Met behulp van CRISPR/Cas9 Gene bewerken om te onderzoeken de oncogene activiteit van Mutant Calreticulin in Cytokine afhankelijke hematopoietische cellen
5 januari 2018
Gerichte gene bewerken met behulp van CRISPR/Cas9, heeft het inzicht in de biologische functies van genen aanzienlijk vergemakkelijkt. Hier, gebruiken we de methode van de CRISPR/Cas9 voor model calreticulin mutaties in cytokine-afhankelijke hematopoietische cellen om hun oncogene activiteit te bestuderen.
Het algemene doel van dit experiment is om CRISPR/Cas9-genbewerking te gebruiken om calreticulinformutaties in cytokine-afhankelijke hematopoëtische cellen te modelleren om hun oncogeen activiteit te bestuderen. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het veld van hematologische maligniteiten te beantwoorden, zoals de biologische functie van driver-mutaties wanneer ze op fysiologische niveaus worden uitgedrukt. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het het CRISPR/Cas9-genbewerkingssysteem gebruikt om de biologische functie van genen die betrokken zijn bij kanker te modelleren en te bestuderen.
Om de oligo's te annealen en fosforyleren, voeg de reagentia toe aan een totaal van 10 microliter in een PCR-buisje dat op ijs wordt bewaard. Stel het programma in de thermocycler in. Gebruik water om de reactie na de cyclus te verdunnen.
Om de lentiGuide-Puro vector te verteren, bereid 50 microliter van de digestor reactie. Begin vervolgens de verteringsreactie bij 55 graden Celsius op een heat block. Voeg na een uur een extra microliter BsmB1 restrictie-enzym toe en zet de reactie nog een uur voort.
Om het ruggengraat te defosforyleren, voeg zeven microliter fosfatase reactiebuffer en twee microliter fosfatasenzym toe aan het verteerde vector. Bewaar vervolgens het mengsel gedurende 30 minuten op 37 graden Celsius. Zuiver het al gesneden en gedefosforyleerde ruggengraat met behulp van een commercieel kit.
Om het ligatiemengsel voor te bereiden, voeg 15 nanogram van gesneden ruggengraat en andere reagentia toe aan een PCR-buisje op ijs en pas het volume aan tot 10 microliter met water. Bewaar de reactie op kamertemperatuur gedurende een uur. Transformeer vervolgens STBL3-compatibele cellen met twee microliter van het ligatiemengsel.
Plak vervolgens op de lysogeny bouillon agar plaat met 100 microgram per milliliter ampicilline. Bewaar de plaat daarna een nacht bij 37 graden Celsius. Kies drie kolonies en inoculeer ze.
Voer een mini prep uit voor elke cultuur en sequence de oligo invoegingsplaats met een U6 promotorregio primer. Zaai hek293t cellen op een 10 centimeter schaal. Laat het een nacht incuberen.
Om het DNA-mengsel voor transfectie voor te bereiden, pipet 45 microliter van het transfectie reagens naar het DNA. Gebruik een pipet om het DNA en het transfectiereagens voorzichtig te mengen en laat het 20 minuten staan. Voeg vervolgens het DNA transfectiemengsel druppelsgewijs toe aan de gezaaide cellen.
Zwiep de platen voorzichtig. En incubeer bij 5% koolstofdioxide en 37 graden Celsius gedurende een dag. Verzamel het virusbevattende supernatant na 24 en 48 uur door het door een 0.22 micrometer filter te laten lopen.
En verdeel 1,6 milliliter supernatant in elke cryo vial. Aspireer vervolgens het supernatant en resuspendeer de Ba/F3 cellen in media door de cellen meerdere keren op en neer te pipetten. Voeg 500 microliter van de gesuspendeerde cellen, 1,5 milliliter van het virale supernatant, vier microliter polybrene en 10 nanogram per milliliter van muis interleukine 3 toe in een zes-well tissuecultuurplaat.
Centrifugeer de plaat bij 440 G gedurende 120 minuten bij 37 graden Celsius. Na centrifugatie, verplaats de plaat naar een incubator voor overnachtelijke incubatie bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide. Hierna centrifugeert u de cellen bij 440 G gedurende drie minuten.
En resuspendeer in vijf milliliter vers warm media in een zes-well plaat. Om de Cas9 geïnfecteerde cellen te selecteren, centrifugeert u de cellen eerst. En resuspendeer vervolgens in vers warm media aangevuld met vijf microgram per milliliter blasticidin na 48 uur van spinfectie.
Selecteer cellen gedurende negen dagen met blasticidin totdat alle ongeïnfecteerde cellen dood zijn. Transfer vervolgens de resistente cellen naar een medium met één microgram per milliliter blasticidin. Transduceer de ouderlijke cellen en de cellen die stabiel Cas9 tot expressie brengen met pXPR-011 reporter construct via lentivirale infectie.
Selecteer cellen gedurende drie dagen met twee microgram per milliliter puromycine, 48 uur na spinfectie. Infecteer de Cas9-expresserende cellen met single guide ribonucleïnezuur met behulp van lentivirus. Gebruik vervolgens twee microgram per milliliter puromycine om de cellen gedurende drie dagen, 48 uur na spinfectie, te selecteren.
Binnen de exponentieel groeiende Ba/F3 cellen die ectopisch Cas9 en de enkele guide ribonucleïnezuur van belang tot expressie brengen. Aspireer het supernatant en was de cellen met vijf milliliter fosfaatgebufferd zoutwater. Centrifugeer de cellen en was ze drie keer met fosfaatgebufferd zoutwater.
Tel vervolgens het aantal cellen met behulp van een celviabiliteitsanalysator. Zaai vervolgens cellen in drievoudigheid in twee milliliter vers media zonder interleukine 3 in zes-well cultuurplaten. Begin de cellen elke twee dagen gedurende acht dagen te monitoren en te tellen.
Representatieve flow-psychometrische gegevens die de Cas9-activiteit in ouderlijke Ba/F3-cellen en Ba/F3-cellen die Cas9 overexpresseren, tonen hier aan. Het groen fluorescerende proteïne signaal wordt met 76% verminderd in Ba/F3-cellen die Cas9 overexpresseren, wat wijst op robuuste Cas9-activiteit, terwijl in ouderlijke Ba/F3-cellen het groen fluorescerende proteïne signaal op 100% blijft. Representatieve groeicurven voor cellen die de oncogeen activiteit van calreticuline tonen, worden hier weergegeven. CRISPR/Cas9-gemedieerde plus één basepaar frame shift mutatie werd geïntroduceerd in het calreticuline exon negen locus met behulp van m1 en m2 single guide RNase.
Groeicurven voor calreticuline gerichte Ba/F3-thrombopoietine receptor Cas9-cellen laten muisinterleukine 3 onafhankelijke groei zien. De groeicurven voor de andere celtypen laten echter geen cytokine-onafhankelijke groei zien. Sequencresultaten bevestigen de on-target bewerking van endogene calreticuline exon negen in calreticuline gerichte Ba/F3-thrombopoietine receptor Cas9-cellen met behulp van de m1 en m2 single guide RNase.</
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie maakt gebruik van CRISPR/Cas9-genbewerking om calreticuline-mutaties te modelleren in cytokinerafhankelijke hematopoëtische cellen. Het doel is om de oncogene activiteit van deze mutaties te onderzoeken, om zo inzicht te krijgen in hun biologische functies.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Genbewerking
- Oncologie
- Hematologie
Achtergrond
- CRISPR/Cas9 is een krachtige tool voor gerichte genbewerking.
- Het begrijpen van drivermutaties is cruciaal bij hematologische maligniteiten.
- Calreticuline-mutaties zijn gekoppeld aan diverse vormen van kanker.
- Deze studie richt zich op hun fysiologische expressieniveaus.
Doel van de studie
- Om calreticuline-mutaties te modelleren met behulp van CRISPR/Cas9.
- Om de oncogene activiteit van deze mutaties te bestuderen.
- Om de biologische functie van driver-mutaties in hematopoëtische cellen te onderzoeken.
Gebruikte methoden
- CRISPR/Cas9-methode voor genbewerking.
- Modelleren van mutaties in cytokinerafhankelijke hematopoëtische cellen.
- Analyse van oncogene activiteit.
- Experimentele procedures voor oligo-annealing en fosforylering.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle modellering van calreticuline-mutaties.
- Inzichten in het oncogene potentieel van deze mutaties.
- Verbeterd begrip van driver-mutaties in de kankerbiologie.
- Potentiële implicaties voor onderzoek naar hematologische maligniteiten.
Conclusies
- CRISPR/Cas9 is effectief voor het bestuderen van genfuncties.
- Calreticuline-mutaties spelen een significante rol bij oncogenese.
- Dit onderzoek draagt bij aan het begrip van hematologische kankers.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directie
CRISPR/Cas9-genbewerking maakt nauwkeurige modellering van oncogene mutaties op fysiologische niveaus in hematopoëtische cellen mogelijk, waardoor de uitdaging om kanker-drivermutaties functioneel te valideren direct wordt aangepakt. Deze benadering vergroot het voorspellende vertrouwen bij de validatie van targets en informeert risico-gecorrigeerde beslissingen bij vroege ontdekkings- en preklinische inflection points. De methodologie ondersteunt bedrijfs-R&D door een schaalbaar platform te bieden voor het onderzoeken van genfuncties in ziekte-relevante systemen.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt functionele ondervraging van drivermutaties in endogene gencontexten mogelijk.
- Ondersteunt biologische risicoreductie door het oncogene potentieel van specifieke genetische alteraties te verduidelijken.
- Vergemakkelijkt de voorspellende betrouwbaarheid bij de selectie van targets voor hematologische maligniteiten.
Screening & Assayontwikkeling
- Bereidt gevalideerde celmodellen voor voor daaropvolgende transformatie- en proliferatie-assays.
- Standaardiseert kwantitatieve read-outs voor cytokineronafhankelijke groei als surrogaat voor oncogene activiteit.
- Maakt reproduceerbare beoordeling van genfunctie mogelijk over meerdere guide RNA's en cellijnen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Rijgt ziekterelevante genetische modellen in lijn met translationele biomarkerstrategieën in de hematologie.
- Zorgt voor continuïteit van mutatiemodellering in de ontdekkingsfase tot de preklinische validatie van oncogene mechanismen.
- Ondersteunt de risico-gecorrigeerde verdere ontwikkeling van targets op basis van functioneel bewijs in fysiologisch relevante systemen.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze op CRISPR/Cas9 gebaseerde workflow integreert alle stappen van vroege ontdekking tot preklinisch onderzoek, waardoor iteratieve hypothesetests en mechanische risicoreductie mogelijk worden.
- Discovery Biology: Ondersteunt het toetsen van de nulhypothese voor de oncogeniteit van specifieke CALR-mutaties in hematopoëtische cellen.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, kwantitatieve proliferatie-assays om de groei van mutante en wild-type cellen te vergelijken.
- Analytics: Biedt sequencings- en flowcytometrie-resultaten om on-target editing en functionele transformatie te bevestigen.
- Translational Research: Slaat een brug tussen genetische modellering en ziekterelevante fenotypes voor biomarker-afstemming.
- Enterprise Reuse: Biedt een modulair platform dat aanpasbaar is aan andere gentargets en cellsystemen in oncologisch onderzoek.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in targetvalidatie en vermindert mechanistische ambiguïteit voor drivermutaties.
- Operationele waarde: Standaardiseert genbewerkings- en selectieprotocollen voor reproduceerbaarheid en schaalbaarheid.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen door genetische veranderingen te koppelen aan functionele transformatie in relevante modellen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van targets mogelijk op basis van robuust functioneel bewijs.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in CRISPR/Cas9-ontwerp, lentivirale aflevering en kweek van hematopoëtische cellen.
- Vereist toegang tot sequencing, flowcytometrie en celviabiliteitsanalyse voor kwantitatieve beoordeling.
- Vereist cross-team standaardisatie van de selectie van guide RNA en de assays-eindpunten.
- Aanpasbaar aan andere genen en cellijnen mits passende optimalisatie van de afleverings- en selectiecondities.
- Biosafety-protocollen voor werk met lentivirussen in BL2+-faciliteiten moeten strikt worden nageleefd.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:05
Title
0:44
Cloning sgRNA Oligos
1:08
Digestion of LentiGuide-puroVector
2:04
Ligation of Annealed Oligos into Digested Backbone
3:02
Generation of Cell Lines Stably Expressing spCas9
5:40
Reporter Assay for Cas9 Activity
6:10
Spinfection of sgRNAs into Cas9 Expressing Cells
6:31
Ba/F3 Cellular Transformation and Positive Selection using m-IL3 Withdrawal
7:23
Results: Use of CRISPR/Cas9 Tool and Ba/F3 Cellular Transformation to Study Oncogenic Potential of Mutated Calreticulin
9:02
Conclusion
