Gelijktijdige onderscheid van monospecifieke en gemengde DFS70 patronen tijdens ANA Screening met een roman HEp-2 ELITE/DFS70 Knockout substraat
17 januari 2018
DFS70 autoantilichamen nabootsen gemeenschappelijk ziekte-geassocieerde antinuclear antilichaam patronen maken nauwkeurige interpretatie uitdaging bij het gebruik van conventionele HEp-2 substraten. Het protocol beschrijft de voordelen van roman gemanipuleerde HEp-2 substraat ten opzichte van conventionele HEp-2 in ANA screening en het registratienummer van de DFS70 patronen met hoge vertrouwen in zowel monospecifieke als gemengde ANA positieve gevallen.
Het algemene doel van deze procedure is om een verbeterde, indirecte immunofluorescentie-assay te demonstreren die een nieuwe HEp-2, dicht gespikkeld 70 knockout substraat gebruikt om antinucleaire auto-antilichamen te screenen en tegelijkertijd monospecifieke en gemengde, dicht gespikkelde 70 patronen te bevestigen. Het nieuwe HEp-2 substraat gebruikt een standaard, indirecte immunofluorescentieprocedure en interpretatiecriteria voor het screenen van klinisch relevante antinucleaire antilichamen, ook bekend als ANA's. Het grote voordeel is de mogelijkheid om het dichte, fijne gespikkelde 70-patroon te onderscheiden van ziekte-geassocieerde, homogene gespikkelde of uitdagende gemengde patronen in de screeningsfase.
De procedure zal worden gedemonstreerd door Sofia Badanin, een technicus van ons kwaliteitscontrolelaboratorium. Gebruik voor de substraatslides glazen slides met 12 putjes op elke slide, die ofwel conventionele HEp-2 cellen bevatten, of een mengsel van conventionele en dicht gespikkelde 70 knockout HEp-2 cellen. Laat de zakjes met de substraatslides gelijkmatig komen tot kamertemperatuur voor optimale prestaties en om condensatie van vocht op het oppervlak van de slide te voorkomen voordat de monsters worden toegevoegd.
Dit duurt ongeveer 10 tot 15 minuten. Zodra de slides zijn aangekomen op kamertemperatuur, verwijder voorzichtig de substraatslides met de vingers, vermijd contact tussen de slides en de zijkanten van de zak. Label de slides en plaats ze in een incubatiekamer die is bekleed met vochtige papieren handdoeken om uitdroging van de slides te voorkomen tijdens de incubatie van monsters en conjugaat.
Dosering van ongeveer 50 microliter van de negatieve en positieve controles, evenals de verdunde monsterserum op individuele putjes van de slide voordat de slides in de incubatiekamer worden geplaatst. De ANA-test is de eerste stap bij het screenen op een auto-immuunziekte. Het is van cruciaal belang dat kruisbesmetting van monsters van patiënten op de slide wordt vermeden om vals-positieve of vals-negatieve resultaten te minimaliseren.
Om kruisbesmetting van de putjes te voorkomen, vermijd het overvullen van de putjes. Plaats het deksel op de incubatiekamer en incubeer de slides gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Als er ANA aanwezig is in het serum van de patiënt, zal het zich gedurende deze tijd binden aan de cellen die in elke put aanwezig zijn.
Zodra de incubatietijd voorbij is, verwijder de slide uit de incubatiekamer. Houd de slide vast aan het label en spoel voorzichtig gedurende 10 tot 15 seconden met ongeveer 10 milliliter van de gereconstitueerde fosfaatbuffer oplossing spoelbuffer. Breng de slide onmiddellijk over in een Coplin-pot met PBS spoelbuffer en laat 10 minuten weken.
Herhaal het proces met alle resterende slides. Verwijder slechts één slide tegelijk uit de Coplin-pot. Om het overtollige PBS spoelbuffer van de slide te verwijderen, tik of dep de slide voorzichtig op een papieren handdoek.
Breng voorzichtig één druppel van fluoresceïne isothiocyanate, gelabeld anti-humaan IgG fluorescerend conjugaat, aan op elk putje. Bewaar vervolgens de slides in de gesloten incubatiekamer gedurende 30 minuten. Zodra de incubatietijd voorbij is, verwijder de slide uit de incubatiekamer.
Houd de slide vast aan het label en spoel voorzichtig zoals voorheen, met ongeveer 10 milliliter PBS spoelbuffer. Breng de slide onmiddellijk over in een Coplin-pot met PBS spoelbuffer en laat 10 minuten weken. Plaats de deksels die in de kit zijn opgenomen op een droge papieren handdoek.
Breng aan de onderkant van het deksel tussen de 3 en 4 druppels van de montage media in een lijn aan. Vervolgens neem één slide tegelijk uit de Coplin-pot met de spoelbuffer. Om het overtollige spoelbuffer te verwijderen, tik of dep de slide voorzichtig op de papieren handdoek.
Vermijd een overtollige hoeveelheid spoelbuffer op de slide te laten, te veel druk op het deksel uit te oefenen of luchtbellen te introduceren. Dit alles kan de celmorfologie, de resulterende fluorescerende patronen en de intensiteit van de reacties beïnvloeden. Laat de slide voorzichtig op het deksel zakken door de onderrand van de slide op de rand van het deksel te plaatsen.
Dit laat het montage media op het deksel naar de bovenrand van de slide stromen en minimaliseert de vorming van luchtbellen, die het lezen van elk putje kunnen verstoren. Bekijk de slides met een fluorescerend microscoop, met behulp van een fluoresceïne isothiocyanate filterset in een donkere kamer. Onderzoek het monster op specifiek helder groen fluorescerend licht onder de microscoop met een vergroting van 200 keer of meer om de uiteindelijke interpretatie over positiviteit en patroon te maken.
Bekijk de positieve en negatieve controles. De positieve controle zal helder groen fluorescerend licht in de kern tonen. De negatieve controle zal geen specifiek groen fluorescerend licht tonen onder een fluorescerend microscoop.
Noteer het positieve of negatieve resultaat voor elk putje en vermeld het ANA-patroon voor positieve gevallen. HEp-2 dicht gespikkeld 70 knockout substraat behoudt alle belangrijke nucleaire en cytoplasmatische patronen. Het dichte, fijne gespikkelde patroon wordt gekenmerkt door de aanwezigheid van gelijkmatig verdeelde gespikkelde kleuring in de interfase-kern en chromatine in de mitotische fase.
De aanwezigheid van zowel conventionele HEp-2 cellen die dicht gespikkeld 70 antigeen tot expressie brengen als gemanipuleerde HEp-2 cellen zonder het antigeen vergemakkelijkt een nauwkeurige onderscheiding van het dichte, fijne gespikkelde 70 patroon, terwijl alle voordelen van conventionele HEp-2 substraten worden behouden. Sera positief voor belangrijke ziekte-geassocieerde ANA-patronen werden gemengd met een dicht gespikkeld 70 patroon positief serum in gelijke verhoudingen en getest op zowel conventionele HEp-2 als de HEp-2 dicht gespikkeld 70 knockout substraten. Hier wijzen rode pijlen op cellen in de mitotische fase.
Gele pijlen wijzen op de conventionele HEp-2 kernen en blauwe pijlen wijzen op de gemanipuleerde HEp-2
Overzicht
Dit artikel presenteert een nieuwe indirecte immunofluorescentie-assay die gebruikmaakt van een dense fine speckled 70 knockout HEp-2 substraat voor het screenen van antinucleaire autoantilichamen (ANA's). De verbeterde methode vergroot het vermogen om DFS70-patronen te onderscheiden van andere met ziekten geassocieerde ANA-patronen, wat zorgt voor een hoge betrouwbaarheid van de resultaten.
Belangrijkste studieonderdelen
Wetenschappelijk vakgebied
- Immunologie
- Autoimmuniteit
- Diagnostische technieken
Achtergrond
- DFS70-autoantistoffen kunnen algemene ANA-patronen nabootsen.
- Conventionele HEp-2-substraten kunnen leiden tot misinterpretatie.
- Nieuwe substraten verbeteren de diagnostische nauwkeurigheid.
- Het begrijpen van ANA-patronen is cruciaal voor de diagnose van auto-immuunziekten.
Doel van de studie
- Om een nieuwe assay voor ANA-screening te demonstreren.
- Om het onderscheid van DFS70-patronen te verbeteren.
- Om het vertrouwen bij het diagnosticeren van monospecifieke en gemengde ANA-gevallen te vergroten.
Gebruikte methoden
- Indirecte immunofluorescentie met behulp van gemanipuleerde HEp-2-substraten.
- Incubatie van patiëntenserum met substraatpreparaten.
- Fluorescentiemicroscopie voor patrooninterpretatie.
- Vergelijking van resultaten tussen conventionele en nieuwe substraten.
Belangrijkste resultaten
- Het nieuwe substraat maakt een duidelijk onderscheid van DFS70-patronen mogelijk.
- Verbeterde nauwkeurigheid bij het identificeren van gemengde ANA-patronen.
- Positieve en negatieve controles valideren de assay.
- De resultaten tonen significante verschillen in fluorescentie-intensiteit aan.
Conclusies
- De nieuwe assay verbetert de betrouwbaarheid van ANA-screening.
- Het biedt een robuuste methode voor het onderscheiden van complexe ANA-patronen.
- Deze vooruitgang kan leiden tot betere diagnostische resultaten voor auto-immuunziekten.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Nauwkeurige differentiatie van DFS70-patronen van ziekte-geassocieerde ANA-patronen blijft een kritische uitdaging in de auto-immuundiagnostiek, wat invloed heeft op het diagnostisch vertrouwen en de daaropvolgende besluitvorming. Het nieuwe HEp-2 DFS70-knockoutsubstraat maakt gelijktijdige detectie en onderscheid van monospecifieke en gemengde DFS70-patronen mogelijk, terwijl de gevoeligheid van conventionele HEp-2-substraten behouden blijft. Deze vooruitgang ondersteunt een verbeterde targetvalidatie en vermindert mechanistische ambiguïteit in vroege discovery-workflows door de specificiteit van auto-antilichamen te verduidelijken.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door DFS70-reactiviteit te onderscheiden van ziekte-geassocieerde autoantilichaamsignalen.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door duidelijke visualisatie van DFS70-specifieke binding in knockout- versus wild-type HEp-2-cellen.
- Voorspellende waarde: Verhoogt het vertrouwen in het target door DFS70-patronen te isoleren van storende homogene of gespikkelde achtergronden in gemengde monsters.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Biedt een gestandaardiseerd biologisch systeem voor downstream ANA-screening met ingebouwde interne controles voor patroondifferentiatie.
- Kwantitatieve output: Maakt intensiteitsgebaseerde vergelijking tussen conventionele en knockout HEp-2-cellen mogelijk om de aanwezigheid van DFS70 te bevestigen.
- Herbruikbaarheid van het platform: Behoudt compatibiliteit met bestaande IIF-workflows, waardoor naadloze integratie in gevestigde pijplijnen voor autoantilichaamscreening mogelijk is.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziektebeelden: Vergemakkelijkt de translationele afstemming van biomarkers door ziekte-geassocieerde ANA-patronen bloot te leggen die voorheen werden gemaskeerd door DFS70-reactiviteit.
- Preklinische continuïteit: Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen voor verdere ontwikkeling door de specificiteit bij autoantistofprofilering in ziektemodellen te verbeteren.
- Mechanistische risicoreductie: Vermindert fout-positieve interpretaties in lupus- en andere bindweefselziektemodellen door DFS70-interferentie op te heffen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm, van vroege targetvalidatie tot leadidentificatie, waarbij de specificiteit van autoantilichamen de selectie van targets en de validatie van signaalpaden onderbouwt.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetesten door een duidelijk onderscheid mogelijk te maken tussen DFS70 en ziekte-geassocieerde nucleaire antigeenreactiviteiten.
- Screening: Biedt standaardisatie en reproduceerbaarheid van de assay door middel van een zij-aan-zij vergelijking van wild-type en knockout HEp-2 substraten op dezelfde slide.
- Analytics: Genereert kwantitatieve readouts van de fluorescentie-intensiteit die een objectieve differentiatie van mono-specifieke en gemengde DFS70-patronen mogelijk maken.
- Translationeel onderzoek: Sluit aan op preklinische validatie door de nauwkeurigheid van autoantibody-profilering te verbeteren, waardoor ruis bij het ontdekken van biomarkers wordt verminderd.
- Enterprise Reuse: Fungeert als een herbruikbare screeningmodule in plaats van een eenmalige techniek, aanpasbaar voor meerdere campagnes voor de ontdekking van autoantilichamen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellende betrouwbaarheid bij targetvalidatie door verminderde mechanistische ambiguïteit bij de interpretatie van ANA-patronen.
- Operationele waarde: Standaardisatie en reproduceerbaarheid via interne substraatcontroles die variabiliteit tussen wells elimineren.
- Strategische waarde: Betere go/no-go-beslissingen door verbeterde specificiteit bij vroege screening van autoantilichamen, waardoor biologische risico's in een laat stadium worden verminderd.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering door een duidelijker onderscheid tussen benigne DFS70-reactiviteit en pathogene autoantilichaamprofielen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in het uitvoeren van indirecte immunofluorescentie-assays en het herkennen van fluorescentiepatronen.
- Afhankelijk van fluorescentiemicroscopie met een FITC-filterset en gestandaardiseerde incubatie- en wasprotocollen.
- Vereist cross-team standaardisatie van de behandeling van slides, het toevoegen van monsters en de beeldvormingsprocedures om consistente resultaten te garanderen.
- Overwegingen voor adaptatie omvatten validatie over verschillende serummatrices en autoantilichaamtiters bij gebruik in scenario's met gemengde patronen.
- Praktische beperkingen omvatten de noodzaak van getraind personeel om subtiele intensiteitsverschillen tussen celpopulaties in hetzelfde gezichtsveld te interpreteren.
Veelgestelde vragen over Biopharma
Chapters in this video
0:05
Title
1:01
Sample and Substrate Preparation
2:04
Addition of Controls and Samples
3:37
Addition of Fluorescent Conjugate and Analysis of Results
6:32
Results: Classic Disease Associated ANA and DFS70 Patterns on Conventional Hep-2 and Novel Hep-2 DFS70 Knockout Substrates
8:20
Conclusion
