruik een klotstang om de conjunctiva vast te pakken en te verplaatsen, over de inbrengplaats te trekken. Plaats transscleraal een van de twee bovenste trocars, één tot twee millimeter vanaf de limbus, onder een hoek van dertig tot veertig graden parallel aan de limbus.Ga verder met het inbrengen van de trocar tot het midden van de punt. Draai vervolgens de trocar negentig graden en breng hem in het oog, gericht op de achterste pool. Dit voorkomt postoperatieve lekkage uit deze sclerotomie en vermindert ook het risico op endoftalmitis.Herhaal dit met de tweede bovenste trocar. Bij het inbrengen van de trocar is het belangrijk om één tot twee millimeter van de limbus te zijn om de inbreng te tunnelen en gericht op de achterste pool te zijn om het risico op infectie, vitreuze bloeding, retinale loslating en lensaanraking te minimaliseren. Breng synthetische tranen aan als een contractgel op het hoornvlies en plaats vervolgens een wegwerp contactlens op het hoornvlies om de retina te visualiseren.Laat vervolgens vijfhonderd microliter natriumjodaat druppelen in een spuit van één milliliter die is aangesloten op een verlengbuis die wordt bediend door een assistent en een 38-gauge poly-tip canula die wordt bediend door de chirurg. Breng de endo-illuminatieprobe door de linker bovenste trocar in. Breng vervolgens de injectiecanula in door de rechter bovenste trocar en breng de canula door het glasvochtruimte naar de retina, gericht op het gebied net onder de kop van de optische zenuw.Laat de punt van de canula langzaam de retina aanraken totdat een focale verkleurende zichtbaar is. Laat de canula niet de retina binnendringen, omdat dit bloedingen kan veroorzaken. Nu, door de retina met de naald te doorboren, injecteert u vijftig microliter natriumjodaat subretinaal gedurende een periode van vijf seconden.Aangezien er een natuurlijke splitsingsvlak is tussen de retina en de onderliggende choroidea, zou een duidelijk zichtbare semi-transparante blister geleidelijk moeten vormen tijdens de injectie. Tijdens het injecteren, trekt u langzaam de naald terug, maar zorg ervoor dat de punt binnen de blister blijft om reflux te minimaliseren. Na verwijdering van de endo-illuminatie en injectiecanula, gebruikt u klotstangen om de trocars te verwijderen.Gebruik vervolgens het punt, of het stompe uiteinde van de klosstang, om dertig seconden lang lichte druk uit te oefenen op de zacht sluitende, naaldvrije sclerotomie. Tijdens het herstel, zorgt u volgens het tekstprotocol voor het dier en wacht u zeven dagen voor de transplantatie. Zeven dagen na injectie van natriumjodaat en na toediening van intravitreale Triamcinolon, volgens het tekstprotocol, verwijdert u het celdifferentiatiemedium van een confluente hESC-RPE-monolaag van een 24-well en gebruikt u vijfhonderd microliter PBS zonder calcium en magnesium om elke well te wassen.Nadat de cellen zijn trypsiniseerd, kantel de plaat en verwijder voorzichtig het trypsine om de cellen aan de plaat te laten hechten. Verzamel de cellen in achthonderd microliter vers, op 37 graden Celsius voorverwarmd differentiatiemedium door voorzichtig te pipetteren, of zelfs te schrapen indien nodig, om een enkele cel suspensie te verkrijgen. Gebruikend nulpunt twee procent trypanblauw, telt u de cellen in een hemocytometerkamer volgens de instructies van de fabrikant.Voeg vervolgens vijf milliliter differentiatiemedium toe aan de celsuspensie en centrifugeert u de cellen bij driehonderd keer g, bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Gooi het supernatant weg en suspendeer de pellet opnieuw in vers gefilterd steriel PBS met een eindconcentratie van duizend cellen per microliter. Verdeel de eerdere celsuspensie in zeshonderd microliter aliquots en bewaar ze op ijs tot en tijdens de operatie.Nadat het konijn is geanesthetiseerd en de pupillen zijn verwijd volgens het tekstprotocol, plaats het konijn met de kop naar de chirurg gericht. Gebruik de ooglidspreizer om de oogleden te verwijderen en een steriele doek om het nictitansmembraan te verwijderen. Voor microchirurgie, gebruik een tweepoorts of optionele driepoorts 25-gauge transvitreale pars plana-techniek met trocars geplaatst in dezelfde posities zoals eerder in deze video is gedemonstreerd.Als de vorige sclerotomies zichtbaar zijn, voert u de trocarinbrenging uit net naast, maar niet door deze inbrengplaatsen uit om het risico op postoperatieve lekkage te minimaliseren. Breng synthetische tranen aan op het oog zoals eerder en plaats een wegwerp

subretinal-transplantation-human-embryonic-stem-cell-derived-retinal

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Celtransplantatie vertegenwoordigt een strategie voor de behandeling van netvliesdegeneratie die wordt gekenmerkt door fotoreceptorverlies. Hier beschrijven we een methode voor verrijking van transplanteerbare fotoreceptoren en hun subretinale enting in volwassen muizen.

Subretinale transplantatie van MACS gezuiverde fotoreceptor precursor cellen in de volwassen muis retina

Hier presenteren we een door de gemeenschap geaccepteerd protocol in multimedia-formaat voor het subretinaal injecteren van een bolus RPE-cellen bij ratten en muizen. Deze aanpak kan worden gebruikt voor het bepalen van reddingspotentieel, veiligheidsprofielen en overlevingscapaciteiten van getransplanteerde RPE-cellen bij implantatie in diermodellen van retinale degeneratie.

Presterende Subretinal Injecties in Knaagdieren om retinale pigment epitheel cellen leveren in Suspension

Netvliespigmentepitheel (RPE) vervangende strategieën en gen-gebaseerde therapie in aanmerking komen voor een aantal retinale degeneratieve aandoeningen. Voor klinische toepassing worden grote oog dierlijke modellen moeten chirurgische technieken bij patiënten toepassing bestuderen. Hier presenteren we een konijnenmodel voor subretinale chirurgie gericht RPE transplantatie, die veelzijdig en kostenefficiënt.

Een Step by Step Protocol voor Subretinal Surgery in Rabbits

Subretinal injectie is veel toegepast in preklinische studies van stamcel substitutietherapie voor leeftijdsgebonden maculaire degeneratie. In dit gevisualiseerde artikel beschrijven we een minder riskant, reproduceerbaar zijn en juist gewijzigd subretinal injectietechniek via de trans-scleral-benadering te leveren van cellen in de ogen van de rat.

Ontwikkeling van een verfijnde Protocol voor Trans-scleral Subretinal transplantatie van menselijke retinale Pigment epitheliale cellen in de ogen van de Rat

Beschrijven we een methode om ingenieur een retinale weefsel samengesteld van retinale pigment epitheliale cellen afgeleid van menselijke pluripotente stamcellen gekweekt op de top van menselijke vruchtwater membranen en de voorbereiding voor de transplantatie in diermodellen.

Transplantatie-geschikt retinale Pigment epitheel Tissue Engineering afgeleid van menselijke embryonale stamcellen

Hier wordt een chirurgische techniek gepresenteerd voor het transplanteren van van menselijke pluripotente stamcellen (hPSC) afgeleid netvliesweefsel in de subretinale ruimte van een groot diermodel.

Subretinale transplantatie van menselijk embryonaal stamcel-afgeleid retinaal weefsel in een katachtig groot diermodel

De niet-menselijke primaat (NHP) is een ideaal model voor het bestuderen van menselijke retinale cellulaire therapieën vanwege de anatomische en genetische overeenkomsten. Dit manuscript beschrijft een methode voor submaculaire transplantatie van retinale pigmentepitheelcellen in het NHP-oog en strategieën om intraoperatieve complicaties geassocieerd met maculaire manipulatie te voorkomen.

Retinale pigmentepitheeltransplantatie in een niet-humaan primaatmodel voor degeneratieve retinale ziekten

Dit protocol presenteert een transpupillaire zichtgeleide transsclerale benadering om veilig en nauwkeurig subretinale cellulaire transplantaten af te leveren, met een laag aantal chirurgische complicaties, bij muizenontvangers met of zonder retinale degeneratie.

Transpupilgeleide transsclerale transplantatie van subretinale transplantaten in een muismodel voor retinale degeneratie

We beschrijven een gedetailleerd protocol voor de bereiding van post-gecryopreserveerde hESC-afgeleide fotoreceptor-voorlopercellen en de subretinale afgifte van deze cellen in rd10-muizen .

Subretinale toediening van van menselijke embryonale stamcellen afgeleide fotoreceptorvoorlopercellen bij RD10-muizen

Verspreiding van menselijke embryonale stamcellen (ES) cellen

Leer subretinale transplantatie van menselijke embryonale stamcel-afgeleide retinale pigment epitheelcellen in een grootogig konijnenmodel van geografische atrofie. Deze methode ondersteunt regeneratieve geneeskunde voor leeftijdsgebonden maculadegeneratie.

Subretinal transplantatie van menselijke embryonale stamcellen afgeleid-retinale Pigment epitheliale cellen in een grote-eyed Model van geografische atrofie (Video) | JoVE Journal

Subretinal transplantatie van menselijke embryonale stamcellen afgeleid-retinale Pigment epitheliale cellen in een grote-eyed Model van geografische atrofie

Meer video's verkennen