Name: Dissectie en Explant cultuur van lymfkliertest Allantois voor de In Vitro analyse van allantoïs bijlage (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Leer de dissectie en explantcultuur van murine allantoïs voor in-vitro-analyse van allantoïshechting. Deze methode modelleert de eerste stap in placentavorming met α4β1-integrine.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd gesteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft SFB688 (aan A.G.).

Muis fokken werd goedgekeurd door de Regierung Unterfranken, en alle analyses werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met alle Duitse en Europese Unie geldende wetten en regelgeving inzake verzorging en het gebruik van proefdieren.
1. coating van de microtiterplaat platen met α4β1 integrine voor Ex Utero Allantois Explant cultuur
<ol><li>Het reconstrueren van het gelyofiliseerd lymfkliertest α4β1 integrine bij 200 µg/mL in steriel-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Verdun tot een eindconcentratie van 10 µg/mL in voorverwarmde (37 ° C) PBS. Pipetteer 20 µL per putje van de verdunde α4β1 integrine oplossing in het vereiste aantal putjes van de plaat van een microtiterplaat (1 allantois per putje). Opmerking: Vermijd de vorming van luchtbellen wanneer de putjes van de microtiterplaat plaat coating.</li>
	<li>Incubeer de platen van de microtiterplaat gedurende 60 minuten bij 37 ° C door ze te plaatsen in een bevochtigde weefselkweek incubator.</li>
	<li>Zorgvuldig gecombineerd het supernatant met een pipet. Gebruik zachte zuigkracht en helling van de plaat om te voorkomen dat de goed bodem met het puntje van de pipet aan te raken. Was de putjes goed tweemaal door het toevoegen van 50 µL voorverwarmde (37 ° C) kweekmedium zoals Dulbecco van bewerkt Eagle Medium (DMEM), en verwijder het medium wassen door zachte zuigkracht.</li>
	<li>Kritieke stap: blok bindend gratis sites door toevoeging van 50 µL per putje van 0,1% (g/v) bovien serumalbumine (BSA) / DMEM en incubeer gedurende ≥ 30 minuten bij 37 ° C door het plaatsen van de microtiterplaat platen in een bevochtigde weefselkweek incubator. Opmerking: Allantois explantaten kunnen koppelen aan verschillende oppervlakken in aanwezigheid van serum. Het is daarom noodzakelijk om het blokkeren van aspecifieke bandplaatsen, na coating explant de putjes met integrine en voordat u toevoegt de ontleed allantois voor cultuur in het serum-bevattende medium (zie stap 4.4).</li>
	<li>Houd de gecoate putjes in de blokkerende oplossing bij 37 ° C totdat nodig in stap 4.4.</li>
</ol>2. baarmoeder dissectie van een zwangere muis op Dpc 8
Opmerking: Verminderen vals-positieve zwangerschapscijfers door gewicht winst discriminatie15.
<ol><li>Offeren de muis door cervicale dislocatie. Desinfecteer de vacht in de buikstreek door het spuiten met ethanol 70% (v/v). Opmerking: Draag handschoenen bij het verwerken van muizen. Euthanasie door cervicale dislocatie zonder verdoving voorkomt chemische verontreiniging van de allantois, die allantois bijlage kan verstoren.</li>
	<li>Open de buikhuid doordat een kleine incisie in de schouderstreek met een schaar. Gehandschoende vingers gebruiken om te houden van de huid boven en onder de incisie, en trek de huid uit elkaar naar de borst en de staart van de muis.</li>
	<li>Pak het buikvlies met een tang. Met de andere hand, maak een V-vormige insnijding van anterior naar posterior met behulp van schaar en verplaats het weefsel weg te bloot van de buikholte. Gebruik de verlostang om te duwen van de darmen aan de ene kant om toegang tot de baarmoeder te krijgen.</li>
	<li>Zoek de twee baarmoeder horens. Houd de baarmoederhals (het caudal segment) met een tang en de ligamenten snijd met een fijn schaar. Los vervolgens beide baarmoeder horens door doorsnijden omvat de oviducts met een schaar.</li>
	<li>Gebruik pincet overdracht van de baarmoeder in een steriele 10 cm schotel met steriel PBS kamertemperatuur (RT). Het verwijderen van het vetweefsel, de schepen en de zenuwen rondom de baarmoeder horens met fijne pincet en/of schaar (figuur 1A).</li>
</ol>3. de embryo dissectie
Opmerking: Voer de volgende stappen uit onder een stereomicroscoop uitgerust met een zoombereik van 8:1.
<ol><li>Scheid de embryo's door te snijden tussen de implantatie-sites met een schaar. Begrijpen van de gespierde baarmoederslijmvlies van de baarmoeder-toppen met een tang en trek hem uit elkaar om de decidua (figuur 1B) bloot te stellen.</li>
	<li>Met behulp van Tang, breng de baarmoeder knoppen in een nieuwe 10 cm schotel met steriele, RT PBS.</li>
	<li>Fix de decidua rond het embryo met de uiteinden van het pincet.</li>
	<li>Maken van een incisie aan de kant van de anti-mesometrial van de decidua met fijne pincet (Figuur 1 c), en schil de decidua weg met een tang aan het blootstellen van het embryo (Figuur 1 d). Opmerking: De pool van de mesometrial van de decidua is zeer gevacuoliseerd en kan verder op het basis dan het deel van de anti-mesometrial, die het embryo bevat en het lijkt bleker.</li>
	<li>Het ontleden van het embryo met een tang (figuur 1E, F).</li>
	<li>Met behulp van een micro-spoon, breng het embryo in een daling van steriele PBS vervat in een steriele 3,5 cm schotel.</li>
	<li>Het embryo overboeken naar een verse daling van PBS in de dezelfde 3,5 cm schotel met behulp van een micro-spoon, en het ontleden van het embryo van de dooierzak met pincet (figuur 1G, H).</li>
	<li>Optioneel, indien nodig (bijvoorbeeldvoor genotypering door de Kettingreactie van de polymerase), breng de dooierzak in een steriele buis door aspirating met ~ 5 µL PBS in een grote opening 200 µL pipette uiteinde. Winkel bij-20 ° C. Opmerking: Moederlijke weefsel (dat wil zeggen, de pariëtale dooierzak waaronder Reichert van membraan en de ectoplacental-kegel) dat de dooierzak voorbereiding besmetten kan kan leiden tot onjuiste genotypering resultaten. Verwijdering van deze weefsels is makkelijkste vóór de embryo dissectie van de dooierzak.</li>
</ol>4. allantois dissectie en Ex Utero cultuur op geïmmobiliseerdet α4β1 integrine
<ol><li>Snijd de allantois van de site van de basale invoeging posterieure eind van het embryo met fijne pincet (Figuur 1 H).</li>
	<li>Optioneel, als ontwikkelings enscenering vereist is, tellen de Somiet paren van het embryo visuele inspectie met behulp van een Microscoop uitgerust met fase contrast optiek en een 5 × 10 × doelstelling. Opmerking: Het embryo kan worden uitgebreid met een tang om Somiet tellen. Chorion gehechtheid en fusie plaatsvinden tussen E 8.0 en 9.0 E in embryo's met ≥ 6 Somiet paren. Draaien begint in embryo's met 6-8 Somiet paren.</li>
	<li>Pipetteer 40 µL per putje van DMEM aangevuld met 10% (v/v) foetale runderserum, L-glutamine en antibiotica in het vereiste aantal vooraf gecoate microtiterplaat plaat wells (zie paragraaf 1).</li>
	<li>Verzamelen van de zwevende allantois door aspirating met ~ 5 µL PBS in een grote opening voor een 200 µL pipette uiteinde. Breng 1 allantois per putje.</li>
	<li>Incubeer de allantoides door het plaatsen van de microtiterplaat platen in een bevochtigde weefselkweek incubator (37 ° C, 5% CO2) voor bv6, 12 en 24 h. Ter vermijding van interferentie met allantois bijlage, Verplaats niet de microtiterplaat platen tussen de punten van deze tijd.</li>
	<li>Score op elk tijdstip, allantois bijlage (b.v., geen bijlage/zwevend allantois gedeeltelijk of volledig aangesloten allantois; volledig verspreiding allantois) met behulp van een Microscoop uitgerust met fase contrast of differentieel interferentie contrast optiek en een 5 × of 10 × doelstelling (Figuur 2). Opmerking: Representatieve voorbeelden van vers geïsoleerd en volledig aangesloten allantoides staan in Figuur 2. Ex utero, hecht het distale uiteinde van allantoides geïsoleerd van wildtype C57BL/6J muizen binnen 4-6 uur (dit is bedoeld als gedeeltelijke bijlage van de allantois), en volledige bevestiging van het hele allantois wordt bereikt binnen ~ 12u van cultuur. Door 18-24 h, heeft de explant afgevlakt en een ronde vorm (bedoeld om uit te spreiden als volledig allantois) met een CD31-positief vasculaire plexus9,16aangenomen.</li>
</ol>5. confirmatieve kleuring van het transplanteren Allantois voor de CD31 van de Marker Endothelial cel
<ol><li>Gecombineerd het kweekmedium van volledig verspreiding explantaten en monteren van de cellen door 40 µL per putje van 4% (m/v) paraformaldehyde/PBS toe te voegen. Opmerking: Paraformaldehyde is giftig. Draag handschoenen en veiligheidsbril voor huid- en oogcontact vermijden.</li>
	<li>Incubeer gedurende 10 min op RT, waarna het supernatant gecombineerd. Spoel driemaal door 40 µL per putje van PBS toe te voegen, en het wassen-medium verwijderen door zachte zuigkracht.</li>
	<li>Permeabilize van de cellen en blokkeren van aspecifieke bandplaatsen door toevoeging van 40 µL per putje van 0,1% (v/v) serum van de normale geit Triton X-100/0.1% (m/v) BSA/10% (v/v) in PBS voor 30 min op RT. Wash tweemaal door het toevoegen van 40 µL per putje van PBS, en het wassen-medium verwijderen door zachte zuigkracht. Opmerking: Het protocol kan worden gepauzeerd 's nachts op dit punt.</li>
	<li>Vlekken van cellen door het toevoegen van 20 µL per putje van primaire anti-CD31 antilichamen verdund tot 1:50 in 0,1% (g/v) BSA/PBS's nachts bij 4 ° C. Spoel driemaal door 40 µL per putje van PBS toe te voegen, en het wassen-medium verwijderen door zachte zuigkracht.</li>
	<li>Opsporing van afhankelijke primaire antilichamen door toevoeging van 20 µL per putje van secundaire geit fluorescently gelabelde antilichamen anti-rat verdunde 1:200 in 0,1% (g/v) BSA/PBS voor 1 h op RT. Protect microtiterplaat platen van licht door inwikkeling in aluminiumfolie of door het plaatsen in een donkere kamer. Spoel driemaal door 40 µL per putje van PBS toe te voegen, en het wassen-medium verwijderen door zachte zuigkracht.</li>
	<li>Insluiten cellen door 20 µL per putje van montage medium toe te voegen. Incubeer gedurende ~ 1 h bij RT totdat het montage medium heeft verhard. Opslaan microtiterplaat platen op RT of bij 4 ° C, beschermd tegen licht.</li>
	<li>Beeld de vasculaire plexus van de allantois explants onder een fluorescentie Microscoop uitgerust met een 5 × of 10 × doelstelling en geschikt fluorescentie filters. Opmerking: Representatieve beelden van de CD31-positieve vasculaire plexus van een volledig verspreiding allantois zijn afgebeeld in Figuur 3. Andere markeringen voor de vasculaire plexus, zoals antilichamen gericht tegen Flk-1, Flt, Tie-1 of Tie-2 kan worden gebruikt als goed16.</li>
</ol>

<ol><li>Rossant, J., Cross, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placental+development%3A+lessons+from+mouse+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Placental development: lessons from mouse mutants.</a> Nat Rev Genet. 2 (7), 538-548 (2001).</li>
<li>Segerer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+developmental+function+for+murine+phosphoglycolate+phosphatase+in+safeguarding+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">An essential developmental function for murine phosphoglycolate phosphatase in safeguarding cell proliferation.</a> Sci Rep. 6, 35160(2016).</li>
<li>Kane, S. V., Acquah, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placental+transport+of+immunoglobulins%3A+a+clinical+review+for+gastroenterologists+who+prescribe+therapeutic+monoclonal+antibodies+to+women+during+conception+and+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Placental transport of immunoglobulins: a clinical review for gastroenterologists who prescribe therapeutic monoclonal antibodies to women during conception and pregnancy.</a> Am J Gastroenterol. 104 (1), 228-233 (2009).</li>
<li>Xu, X., Vugmeyster, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+and+opportunities+in+absorption%2C+distribution%2C+metabolism%2C+and+excretion+studies+of+therapeutic+biologics%5BTitle%5D)+AND+%22AAPS+J%22%5BJournal%5D)">Challenges and opportunities in absorption, distribution, metabolism, and excretion studies of therapeutic biologics.</a> AAPS J. 14 (4), 781-791 (2012).</li>
<li>Wesolowski, S. R., Kasmi, K. C., Jonscher, K. R., Friedman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+origins+of+NAFLD%3A+a+womb+with+a+clue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Developmental origins of NAFLD: a womb with a clue.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 14 (2), 81-96 (2017).</li>
<li>Racicot, K., Mor, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risks+associated+with+viral+infections+during+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Risks associated with viral infections during pregnancy.</a> J Clin Invest. 127 (5), 1591-1599 (2017).</li>
<li>Grandjean, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life-Long+Implications+of+Developmental+Exposure+to+Environmental+Stressors%3A+New+Perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Life-Long Implications of Developmental Exposure to Environmental Stressors: New Perspectives.</a> Endocrinology. 156 (10), 3408-3415 (2015).</li>
<li>Inman, K. E., Downs, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+murine+allantois%3A+emerging+paradigms+in+development+of+the+mammalian+umbilical+cord+and+its+relation+to+the+fetus%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">The murine allantois: emerging paradigms in development of the mammalian umbilical cord and its relation to the fetus.</a> Genesis. 45 (5), 237-258 (2007).</li>
<li>Arora, R., Papaioannou, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+murine+allantois%3A+a+model+system+for+the+study+of+blood+vessel+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The murine allantois: a model system for the study of blood vessel formation.</a> Blood. 120 (13), 2562-2572 (2012).</li>
<li>Watson, E. D., Cross, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+structures+and+transport+functions+in+the+mouse+placenta%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Development of structures and transport functions in the mouse placenta.</a> Physiology (Bethesda). 20, 180-193 (2005).</li>
<li>Yang, J. T., Rayburn, H., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion+events+mediated+by+alpha+4+integrins+are+essential+in+placental+and+cardiac+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion events mediated by alpha 4 integrins are essential in placental and cardiac development.</a> Development. 121 (2), 549-560 (1995).</li>
<li>Gurtner, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+the+murine+VCAM1+gene%3A+essential+role+of+VCAM-1+in+chorioallantoic+fusion+and+placentation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of the murine VCAM1 gene: essential role of VCAM-1 in chorioallantoic fusion and placentation.</a> Genes & development. 9 (1), 1-14 (1995).</li>
<li>Kwee, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+development+of+the+embryonic+and+extraembryonic+circulatory+systems+in+vascular+cell+adhesion+molecule+%28VCAM-1%29+deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Defective development of the embryonic and extraembryonic circulatory systems in vascular cell adhesion molecule (VCAM-1) deficient mice.</a> Development. 121 (2), 489-503 (1995).</li>
<li>Downs, K. M., Gardner, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+investigation+into+early+placental+ontogeny%3A+allantoic+attachment+to+the+chorion+is+selective+and+developmentally+regulated%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">An investigation into early placental ontogeny: allantoic attachment to the chorion is selective and developmentally regulated.</a> Development. 121 (2), 407-416 (1995).</li>
<li>Heyne, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+reliable+method+for+early+pregnancy+detection+in+inbred+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Assoc+Lab+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">A simple and reliable method for early pregnancy detection in inbred mice.</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 54 (4), 368-371 (2015).</li>
<li>Downs, K. M., Temkin, R., Gifford, S., McHugh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+the+murine+allantois+by+allantoic+explants%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Study of the murine allantois by allantoic explants.</a> Dev Biol. 233 (2), 347-364 (2001).</li>
<li>Hou, W., Sarikaya, D. P., Jerome-Majewska, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+culture+of+pre-placental+tissues+reveals+that+the+allantois+is+required+for+maintained+expression+of+Gcm1+and+Tpbpalpha%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Ex vivo culture of pre-placental tissues reveals that the allantois is required for maintained expression of Gcm1 and Tpbpalpha.</a> Placenta. 47, 12-23 (2016).</li>
<li>Zeigler, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+allantois+and+chorion%2C+when+isolated+before+circulation+or+chorio-allantoic+fusion%2C+have+hematopoietic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The allantois and chorion, when isolated before circulation or chorio-allantoic fusion, have hematopoietic potential.</a> Development. 133 (21), 4183-4192 (2006).</li>
<li>Zaidel-Bar, R., Itzkovitz, S., Ma'ayan, A., Iyengar, R., Geiger, B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17671451">Functional atlas of the integrin adhesome.</a> Nature cell biology. 9 (8), 858-867 (2007).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In aanwezigheid van serum, die een rijke bron van Pro-lijm extracellulaire matrix moleculen zoals fibronectin is, zal allantois explantaten gemakkelijk hechten aan verschillende kunststof, glas of9,16van de oppervlakken van de filter. Als het doel van de uitgevoerde test is te specifiek onderzoeken van het effect van een genetische modificatie of iedere andere behandeling op allantois gehechtheid aan geïmmobiliseerd α4β1, is het dus cruciaal voor het blokkeren va...

De placenta is onmisbaar voor embryonale groei en ontwikkeling in de baarmoeder omgeving. Het vormt de interface voor zuurstof, metaboliet, en voedende gegevensuitwisseling tussen de foetale en maternale circulatie, en ook functies als endocriene en immunologisch orgaan. Een endogene of exogene belediging dat belemmert de ontwikkeling van de placenta kan leiden tot uteriene groei retardatie, foetale verlies of zwangerschapscomplicaties, zowel in mens1in muizen. Terwijl het aantal gerichte muis mutaties die leiden abnormale placenta fysiologie tot blijft toenemen2, met 219 genotypen momenteel vermeld op de website van de muis genoom informatica (MGI) (http://www.informatics.jax.org/vocab/ mp_ontology / MP:0010038), veel van deze fenotypen zijn niet goed wordt begrepen vanuit een mechanistische oogpunt. Naast genetische veranderingen, klein molecuul drugs, monoklonale antilichamen, toxinen, ziekteverwekkers, overtollige metabolieten of verschillende milieu-agentia kunnen invloed op de ontwikkeling van de placenta en functie3,4,5 , 6 , 7. toch eenvoudig in vitro testen dat model kritische stappen in de ontwikkeling van de placenta schaars zijn.
Lymfkliertest placenta ontwikkeling wordt gestart in de vroege midgestation, wanneer de allantois (de ontwikkelingstoxiciteit voorloper van de navelstreng) komt naar voren uit het posterieure einde van het embryo als een knop die naar de chorion-8 groeit. Chorioadhesive cellen in de buitenste laag van de allantoïs kiem bemiddelen de gehechtheid en de verspreiding van de allantois op het oppervlak van het chorion (chorion "fusion"). De chorion vouwen vervolgens in villi waarin de therapieën van de allantois groeit om te vormen van het labyrint, de placenta binnenlaag waar voedingsstoffen en zuurstof uitgewisseld tussen dicht naast elkaar geplaatste moederlijk bloed sinusoïdes en embryonale vaartuigen9 ,10.
De bevestiging van de allantois aan de chorion is de eerste en essentiële stap in labyrint vorming en gebreken in dit proces behoren tot de meest voorkomende oorzaken van embryonale letaliteit in midgestation1. Hoewel een aantal mutanten muis hebben beschreven waar chorion gehechtheid mislukt optreden van10en de MGI-database bevat momenteel 108 muis mutanten die worden gekenmerkt door abnormale chorion fusion (http:// www.Informatics.Jax.org/vocab/mp_ontology/MP:0002824), de intercellulaire interactie tussen de vasculaire cel adhesie molecuul-1 (VCAM-1, uitgedrukt op het allantoïs mesoderm) en α4β1 integrine (uitgedrukt op de chorionic mesothelium, die is afgeleid van extraembryonic mesoderm) lijkt te zijn onmisbaar voor het chorion gehechtheid en fusion11,12,13. Immunohistochemische kleuring van geheel-mount wild-type embryo's is gebleken dat VCAM-1 wordt uitgedrukt in de distale tweederde van de allantoïs stengel op ongeveer embryonale dag (E) 7,513 (1-4 Somiet fase), en dat haar expressie hoog blijft tijdens het chorion gehechtheid en -fusion11,12. Gebrek allantoïs gehechtheid aan het chorion wordt normaal gesproken gedetecteerd door histologische analyses van baarmoeder toppen. Echter, allantois maten zijn fysiologisch zeer variabel in tussen, en zelfs binnen de nesten van de dezelfde ontwikkelingsstadium14, en de allantois kunt alleen toevoegen aan de chorion wanneer het een voldoende omvang te maken van fysiek contact heeft bereikt. Als gevolg van deze natuurlijke variabiliteit, chorion bijlage vindt plaats ergens tussen ~ E 8.0 en 9.0 E in uteroen een statistisch betrouwbare evaluatie van dit proces door histologie is daarom afhankelijk van de analyse van een groot aantal conceptuses verkrijgen van voldoende exemplaren op de juiste ontwikkelingsstadium.
Hier beschrijven we een methode om te beoordelen allantoïs bijlage ex utero dat is minder afhankelijk van de grootte van de allantois. We tonen de dissectie van muis embryo's en hun allantoides uit de baarmoeders van zwangere muizen ~ 8 dagen post coitum (dpc; dpc 0,5 geeft de detectie van een vaginale plug), en de daaropvolgende cultuur van allantois explants op geïmmobiliseerdet α4β1 Integrins. Deze methode maakt een snelle, functionele evaluatie van de bijlage en het verspreiden van gedrag van meerdere allantois explantaten parallel en op verschillende opeenvolgende tijdstippen. Het protocol kan worden gebruikt aan het scherm voor de gevolgen van gerichte mutaties, drugs of verschillende omgevingsfactoren voor allantois bijlage ex vivo.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6J wildtype muizen</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>Stock No:&nbsp;000664</td><td></td></tr><tr><td>70 % (v/v) Ethanol</td><td>VWR International</td><td>930031006</td><td></td></tr><tr><td>Standaard patroon forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td>Forceps gebruikt om de buikholte te openen.</td></tr><tr><td>Micro dissecterende forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td>Dumont # 5 medische biologie forceps met fijne, scherpe punt. </td></tr><tr><td>Fijne schaar&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>14094-11</td><td>Rechte bladen.</td></tr><tr><td>Veer schaar&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>15012-12</td><td>Noyes veer schaar met 14 mm bladen voor de dissectie van uterusknoppen.</td></tr><tr><td>Microlepel</td><td>Carl Roth</td><td>AT18.1</td><td>5 mm Lepel diameter.</td></tr><tr><td>Microtiter platen</td><td>ibidi</td><td>81501</td><td>We gebruiken ongecoate, steriele angiogenese slides (intern volume 50 &micro;L) met een hydrofobe oppervlakte die niet is behandeld voor weefselkweek om niet-&#945;4&#946;1-gemedieerde binding aan plastic te verminderen.</td></tr><tr><td>10 cm schaal</td><td>Nunc</td><td>150350</td><td>Steriele weefselkweek schotels.</td></tr><tr><td>3.5 cm schaal</td><td>Nunc</td><td>150288</td><td>Steriele weefselkweek schotels.</td></tr><tr><td>Grote opening pipetten tips&nbsp;</td><td>Biozym</td><td>VT0140X</td><td>Laag bindende pipetten tips, 200 &micro;L.</td></tr><tr><td>&#945;4&#946;1 integrin</td><td>R&amp;D Systems</td><td>6054-A4</td><td>Murine &#945;4&#946;1 integrin recombinant geëxpresseerd en gezuiverd uit een Chinese hamster eierstokken cel lijn.</td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537</td><td>Zonder Ca2+ en Mg2+.</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-03600</td><td>De formulering bevat 4,5 g/L glucose, 110 mg/L natriumpyruvaat en 3,7 g/L NaHCO3 maar geen L-glutamine, die apart wordt toegevoegd.</td></tr><tr><td>Penicilline/Streptomycine</td><td>Gibco (ThermoFisher Scientific)</td><td>15140-122</td><td>100 x (10.000 U/mL Penicilline en 10.000 &micro;g/mL streptomycine) stockoplossing. Bereid en bewaar aliquoten bij -20 &deg;C om invriezen/ontdooien te voorkomen.</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-80100</td><td>100 x (200 mM) Stockoplossing. Bereid en bewaar aliquoten bij -20 &deg;C om invriezen/ontdooien te voorkomen.</td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum&nbsp;</td><td>Biochrom</td><td>S 0115</td><td>We gebruiken hitte-geïnactiveerd FBS (verhit tot 56 &deg;C gedurende 30 min met mixen om complement te inactiveren).</td></tr><tr><td>Bovine serum albumine (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7030</td><td>We gebruiken protease- en vetzuur-vrije albumine. Bereid een 0,1 % (w/v) oplossing in DMEM. Steriliseer de oplossing door een wegwerp cell cultuur filter met een 0,22 &micro;m porie grootte en laag eiwit-bindend membraan en bewaar aliquoten bij -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>para-Formaldehyde</td><td>Carl Roth</td><td>0335.2</td><td>Om een formaldehyde oplossing in PBS te maken, weeg para-formaldehyde poeder in een geventileerde kap en voeg het toe aan PBS voorverwarmd tot ca. 60 &deg;C in een beker op een roerplaat. Voeg 1 N NaOH druppelsgewijs toe tot de oplossing helder wordt. Laat de oplossing afkoelen tot kamertemperatuur en filter door een 0,22 mm filter spuit. Pas de pH aan met verdunde HCl tot ca. 6,9 en breng tot het eindvolume met PBS. We verdelen in aliquoten en bevriezen de oplossing, maar deze kan ook worden bewaard bij 4 &deg;C gedurende ongeveer vier weken. </td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td>Gebruik brede opening pipetten tips om onverdunde Triton X-100 te hanteren.</td></tr><tr><td>Normaal geitenserum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9023</td><td>Om niet-specifieke binding van antilichamen in immunofluorescentie analyses te blokkeren.</td></tr><tr><td>&#945;-CD31 Antilichamen</td><td>BD Biosciences</td><td>550274</td><td>Gezuiverde rat anti-muis monoclonale antilichamen, clone MEC 13.3.</td></tr><tr><td>Secundaire geiten anti-rat antilichamen</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-11006</td><td>Geiten anti-rat IgG (zware en lichte ketens), cross-geadsorbeerd, fluorescent gelabeld met Alexa Fluor 488. Andere fluorescente labels zijn ook mogelijk.</td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma Aldrich</td><td>81381</td><td>Montage medium voor cytochemie. MW ~31.000</td></tr><tr><td>Labovert&nbsp;</td><td>Leitz</td><td>Labovert&nbsp;</td><td>Inverteerde fasecontrast microscoop uitgerust met een 4 x en 10 x objectief voor het tellen van somietparen. Andere fasecontrast microscopen (zoals die die routinematig worden gebruikt in weefselkweek) zijn ook geschikt. &nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>M80</td><td>Leica Microsystems</td><td>M80</td><td>Stereomicroscoop met 8 : 1 zoombereik (met een vergroting tussen 7,5 x en 60 x) voor embryo en allantois dissectie.</td></tr><tr><td>DM4000B</td><td>Leica Microsystems</td><td>DM4000B</td><td>Microscoop systeem voor histologie met LED verlichting. We gebruiken HCX PL FLUOTAR 5 x/0.15 en HC PL FLUOTAR 10 x/0.30 objectieven. Andere microscopen uitgerust met fasecontrast en fluorescentie optica kunnen worden gebruikt om de allantois bevestiging te scoren. </td></tr><tr><td>Digitale camera</td><td>JVC</td><td>KY-F75U</td><td>3-CCD digitale camera aangesloten op de DM4000B LED microscoop. We gebruiken Diskus software (Hilgers) om zowel de microscoop als de camera te bedienen.</td></tr><tr><td>Confocale microscoop</td><td>Leica Microsystems</td><td>SP5</td><td>Confocale microscoop voor hogere resolutie beeldvorming van endothelia in het vasculaire plexus van all

dissectie en explant cultuur van lymfkliertest allantois voor de in vitro analyse van allantoïs bijlage

Dissection and Explant Culture of Murine Allantois for the In Vitro Analysis of Allantoic Attachment

De placenta is essentieel voor de groei en ontwikkeling van zoogdieren embryo's. Om deze reden vele genetische veranderingen en waarschijnlijk ook milieu beledigingen die verstoren de ontwikkeling van de placenta of functie kunnen leiden tot vroege zwangerschap verlies bij muizen en mensen. Niettemin, is het eenvoudig in vitro testen om te screenen op de mogelijke gevolgen voor de vorming van de placenta ontbreken. Hier, concentreren we op het modelleren van de eerste en essentiële stap in de vorming van de placenta, die uit de gehechtheid van de allantois aan het chorion bestaat. Beschrijven we een methode om snel beoordelen van de gehechtheid van allantoïs explantaten op geïmmobiliseerdet α4β1 integrine, die als een chorio-mimetische substraat fungeert. Deze aanpak in vitro kunnen een kwalitatieve evaluatie van de bijlage en het verspreiden van gedrag van meerdere allantois explantaten op verschillende opeenvolgende tijdstippen. Het protocol kan worden gebruikt voor het onderzoeken van het effect van gerichte muis mutaties, drugs of verschillende omgevingsfactoren die zijn gekoppeld aan de zwangerschapscomplicaties of foetus verlies op allantois bijlage ex vivo.

Dit protocol beschrijft een methode om te isoleren en explant lymfkliertest allantoides ex vivo, en details van de kwalitatieve beoordeling van allantois gehechtheid aan α4β1 integrine, een kritische proces tijdens in vivo chorion fusion. De representatieve resultaten die worden weergegeven in figuur 1A-H tonen de opeenvolgende stappen van isolatie van de allantois vanaf de zwangere baarmoeder. Maternale wee...

We beschrijven een in vitro assay model chorion gehechtheid, de eerste stap in de vorming van de placenta. Het protocol blijkt de dissectie en explant cultuur van lymfkliertest allantoides op geïmmobiliseerdet α4β1 integrine. Allantois bijlage wordt microscopisch beoordeeld op vooraf bepaalde tijdstippen.

Dissectie en Explant cultuur van lymfkliertest Allantois voor de In Vitro analyse van allantoïs bijlage

The placenta is essential for the growth and development of mammalian embryos. For this reason, numerous genetic alterations and likely also environmental ...

Het algemene doel van deze procedure is de dissectie en explantcultuur van murine allantoïs voor de analyse van allantoïsche hechting in vitro. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van embryonale ontwikkeling bij zoogdieren, zoals de controle van allantoïsche hechting voor placentavorming. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de eerste en cruciale stap in placentavorming in vitro modelleert.De procedure wordt gedemonstreerd door Kerstin Hadamek, een techneut uit mijn laboratorium. Om de platen in te stellen, voeg eerst 20 microliter vers bereide Alpha 4/Beta 1-integrine-oplossing toe aan elk putje. Plan voor één allantoïs per putje.Deponeer geen oplossing met luchtbellen, omdat dit een goede coating verhindert. Na het laden van de putjes, incubeer de plaat een uur in een bevochtigde incubator. Na de incubatie, aspireer het supernatant van de putjes terwijl u de plaat schuin houdt, zodat de pipet de oplossing voorzichtig kan opzuigen zonder de bodem van de putjes te raken.Was vervolgens de putjes twee keer met 50 microliter warm kweekmedium. Gebruik zachte zuiging bij het verwijderen van het wasmedium. Breng 50 microlit

dissection-explant-culture-murine-allantois-for-vitro-analysis

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

De vroege embryonale long orgelcultuur is een zeer nuttig systeem om epitheliale-mesenchymale interacties te bestuderen. Zowel de epitheliale en mesenchymale morfogenese verloopt onder specifieke omstandigheden die gemakkelijk kunnen worden gemanipuleerd in dit systeem.

Muis embryonale Lung Cultuur, een systeem om de moleculaire mechanismen van Vertakken Evalueer

De craniale mesenchym ondergaat dramatische morfogenische bewegingen die waarschijnlijk zorgt voor een drijvende kracht voor verhoging van de neurale...

Een Explantatie Assay voor het beoordelen van cellulair gedrag van de craniale mesenchym

Primaire celkweek is een nuttige techniek voor het analyseren van specifieke populaties van cellen, in het bijzonder van transgene muis embryo's op specifieke ontwikkelingsstadia. Hierin zijn embryonale ventrikels ontleed en gedissocieerd en antilichaam-geconjugeerde kralen herkennen en scheiden de endotheelcellen voor verdere analyse.

Isolatie van embryonale ventriculaire endotheelcellen

We presenteren een ex vivo celmigratie analyse die exacte kwantificering van enterische neurale celmigratie potentieel in aanwezigheid van verschillende groeifactoren maakt.

Een kwantitatieve cel-migratie test voor Muriene Enterisch neurale voorlopercellen

We beschrijven de dissectie en ex vivo cultuur van muis embryonale huid. De cultuur systeem houdt een lucht-vloeistof-interface over het weefsel oppervlak en maakt beeldvorming op een omgekeerde microscoop. Melanoblasten, een component van de ontwikkeling huid, worden fluorescerend gemerkte waardoor hun gedrag wordt waargenomen met behulp van confocale microscopie.

Ex vivo cultuur van muis embryonale Huid en live-beeldvorming van melanoblast Migratie

Verbeterde beeldvormingstechnologie maakt driedimensionale beeldvorming van organen mogelijk tijdens de ontwikkeling. Hier beschrijven we een systeem voor de kweek van hele organen dat levende beeldvorming van de zich ontwikkelende villi in de foetale muizendarm mogelijk maakt.

Muis Foetale Hele Darm Cultuur System voor Ex Vivo Manipulatie van signaalwegen en Driedimensionale Live-Imaging van Villus Development

De ex vivo rechtopstaande druppelcultuur is een alternatief voor huidige in vitro en in vivo experimentele technieken. Dit protocol is eenvoudig uit te voeren en vereist kleinere hoeveelheden reagens, terwijl het de mogelijkheid biedt om foetale vasculaire vorming, morfogenese en organogene te manipuleren en te bestuderen.

Gebruik<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Upright Droplet Culturen van Whole Foetale organen Developmental processen te bestuderen tijdens Mouse Organogenese

Hematopoietische stamcellen en progenitorcellen (HSPC) afgeleid van gespecialiseerde (hemogenic) endotheelcellen tijdens de ontwikkeling, maar weinig bekend over het proces waarbij sommige endotheelcellen specificeren bloedvormende worden. We tonen een stroom-cytometrie-gebaseerde methode waarmee gelijktijdige isolatie van hemogenic endotheelcellen en HSPC van muizen embryonale weefsels.

Isolatie van muizen embryonale Hemogenic endotheelcellen

Een eenvoudige methode om primaire humane placenta (villi) en decidua orgaankweken vast is beschreven. Villous en deciduale orgel culturen zijn van onschatbare waarde tools voor het bestuderen van de pathogenese bij de mens maternale-foetale interface. Infectie met de facultatief intracellulaire bacterie Listeria monocytogenes wordt aangetoond.

Menselijke placenta en deciduale Organ culturen om infecties bij de moeder op foetus Interface Studie

We presenteren een methode voor de isolatie en de cultuur van de muis Wolffian kanaal (WD). We hebben ook een gedetailleerde procedure voor de hele berg immunokleuring van gekweekte / vers geïsoleerde WDS met fluorescent gelabelde antilichamen aan te tonen. Samen vormen deze technieken kan de studie van de WD ontwikkeling, oprollen, en differentiatie.

Orgelcultuur en Whole Mount immunofluorescentiekleuring van Muis gangen van Wolff

Dit protocol beschrijving van het gebruik van gekweekte Aorta-gonaden-Mesonephros voor expressie analyses, kolonie-vormende eenheden in de cultuur en milt, en op lange termijn reconstitutie om te bepalen van het effect van regelgevende factoren en signaalroutes op hematopoietische stamcellen cel ontwikkeling. Dit is aangetoond als een doeltreffend systeem voor het bestuderen van hematopoietische stamcelbiologie en functie.

Toepassing van de Aorta-gonaden-mesonephros Explant cultuur System in Developmental Hematopoiesis

Leer de dissectie en explantcultuur van murine allantoïs voor in-vitro-analyse van allantoïshechting. Deze methode modelleert de eerste stap in placentavorming met α4β1-integrine.

Dissectie en Explant cultuur van lymfkliertest Allantois voor de In Vitro analyse van allantoïs bijlage

Meer video's verkennen