Subretinal transplantatie van menselijke embryonale stamcellen afgeleid-retinale Pigment epitheliale cellen in een grote-eyed Model van geografische atrofie
22 januari 2018
Retinale pigment epitheliale cellen kunnen dienen als een cel-vervangende therapie voor de geavanceerde vorm van droge leeftijdsgebonden Macula degeneratie. Dit protocol beschrijft de generatie van een grote-eyed model van geografische atrofie en subretinal transplantatie van menselijke embryonale stamcellen cel afkomstige retinale pigment epitheliale cellen in dit model van ziekte.
Het algemene doel van deze procedure is om een diermodel met grote ogen te creëren voor geografische atrofie om menselijke embryonale afgeleide retinale pigmentepitheelcellen in het oog te transplanteren en de integratie van donorcellen te beoordelen met behulp van optische coherentietomografie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvraagstukken op het gebied van regeneratieve geneeskunde, zoals behandeling op basis van stamcellen voor degeneratieve ziekten. Het grote voordeel van deze chirurgische setting is de onbeperkte bron van gezonde cellen en de chirurgische setting voor subretinale injectie, die veel overeenkomsten heeft met een procedure die bedoeld is voor patiënten.
De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie van leeftijdsgebonden maculaire degeneratie door de demonstratie van retinale pigmentepitheelcellen afgeleid van menselijke embryonale stamcellen. Onze diertechnicus, Monica Aronsson, houdt het konijn in positie zodat we de retina kunnen visualiseren en afbeelden met optische coherentietomografie. Na het anestheseren van een konijn volgens het tekstprotocol, plaats het konijn onder de operatiemicroscoop met de kop naar de chirurg gericht.
Gebruik vervolgens een ooglidspreizer om de oogleden te verwijderen en een steriele doek om het nictitansmembraan te verwijderen. Voor microchirurgie gebruikt u een tweepoorts of optionele driepoorts 25-gauge transvitreale pars plana-techniek met niet-gevalveerde trocars voor het inbrengen van microchirurgische instrumenten. De multifunctionele vitrectomiemachine heeft poorten om een infuuscanule, endo-illuminatie, een vitrector en een endolaser aan te sluiten.
Voor subretinale injecties is alleen de endo-illuminatie verplicht, wat een tweepoorts setup voldoende maakt. Gebruik een klotstang om de conjunctiva vast te pakken en te verplaatsen, over de inbrengplaats te trekken. Plaats transscleraal een van de twee bovenste trocars, één tot twee millimeter vanaf de limbus, onder een hoek van dertig tot veertig graden parallel aan de limbus.
Ga verder met het inbrengen van de trocar tot het midden van de punt. Draai vervolgens de trocar negentig graden en breng hem in het oog, gericht op de achterste pool. Dit voorkomt postoperatieve lekkage uit deze sclerotomie en vermindert ook het risico op endoftalmitis.
Herhaal dit met de tweede bovenste trocar. Bij het inbrengen van de trocar is het belangrijk om één tot twee millimeter van de limbus te zijn om de inbreng te tunnelen en gericht op de achterste pool te zijn om het risico op infectie, vitreuze bloeding, retinale loslating en lensaanraking te minimaliseren. Breng synthetische tranen aan als een contractgel op het hoornvlies en plaats vervolgens een wegwerp contactlens op het hoornvlies om de retina te visualiseren.
Laat vervolgens vijfhonderd microliter natriumjodaat druppelen in een spuit van één milliliter die is aangesloten op een verlengbuis die wordt bediend door een assistent en een 38-gauge poly-tip canula die wordt bediend door de chirurg. Breng de endo-illuminatieprobe door de linker bovenste trocar in. Breng vervolgens de injectiecanula in door de rechter bovenste trocar en breng de canula door het glasvochtruimte naar de retina, gericht op het gebied net onder de kop van de optische zenuw.
Laat de punt van de canula langzaam de retina aanraken totdat een focale verkleurende zichtbaar is. Laat de canula niet de retina binnendringen, omdat dit bloedingen kan veroorzaken. Nu, door de retina met de naald te doorboren, injecteert u vijftig microliter natriumjodaat subretinaal gedurende een periode van vijf seconden.
Aangezien er een natuurlijke splitsingsvlak is tussen de retina en de onderliggende choroidea, zou een duidelijk zichtbare semi-transparante blister geleidelijk moeten vormen tijdens de injectie. Tijdens het injecteren, trekt u langzaam de naald terug, maar zorg ervoor dat de punt binnen de blister blijft om reflux te minimaliseren. Na verwijdering van de endo-illuminatie en injectiecanula, gebruikt u klotstangen om de trocars te verwijderen.
Gebruik vervolgens het punt, of het stompe uiteinde van de klosstang, om dertig seconden lang lichte druk uit te oefenen op de zacht sluitende, naaldvrije sclerotomie. Tijdens het herstel, zorgt u volgens het tekstprotocol voor het dier en wacht u zeven dagen voor de transplantatie. Zeven dagen na injectie van natriumjodaat en na toediening van intravitreale Triamcinolon, volgens het tekstprotocol, verwijdert u het celdifferentiatiemedium van een confluente hESC-RPE-monolaag van een 24-well en gebruikt u vijfhonderd microliter PBS zonder calcium en magnesium om elke well te wassen.
Nadat de cellen zijn trypsiniseerd, kantel de plaat en verwijder voorzichtig het trypsine om de cellen aan de plaat te laten hechten. Verzamel de cellen in achthonderd microliter vers, op 37 graden Celsius voorverwarmd differentiatiemedium door voorzichtig te pipetteren, of zelfs te schrapen indien nodig, om een enkele cel suspensie te verkrijgen. Gebruikend nulpunt twee procent trypanblauw, telt u de cellen in een hemocytometerkamer volgens de instructies van de fabrikant.
Voeg vervolgens vijf milliliter differentiatiemedium toe aan de celsuspensie en centrifugeert u de cellen bij driehonderd keer g, bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Gooi het supernatant weg en suspendeer de pellet opnieuw in vers gefilterd steriel PBS met een eindconcentratie van duizend cellen per microliter. Verdeel de eerdere celsuspensie in zeshonderd microliter aliquots en bewaar ze op ijs tot en tijdens de operatie.
Nadat het konijn is geanesthetiseerd en de pupillen zijn verwijd volgens het tekstprotocol, plaats het konijn met de kop naar de chirurg gericht. Gebruik de ooglidspreizer om de oogleden te verwijderen en een steriele doek om het nictitansmembraan te verwijderen. Voor microchirurgie, gebruik een tweepoorts of optionele driepoorts 25-gauge transvitreale pars plana-techniek met trocars geplaatst in dezelfde posities zoals eerder in deze video is gedemonstreerd.
Als de vorige sclerotomies zichtbaar zijn, voert u de trocarinbrenging uit net naast, maar niet door deze inbrengplaatsen uit om het risico op postoperatieve lekkage te minimaliseren. Breng synthetische tranen aan op het oog zoals eerder en plaats een wegwerp
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een protocol voor het creëren van een model van geografische atrofie met grote ogen om de transplantatie van retinale pigmentepitheelcellen, afgeleid van menselijke embryonale stamcellen, te faciliteren. De integratie van deze cellen wordt beoordeeld met behulp van optische coherentietomografie, met als doel de regeneratieve geneeskunde voor maculadegeneratie door ouderdom te bevorderen.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Regeneratieve Geneeskunde
- Celvervangende Therapie
- Oogheelkunde
Achtergrond
- Leeftijdsgebonden maculadegeneratie is een belangrijke oorzaak van visusverlies.
- Retinale pigmentepitheelcellen zijn cruciaal voor de gezondheid van het netvlies.
- Stamceltherapie biedt potentie voor de behandeling van degeneratieve ziekten.
- Het creëren van een geschikt diermodel is essentieel voor het testen van therapieën.
Doel van de studie
- Om een diermodel met grote ogen te ontwikkelen voor geografische atrofie.
- Om de integratie van getransplanteerde retinale pigmentepitheelcellen te evalueren.
- Om het potentieel van stamcelgebaseerde behandelingen voor retinale ziekten te onderzoeken.
Gebruikte methoden
- Creatie van een model voor geografische atrofie met grote ogen.
- Subretinale transplantatie van cellen afgeleid van menselijke embryonale stamcellen.
- Beoordeling van de integratie van donorcellen via optische coherentietomografie.
- Gebruik van chirurgische technieken die vergelijkbaar zijn met die welke bedoeld zijn voor menselijke patiënten.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle transplantatie van retinaal pigmentepitheelcellen.
- Effectieve visualisatie van retinale structuren met behulp van optische coherentietomografie.
- Aangetoond potentieel voor celvervangingstherapie bij maculadegeneratie.
- Inzichten verschaft in de in vivo integratie van uit stamcellen afgeleide cellen.
Conclusies
- Het protocol biedt een veelbelovende benadering voor het bestuderen van retinale therapieën.
- Retinale pigmentepitheelcellen afgeleid van menselijke embryonale stamcellen vertonen potentieel voor de behandeling van degeneratieve aandoeningen.
- Dit model kan helpen bij het beantwoorden van kritieke vragen binnen de regeneratieve geneeskunde.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie
Dit protocol vestigt een klinisch relevant diermodel met grote ogen voor het evalueren van therapieën met retinaal pigmentepitheelcellen afgeleid van stamcellen bij geografische atrofie, een laatstadiummanifestatie van droge leeftijdsmaculadegeneratie. Door subretinale transplantatie en longitudinale multimodale beeldvorming mogelijk te maken, ondersteunt het de preklinische risicoreductie van celvervangingsstrategieën. De benadering slaat een brug tussen de validatie van targets in de ontdekkingsfase en de translationele beoordeling van functionele integratie en veiligheid in een ziekterelateerd systeem.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen te onderzoeken met betrekking tot de functie en overleving van RPE-cellen in een gedegenereerde retinaal micro-milieu.
- Operationele waarde: Biedt een reproduceerbaar chirurgisch model om de transplantatie, polarisatie en functionele ondersteuning van fotoreceptoren door donorcellen te beoordelen.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt mechanistische risicoreductie door de target engagement en biologische activiteit van hESC-RPE in vivo te valideren voorafgaand aan IND-estimerende studies.
Screening & assayontwikkeling
- Klaarheid voor analyse: Genereert gestandaardiseerde, kwantificeerbare structurele en functionele resultaten via SD-OCT, en-face SLO en blauw licht autofluorescentie om de integratie van het transplantaat en de degeneratie van het gasteretina te monitoren.
- Schaalbaarheid: De twee-poorts 25-gauge transvitreale pars plana-techniek maakt een consistente toediening van cel-suspensies over studiecohorten mogelijk, wat experimenten naar dosis-respons en timing ondersteunt.
- Herbruikbaarheid van het platform: Vastgestelde chirurgische en beeldvormende workflows kunnen worden aangepast voor het evalueren van andere celtypen, genetisch gemodificeerde RPE of combinatietherapieën in hetzelfde model.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor de ziekte: Het door NaIO3-geïnduceerde GA-achtig fenotype recapituleert belangrijke kenmerken van menselijke geografische atrofie, waaronder verlies van het RPE en verdunning van de buitenste retina, wat afstemming van translationele biomarkers mogelijk maakt.
- Preklinische continuïteit: Longitudinale beeldvorming vergemakkelijkt de beoordeling van graftstabiliteit, gastheerrespons en functioneel herstel over meerdere maanden, wat input biedt voor go/no-go-beslissingen voor de IND-aanvraag.
- Risicogestuurde voortgang: Integratiemetrieken afgeleid van OCT-laagsegmentatie en autofluorescentiepatronen bieden objectieve criteria voor het evalueren van het therapeutisch potentieel en veiligheidssignalen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het continuüm van ontdekking tot preklinische fase en ondersteunt de vroege validatie van uit stamcellen afgeleide RPE-producten voordat men overgaat naar GLP-toxicologie en opschaling van de productie.
- Discovery Biology: Test biologische risico-reducerende hypothesen door te beoordelen of getransplanteerde hESC-RPE overleven, integreren en degeneratie moduleren in een complexe weefselomgeving.
- Screening: Maakt gestandaardiseerde bereiding en toediening van celsuspensies mogelijk voor comparatieve evaluatie van verschillende differentiatieprotocollen of genetische modificaties.
- Analytics: Levert kwantitatieve, multimodale imaging-outputs (SD-OCT diktekaarten, en-face reflectie, autofluorescentie) die vergelijking tussen condities en longitudinale tracking mogelijk maken.
- Translationeel onderzoek: Verbindt de validatie van de stamcelbron met preklinische effectiviteitstests in een model met anatomische en chirurgische gelijkenis met menselijke procedures.
- Enterprise Reuse: De plaatsing van de chirurgische trocar, imaging-protocollen en procedures voor celverwerking vormen een herbruikbaar platform voor meerdere oogheelkundige celtherapieprogramma's.
Operationele impact en impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Biedt mechanistisch inzicht in cel-gastheerinteracties, waardoor ambiguïteit in het therapeutische mechanisme wordt verminderd en het vertrouwen in de validatie van doelwitmoleculen wordt versterkt.
- Operationele waarde: Standaardiseert de microsurgische techniek en beeldacquisitie, waardoor de reproduceerbaarheid tussen verschillende locaties verbetert en de variabiliteit in preklinische gegevens afneemt.
- Strategische waarde: Informeert de prioritering van de portfolio door vroegtijdig bewijs te leveren van biologische activiteit en de kwaliteit van de integratie in een klinisch voorspellend model.
- Impact op portfolio: Ondersteunt de risico-gecorrigeerde toewijzing van middelen door datagestuurde beslissingen mogelijk te maken over welke cellijnen of modificaties doorgaan naar kostbare IND-ondersteunende studies.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in vitreoretinale chirurgie, steriele microsurgische techniek en het hanteren van delicate oogweefsels.
- Afhankelijk van toegang tot spectral domain OCT met en-face SLO- en autofluorescentiecapaciteiten, samen met chirurgische microscopen en vitrectomiesystemen.
- Vraagt om gestandaardiseerde protocollen voor celvoorbereiding, inclusief trypsinisatie, wassen, aanpassing van de concentratie en steriel aliquoteren voor transplantatie.
- Vereist aanpassing van de trocarplaatsing en injectieparameters bij vertaling naar verschillende soorten of ziektemodellen met variërende ooganatomie.
- Beperkt door de chroniciteit van het NaIO3-model, dat mogelijk de progressie van GA bij mensen in een laat stadium niet volledig vastlegt, waardoor complementaire modellen nodig zijn voor langetermijnstudies.
Veelgestelde vragen over Biofarmaceutica
Chapters in this video
0:05
Title
1:12
Subretinal Injection of Sodium Iodate into a Large-eyed Animal Model
4:36
Subretinal Transplantation of hESC-RPE Cells in Treated Animals
7:35
In Vivo Retinal and Subretinal Imaging
8:47
Results: Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells
10:22
Conclusion
