Name: Meten van de genexpressie in gebombardeerd gerst Aleurone lagen met grotere gegevensdoorvoer (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-30T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: Leer een verbeterd protocol voor het meten van genexpressie in gerst aleurone cellen via deeltjesbombardement. Deze methode combineert geautomatiseerd malen met 96-well plaat enzymassays voor hogere doorvoer.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs bedanken Greyson Butler en Margaret Barrett voor hulp bij de uitvoering van de experimenten, Judy Stone voor advies over graan homogenisering en Lynn Hannum voor advies over fluorometry. Dit werk werd gesteund door de National Science Foundation (IOB 0443676), door een institutionele Development Award (idee) van het National Institute of General Medical Sciences van de National Institutes of Health subsidie onder nummer P20GM0103423, en door toelagen van de verdeling van het Colby College van natuurwetenschappen.

1. bereiding van Effector en Reporter Gene construeert
<ol><li>Bouwen effector constructies die een constitutief promotor (bijv. maïs ubiquitin, UBI dienst) op station expressie van een gewenste open leesraam. Bijvoorbeeld, bouw een plasmide met UBI::TaABF1 tot station sterke constitutieve uitdrukking van TaABF15.</li>
	<li>Bouwen verslaggever constructies waarin de promotor waarvan de activiteit is te worden gemeten, voorafgaand aan een open leesraam, zoals GUSgeplaatst. Bijvoorbeeld, het bouwen van een plasmide met HVA1::GUS voor het meten van de expressie van het HVA1 promotor2,5.</li>
	<li>Bouwen van een interne controle construct (bijvoorbeeld UBI::luciferase).</li>
	<li>Met behulp van een kolom silica bindend protocol (Zie Tabel of Materials), kwalitatief hoogwaardige plasmide voorbereiden op elk van de vereiste gene constructies. Met behulp van ultraviolet spectroscopie (Zie Tabel of Materials), zorgvuldig meten van de concentratie van elk preparaat plasmide.</li>
</ol>2. voorbereiding van gerst korrels voor bombardement
<ol><li>Een werkblad instellen (Zie Figuur 1 voor een voorbeeld) die aangeeft van de plasmiden die zal worden gebombardeerd, de juiste hormoon-behandelingen, en andere relevante informatie voor elke behandeling die deel van het experiment uitmaken zal.</li>
	<li>Met behulp van een snijplank en een steriele scheermesje, is afgesneden van de embryo's van korrels van Himalaya gerst (40 voor elke behandeling opgenomen in het experiment). Korrels die verkleurde of aanzienlijk kleiner is dan het gemiddelde uit te sluiten.</li>
	<li>Plaats alle de embryoless korrels in een tube van 50 mL. Voeg 40 mL water en rock gedurende 10 minuten.</li>
	<li>Giet het water zorgvuldig (om te voorkomen dat verliezen korrels) en voeg 40 mL 10% bleekwater. Rock gedurende 20 minuten.</li>
	<li>Uitstorten van het bleekmiddel en voeg 40 mL steriel water. Rock voor 5 minuten. Herhaal dit steriel water wassen viermaal meer.</li>
	<li>Voeg toe 40 mL Imbibing oplossing (20 mM natrium succinaat, 20 mM calciumchloride, pH 5.0) en 40 μL van chlooramfenicol stockoplossing (10 mg/mL).</li>
	<li>Allermeest naar de Imbibing oplossing (met chlooramfenicol) overdracht van de buis in een vermiculiet plaat (Zie Tabel van materialen). Breng de korrels op het oppervlak van het natte koffiefilter in de vermiculiet plaat. De korrels gelijkmatig verdeeld. Giet in voldoende imbibing oplossing te houden van de korrels gedeeltelijk (maar niet volledig) ondergedompeld. Plaats het deksel op de top van de vermiculiet plaat.</li>
	<li>Incubeer de embryoless korrels bij 24 ° C gedurende ongeveer 48 uur met TL-verlichting. Aanvullende Imbibing oplossing zo nodig toevoegen.</li>
	<li>Een 90 mm kunststof petrischaal openstellen en giet 20 mL Imbibing oplossing in de schotel zelf en 20 mL in het omgekeerde deksel. Voeg 20 μL van chlooramfenicol (10 mg/mL) toe aan elk. Twee paar fijne punt pincet steriliseren door dompelen hen in alcohol.</li>
	<li>Plaats een paar van de embryoless korrels in het deksel van de petrischaal. Met behulp van de verlostang, zachtjes verwijderen de vacht zaad (transparant) elke korrel. Tijdens het verwijderen van de zaad vacht van de gladde kant van de korrel, de onderliggende (aleurone)-cellen niet te beschadigen. De geschilde korrel overbrengen in de petrischaal met Imbibing oplossing.</li>
	<li>Na pellen het zaad vacht van alle van de korrels, kunt u dat terugsturen naar de vermiculiet plaat. Incubeer de gepelde embryoless korrels bij 24 ° C voor 16-20 uur.</li>
	<li>Net voordat u de korrels voor bombardement, oppervlakte vocht te verwijderen door schudden ze tussen filtreerpapier in een petrischaal.</li>
</ol>3. voorbereiding van de plasmide DNA voor bombardement
<ol><li>Label een 1,5 mL tube voor elke behandeling die zal worden opgenomen in het experiment bombardement. Toevoegen aan elke buis 2,5 µg UBI::luciferase interne controle plasmide, 2,5 µg een GUS verslaggever plasmide, en de gewenste hoeveelheid (meestal 0,025 µg aan 2,5 µg) een effector plasmide. Voeg water om het totale volume aan 5 µL.</li>
	<li>1.6 µm gouden microcarriers (Zie Tabel van materialen) bereiden volgende protocollen6gepubliceerd.</li>
	<li>Voor elke behandeling, voeg toe 50 µL van zwevende microcarriers in de 1,5 mL-buis met plasmide DNA. Jas de microcarriers met plasmide DNA volgens fabrikant protocollen6.</li>
	<li>Bij de laatste stap, wanneer de plasmide beklede microcarriers zijn opgehangen in 48 µL 100% ethanol, Pipetteer 8 μL van zwevende microcarriers op elk van de vijf macrocarriers en hen in staat aan de lucht stellen drogen.</li>
</ol>4. deeltje bombardement van Embryoless gerst korrels
<ol><li>Instellen van het deeltje bombardement apparaat (Zie Tabel van materialen)6.</li>
	<li>Plaats een 1550 psi breuk schijf in het behoud GLB en bevestig het op het instrument.</li>
	<li>Plaats een macrocarrier met de gewenste plasmide combinatie (samen met een stoppen-scherm) in de vergadering van de lancering van de microcarrier. Plaats de vergadering in de bovenste sleuf van de kamer van het bombardement. Stel de afstand tussen de breuk schijf behouden GLB en het deksel van de macrocarrier op de standaard afstand (6 mm), en plaats de ondersteuning van het scherm stoppen op de (standaard) middelste positie, waardoor een reisafstand van de macrocarrier van 11 mm (figuur 2A).</li>
	<li>8 embryoless korrels in een strakke radiaal patroon te regelen (met de dunnere eindigt wijzen naar binnen) op een filtreerpapier cirkel die is geplakt beneden flat het deksel van een petrischaal 90 mm (Zie figuur 2B).</li>
	<li>Zet de schotel met de korrels in de bedwelmingsruimte bombardement, op een afstand van 6 cm vanaf het scherm stoppen.</li>
	<li>Het bombardement kamer evacueren naar 95 kPa en vervolgens het bombarderen van het monster.</li>
	<li>Na het loslaten van de stofzuiger, door de gebombardeerd korrels te overbrengen in een gelabelde 60 mm petrischaal met 4 mL Imbibing oplossing met 1 mg/ml chlooramfenicol.</li>
	<li>Herhaal tot alle van de bombardementen hebben afgerond. Incubeer (op een schudden platform op 100 rpm) bij 24 ° C gedurende 24 uur.</li>
</ol>5. extractie van oplosbaar eiwit uit de gebombardeerd korrels
<ol><li>Met behulp van Tang, verwijder de 8 gebombardeerd korrels uit een petrischaal 60 mm en dep ze droog op een papieren handdoek. Verdeel de korrels in twee gelabelde 2,0 mL buizen (4 korrels per buis) elk met 800 μL slijpen Buffer (100 mM nb fosfaat pH 7,2, 5 mM DTT 10 µg/mL leupeptin, 20% glycerol) en een 5 mm roestvrij staal kraal. Herhaal dit proces voor alle gebombardeerd korrels.</li>
	<li>(48) 2,0 mL buizen in de twee rekken van de kraal homogenizer plaatsen (Zie Tabel van materialen). Monteer de rekken op de homogenizer.</li>
	<li>Schud de monsters bij 30 Hz gedurende 3 minuten.</li>
	<li>Verwijder de rekken van de homogenizer uit de homogenizer en leg ze op ijs (5 min) opnieuw het afkoelen van de monsters.</li>
	<li>Monteer de rekken terug op de homogenizer - in de tegenovergestelde richting. Schud de monsters opnieuw bij 30 Hz gedurende 3 minuten.</li>
	<li>Koel de rekken op het ijs, herhaalt u stappen 5.3 naar 5.5. Dit zal oplopen tot een totaal van 12 minuten schudden.</li>
	<li>Centrifugeer de extracten van de korrel bij 16.000 x g bij 4 ° C gedurende 10 minuten.</li>
	<li>
Onmiddellijk na het centrifugeren, decanteren in de duidelijke supernatant in een tweede reeks van microcentrifuge buizen. Geef elke buis een snelle vortex. Bewaar de buizen op ijs.</li>
	<li>Na het overbrengen van de bovendrijvende substantie, herstelt u de stalen kralen van de pellets zodat ze kunnen worden gewassen en hergebruikt.</li>
</ol>6. meting van de Luciferase activiteit uit graan extracten
<ol><li>Voor elke buis voor graan extract te worden bepaald, bereiden een reageerbuis 12 x 75 mm glas met 200 μL van Luciferase Assay mengsel (45 mM Tris lanthaansulfaat pH 7.7, 15 mM MgCl2, 20 mM DTT, 1.5 mM EDTA, luciferine 1 mM, 1 mM ATP).</li>
	<li>Voeg 100 μl van het eerste graan-extract aan de eerste test-buis. Vortex snel naar meng goed. Onmiddellijk plaats van de buis in de houder van de buis van de luminometer en sluit de deur. Als de meting is voltooid, verwijdert u de buis uit de luminometer-laat de deur open voor de plaatsing van de volgende buis.</li>
	<li>Herhaal dit proces totdat alle monsters zijn gemeten.</li>
</ol>7. meting van GUS activiteit uit graan extracten
<ol><li>Voeg 200 l GUS Assay Buffer (50 mM nb fosfaat pH 7,2, 2.5 mM 4-methylumbelliferyl--D-glucuronide, 10 mM DTT, 2 mM EDTA, 10 µg/mL leupeptin, 20% methanol, natriumazide 0,02%) aan elk putje van een 96 goed plaat.</li>
	<li>Plaats 50 μl van elk uittreksel van graan in de corresponderende goed. Meng met de tip nadat u hebt toegevoegd. Verzegel de bovenkant met het afdichten van de film.</li>
	<li>Incubeer de 96 goed plaat bij 37 ° C in het donker gedurende 20 uur.</li>
	<li>De 96 goed plaat bij 4000 x g bij 4 ° C gedurende 10 minuten centrifugeren en plaats deze op het ijs.</li>
	<li>250 μL van 0,2 M Na2CO3 toevoegen aan elk putje van een zwarte 96 goed plaat.</li>
	<li>Toevoegen van 6,25 μL van ieder gecentrifugeerde GUS assay mengsel in de corresponderende goed (met 0,2 M Na2CO3) van de zwarte 96 goed plaat. Meng met de tip nadat u hebt toegevoegd. Putjes met 6,25 μL van 10 μM, 40 μM en 100 μM 4-methylumbelliferone als normen bevatten.</li>
	<li>Plaats van de zwarte plaat in een plaat Fluorimeter en lees de fluorescentie van methylumbelliferone. Neem de lezingen bij een golflengte van de excitatie van 360 nm en een golflengte van de emissie van 460 nm. De winst van het instrument zo ingesteld dat een goed met 6,25 μL van 40 μM 4-methylumbelliferone en 250 μL van 0,2 M Na2CO3 een lezing van 1000 fluorescentie eenheden geeft.</li>
</ol>8. de gegevensanalyse
<ol><li>Voer de waarden voor de luciferase en GUS testen in een spreadsheet. Uitsluiten van overweging een monster met een luciferase lezing van minder dan 20.000 relatieve luminescentie eenheden s-1, zoals dit aangeeft dat de gene constructies niet met succes naar de aleurone cellen werden bezorgd.</li>
	<li>Voor elke met succes gebombardeerd graan uitpakken (namens een groep van vier embryoless korrels), de genormaliseerde GUS expressie uit de ruwe GUS en luciferase gegevens als volgt berekenen: GUS genormaliseerd = [(GUS expressie - GUS leeg) x (2.000.000)] / (luciferase expressie-luciferase leeg). Opmerking: Dit normaliseert de hoeveelheid GUS activiteit aan wat zou zijn waargenomen in een bombardement dat gaf een lezing luciferase van 2.000.000.</li>
	<li>Verslag het relatieve niveau van expressie voor een specifieke verslaggever construct in aanwezigheid van effector constructies of hormoon-behandelingen wordt getest door te vergelijken op het niveau van meningsuiting in de afwezigheid van effectoren of hormonen.</li>
</ol>

<ol><li>Chen, K., An, Y. Q. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+responses+to+gibberellin+and+abscisic+acid+in+barley+aleurone%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Integ.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional responses to gibberellin and abscisic acid in barley aleurone.</a> J. Integ. Plant Biol. 48, 591-612 (2006).</li>
<li>Lanahan, M. B., Ho, T. H. D., Rogers, S. W., Rogers, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gibberellin+response+complex+in+cereal+alpha-amylase+gene+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A gibberellin response complex in cereal alpha-amylase gene promoters.</a> Plant Cell. 4, 203-211 (1992).</li>
<li>Shen, Q., Zhang, P., Ho, T. H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+nature+of+abscisic+acid+%28ABA%29+response+complexes%3B+composite+promoter+units+that+are+necessary+and+sufficient+for+ABA+induction+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Modular nature of abscisic acid (ABA) response complexes; composite promoter units that are necessary and sufficient for ABA induction of gene expression.</a> Plant Cell. 8, 1107-1119 (1996).</li>
<li>Gómez-Cadenas, A., Zentella, R., Walker-Simmons, M. K., Ho, T. H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gibberellin%2Fabscisic+acid+antagonism+in+barley+aleurone+cells%3A+site+of+action+of+the+protein+kinase+PKABA1+in+relation+to+gibberellin+signaling+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Gibberellin/abscisic acid antagonism in barley aleurone cells: site of action of the protein kinase PKABA1 in relation to gibberellin signaling molecules.</a> Plant Cell. 13, 667-679 (2001).</li>
<li>Johnson, R. R., Shin, M., Shen, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+wheat+PKABA1-interacting+factor+TaABF1+mediates+both+abscisic+acid-suppressed+and+abscisic+acid-induced+gene+expression+in+bombarded+aleurone+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The wheat PKABA1-interacting factor TaABF1 mediates both abscisic acid-suppressed and abscisic acid-induced gene expression in bombarded aleurone cells.</a> Plant Mol. Biol. 68, 93-103 (2008).</li>
<li>Harris, L. J., Martinez, S. A., Keyser, B. R., Dyer, W. E., Johnson, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+TaABF1+during+abscisic+acid+and+gibberellin+signaling+in+aleurone+cells+of+cereal+grains%5BTitle%5D)+AND+%22Seed+Science+Res%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of TaABF1 during abscisic acid and gibberellin signaling in aleurone cells of cereal grains.</a> Seed Science Res. 23, 89-98 (2013).</li>
<li>Shen, Q., Casaretto, J., Zhang, P., Ho, T. H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+definition+of+ABA-response+complexes%3A+the+promoter+units+necessary+and+sufficient+for+ABA+induction+of+gene+expression+in+barley+%28Hordeum+vulgare%29%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional definition of ABA-response complexes: the promoter units necessary and sufficient for ABA induction of gene expression in barley (Hordeum vulgare).</a> Plant Mol. Biol. 54, 111-124 (2004).</li>
<li>Ritchie, S., Gilroy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abscisic+acid+signal+transduction+in+the+barley+aleurone+is+mediated+by+phospholipase+D+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Abscisic acid signal transduction in the barley aleurone is mediated by phospholipase D activity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 2697-2702 (1998).</li>
<li>Takemiya, A., Shimazaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidic+acid+inhibits+blue+light-induced+stomatal+opening+via+inhibition+of+protein+phosphatase+1%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Phosphatidic acid inhibits blue light-induced stomatal opening via inhibition of protein phosphatase 1.</a> Plant Physiol. 153, 1555-1562 (2010).</li>
<li>Zou, X., Seeman, J. R., Neuman, D., Shen, Q. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+WRKY+gene+from+creosote+bush+encodes+an+activator+of+the+abscisic+acid+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A WRKY gene from creosote bush encodes an activator of the abscisic acid signaling pathway.</a> J. Biol. Chem. 279, 55770-55779 (2004).</li>
<li>Ishibashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+are+involved+in+gibberellin%2Fabscisic+acid+signaling+in+barley+aleurone+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species are involved in gibberellin/abscisic acid signaling in barley aleurone cells.</a> Plant Physiol. 158, 1705-1714 (2012).</li>
<li>Piskurewicz, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gibberellic+acid+signaling+repressor+RGL2+inhibits+Arabidopsis+seed+germination+by+stimulating+abscisic+acid+synthesis+and+ABI5+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The gibberellic acid signaling repressor RGL2 inhibits Arabidopsis seed germination by stimulating abscisic acid synthesis and ABI5 activity.</a> Plant Cell. 20, 2729-2745 (2008).</li>
<li>Hong, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation-mediated+regulation+of+a+rice+ABA+responsive+element+binding+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation-mediated regulation of a rice ABA responsive element binding factor.</a> Phytochemistry. 72, 27-36 (2011).</li>
<li>Lopez-Molina, L., Mongrand, S., McLachlin, D. T., Chait, B. T., Chua, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ABI5+acts+downstream+of+ABI3+to+execute+an+ABA-dependent+growth+arrest+during+germination%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">ABI5 acts downstream of ABI3 to execute an ABA-dependent growth arrest during germination.</a> Plant J. 32, 317-328 (2002).</li>
<li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOS2-LIKE+PROTEIN+KINASE5%2C+an+SNF1-RELATED+PROTEIN+KINASE3-Type+protein+kinase%2C+is+important+for+abscisic+acid+responses+in+Arabidopsis+through+phosphorylation+of+ABSCISIC+ACID-INSESENSITIVE5%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">SOS2-LIKE PROTEIN KINASE5, an SNF1-RELATED PROTEIN KINASE3-Type protein kinase, is important for abscisic acid responses in Arabidopsis through phosphorylation of ABSCISIC ACID-INSESENSITIVE5.</a> Plant Physiol. 168, 659-676 (2015).</li>
<li>Zong, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feedback+regulation+of+ABA+signaling+and+biosynthesis+by+a+bZIP+transcription+factor+targets+drought-resistance-related+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Feedback regulation of ABA signaling and biosynthesis by a bZIP transcription factor targets drought-resistance-related genes.</a> Plant Physiol. 171, 2810-2825 (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De invoering van effector gen construeert via deeltje bombardement, gevolgd door voorbijgaande expressie van verslaggever constructies is een waardevolle strategie voor het ontleden van de rol van bepaalde actoren in GA/ABA signalering en in het resulterende hormoon-gereglementeerde gen expressie. Bestaande protocollen voor het uitvoeren van dergelijke experimenten in gerst aleurone cellen2,3,4,5<...

De laag van de aleurone gerst is een gevestigde modelsysteem voor de studie van hormoon-gereglementeerde genexpressie in planten1. In het bijzonder worden een aantal genen die nodig zijn voor de kieming of vroege zaailing ontwikkeling geactiveerd door Gibberelline (GA), terwijl genen geassocieerd met stress reacties worden geactiveerd door abscisic zuur (ABA). De GA en ABA signalering trajecten met elkaar verweven zijn, zoals de expressie van bepaalde genen GA-geactiveerd wordt geremd door ABA en vice-versa1.
Een waardevolle strategie voor begrip van dat de rol van bepaalde actoren in GA/ABA signalering is de invoering van effector gene constructies via deeltje bombardement, gevolgd door voorbijgaande expressie van verslaggever constructies waarmee het resulterende effect op stroomafwaarts genexpressie te bepalen. Het gebruik van verslaggever genen zoals GUS (β-glucuronidase) of Luciferase maakt de gevoelige en kwantitatieve meting van genuitdrukking specifiek binnen de cellen die de effector constructie hebben ontvangen. Bijvoorbeeld, vastgesteld de invoering van een effector construct codering van de transcriptiefactor TaABF15,6 dat ABA-geïnduceerde genen zoals HVA1 door TaABF1, terwijl de GA-geïnduceerde genen zoals Amy32b veroorzaakt worden onderdrukt. Bombardement van het deeltje als een experimentele strategie hanteert voor het onderzoeken van de diverse aspecten van GA/ABA signalering door meerdere laboratoria. Dergelijk werk heeft geleid tot de identificatie van de promotor elementen belangrijk voor de activering van zowel de GA-geïnduceerde2 en de ABA-geïnduceerde genen3, en tot de ontdekking van eiwit kinases4 en transcriptie factoren5 die regelen de expressie van deze genen.
De bestaande protocollen2,3,4,5,6 voor deeltje bombardement en de daaropvolgende meting van voorbijgaande genexpressie zijn heel arbeidsintensief, zoals elke set gebombardeerd nauwelijks korrels is gehomogeniseerd met de hand in een mortier en een stamper en het enzym testen afzonderlijk worden uitgevoerd. Dit manuscript rapporten in een verbeterde protocol dat gedeeltelijk automatiseert en stroomlijnt de homogenisering stap en de GUS testen zodat aanzienlijk meer doorvoer, waardoor een groter aantal behandelingen in hetzelfde experiment, worden getest en/of de opneming van meer replicatieonderzoeken voor elke behandeling om meer statistisch robuuste resultaten te verkrijgen. Representatieve resultaten worden weergegeven voor de expressie van HVA1 en Amy32b verslaggever constructies, gereguleerd door de transcriptiefactor TaABF1 alsmede door GA, ABA, en andere regelgevende moleculen.

<table><tbody><tr><td>GeneElute HP plasmid Maxiprep kit</td><td>Sigma</td><td>NA0310-1KT</td><td></td></tr><tr><td>UV-vis spectrofotometer</td><td>Nanodrop</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>Himalaya gerstkorrels</td><td>/</td><td>/</td><td>Een variëteit aan gerst zonder kaf (bewaar in het donker bij 4° C)</td></tr><tr><td>natriumsuccinaat</td><td>Sigma</td><td>S2378</td><td>Reagens voor Imbibing Solution</td></tr><tr><td>calciumchloride (dihydraat)</td><td>Fisher</td><td>C79-500</td><td>Reagens voor Imbibing Solution</td></tr><tr><td>Imbibing Solution</td><td>zelfgemaakt</td><td>/</td><td>20 mM natriumsuccinaat, 20 mM calciumchloride, pH 5,0. Steriliseer door autoclavage voor gebruik.</td></tr><tr><td>chloramfenicol</td><td>Sigma</td><td>C0378</td><td>Bereid een 10 mg/mL stamoplossing in 70% ethanol.</td></tr><tr><td>vermiculiet</td><td>Fisher</td><td>NC0430369</td><td>Gebaten voor vermiculiet platen.</td></tr><tr><td>filterpapier cirkels (90 mm)</td><td>Whatman</td><td>1001 090</td><td>Gebaten voor vermiculiet en voor voorbereiding van korrels voor bombardement</td></tr><tr><td>Vermiculiet platen</td><td>zelfgemaakt</td><td>/</td><td>Voeg 50 mL vermiculiet toe aan een glazen petrischaal. Plaats een 90 mm papiercirkel op de vermiculiet. Autoclaveer.</td></tr><tr><td>tang (fijne punt)</td><td>Fisher</td><td>13-812-42</td><td>Gebaten voor het verwijderen van zaadmantel van gerstkorrels.</td></tr><tr><td>tang (ultrafijne punt)</td><td>Fisher</td><td>12-000-122</td><td>Gebaten voor het verwijderen van zaadmantel van gerstkorrels.</td></tr><tr><td>goude microcarriers (1,6 µm)</td><td>BioRad</td><td>1652264</td><td></td></tr><tr><td>macrocarriers</td><td>BioRad</td><td>1652335</td><td></td></tr><tr><td>calciumchloride (dihydraat)</td><td>Fisher</td><td>C79-500</td><td>Bereid een 2,5 M stamoplossing en bewaar 1 mL aliquots bij -20° C.</td></tr><tr><td>spermidine</td><td>Sigma</td><td>S0266</td><td>Bereid een 100 mM stamoplossing en bewaar 500 µL aliquots bij -20° C (gebruik binnen 2 maanden).</td></tr><tr><td>breekschijven (1550 psi)</td><td>BioRad</td><td>1652331</td><td></td></tr><tr><td>stopschermen</td><td>BioRad</td><td>1652336</td><td></td></tr><tr><td>macrocarrier houders</td><td>BioRad</td><td>1652322</td><td></td></tr><tr><td>Biolistic deeltjes leveringssysteem</td><td>BioRad</td><td>PDS-1000/He</td><td></td></tr><tr><td>natriumfosfaat monobasisch monohydraat</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td>Reagens voor 1M natriumfosfaat pH 7,2</td></tr><tr><td>natriumfosfaat dibasisch</td><td>Sigma</td><td>S9763</td><td>Reagens voor 1M natriumfosfaat pH 7,2</td></tr><tr><td>1M natriumfosfaat pH 7,2</td><td>zelfgemaakt</td><td>/</td><td>Combineer 6,9 g natriumfosfaat monobasisch monohydraat met 7,1 g natriumfosfaat dibasisch. Voeg water toe tot 100 mL. Voeg NaOH toe om pH 7,2 te krijgen.</td></tr><tr><td>dithiothrietol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>43819</td><td>Los op in water tot 1 M. Bewaar bij -20° in 1 mL aliquots.</td></tr><tr><td>leupeptin</td><td>Sigma</td><td>L2884</td><td>Los op in water tot 10 mg/mL. Bewaar bij -20° C.</td></tr><tr><td>glycerol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td>Bereid een 50% oplossing in water.</td></tr><tr><td>Slijpbuffer</td><td>zelfgemaakt</td><td>/</td><td>Combineer 10 mL van 1 M natriumfosfaat pH 7,2, 500 µL van 1 M DTT, 100 µL van 10 mg/mL leupeptin, en 40 mL van 50% glycerol. Voeg water toe tot 100 mL.</td></tr><tr><td>roestvrijstalen kralen (5 mm)</td><td>Qiagen</td><td>69989</td><td></td></tr><tr><td>2,0 mL buisjes</td><td>Eppendorf</td><td>22363352</td><td>Dit specifieke model buisje wordt aanbevolen voor gebruik met de homogenisator.</td></tr><tr><td>parels homogenisator (TissueLyser)</td><td>Qiagen</td><td>85210</td><td></td></tr><tr><td>12mm x 75 mm glazen testbuisjes</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>luciferine</td><td>Goldbio</td><td>LUCK-100</td><td>Bereid een 25 mM stamoplossing en bewaar 1 mL aliquots bij -20° C.</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A7699</td><td>Bereid een 100 mM stamoplossing en bewaar 250 µL aliquots bij -20° C.</td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td>Reagens voor 1M Tris sulfaat pH 7,7.</td></tr><tr><td>zwavelzuur</td><td>Sigma</td><td>258105</td><td>Reagens voor 1M Tris sulfaat pH 7,7.</td></tr><tr><td>1M Tris sulfaat pH 7,7</td><td>zelfgemaakt</td><td>/</td><td>Los 12,1 g Tris-base op in 100 mL water. Pas pH aan naar 7,7 met zwavelzuur.</td></tr><tr><td>magnesiumchloride</td><td>Sigma</td><td>M9397</td><td>Los op in water tot 2 M.</td></tr><tr><td>Luciferase Assay Buffer (LAB)</td><td>zelfgemaakt</td><td>/</td><td>Combineer 3 mL van 1 M Tris sulfaat pH 7,7, 500 µL van 2 M magnesiumchloride, 1 mL van 1 M DTT, en 200 µL van 0,5 M EDTA. Voeg water toe tot 50 mL.</td></tr><tr><td>Luciferase Assay Mixtuur</td><td>zelfgemaakt</td><td>/</td><td>Combineer 15 mL van LAB, 800 µL van 25 mM luciferine, 200 µL van 100 mM ATP, en 4 mL van water. Dit maakt genoeg assaymixtuur (20 mL) voor 100 luciferase assays.</td></tr><tr><td>luminometer (Sirius)</td><td>Berthold</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide (MUG)</td><td>Goldbio</td><td>MUG1</td><td>Los op in DMSO tot 100 mM.</td></tr><tr><td>natriumazied</td><td>Sigma</td><td>S8032</td><td>Bereid een 2% stamoplossing in water en bewaar 1 mL aliquots bij -20° C.</td></tr><tr><td>96 wells platen (standaard)</td><td>Fisher</td><td>12565501</td><td></td></tr><tr><td>GUS assay buffer</td><td>zelfgemaakt</td><td>/</td><td>Combineer 2,5 mL van MUG, 5 mL van 1 M natriumfosfaat pH 7,2, 400 µL van 0,5 M EDTA, 1 mL van 1 M DTT, 100 µL van 1

meten van de genexpressie in gebombardeerd gerst aleurone lagen met grotere gegevensdoorvoer

Measuring Gene Expression in Bombarded Barley Aleurone Layers with Increased Throughput

De aleurone laag van gerst korrels is een belangrijk model-systeem voor hormoon-gereglementeerde genexpressie in planten. In de aleurone cellen, genen nodig zijn voor de kieming of vroege zaailing ontwikkeling worden geactiveerd door Gibberelline (GA), terwijl genen geassocieerd met stress reacties worden geactiveerd door abscisic zuur (ABA). De mechanismen van GA en ABA signalering kunnen worden ondervraagd door de invoering van reporter gene constructies in aleurone cellen via deeltje bombardement, met de daaruit voortvloeiende voorbijgaande expressie gemeten met behulp van enzym testen. Een verbeterde protocol wordt gemeld dat gedeeltelijk automatiseert en stroomlijnt de korrel homogenisering stap en de enzym-vitrotests, waardoor aanzienlijk meer doorvoer dan bestaande methoden. Homogenisering van de korrel monsters wordt uitgevoerd met behulp van een geautomatiseerde weefsel homogenizer en GUS (β-glucuronidase) tests worden uitgevoerd met behulp van een 96-Wells plaatsysteem. Representatieve resultaten met behulp van het protocol suggereren dat fosfolipase D activiteit kan een belangrijke rol in het activeren van HVA1 genexpressie door ABA, door middel van de transcriptiefactor TaABF1.

De hier beschreven techniek kan worden gebruikt om elke test gene construct in aleurone cellen van gerst korrels. Het niveau van expressie van het test-gen kan vervolgens worden gemakshalve gemeten (Figuur 2). Het hogere doorvoer protocol beschreven hier sterk verhoogt de efficiency van de zaad slijpen en enzym assay stappen. Deze methode is gebruikt voor de beoordeling van het vermogen van de transcriptie factor TaABF15,<su...

Een verbeterde protocol wordt gepresenteerd voor de meting van voorbijgaande genexpressie van verslaggever constructies in gerst aleurone cellen na deeltje bombardement. De combinatie van geautomatiseerde graan malen met 96-wells-plaat enzym testen biedt hoge doorvoer voor de procedure.

Meten van de genexpressie in gebombardeerd gerst Aleurone lagen met grotere gegevensdoorvoer

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for ...

Het algemene doel van deze procedure is om genexpressie van reporterconstructen te meten na het introduceren ervan in gerstemeelzakjes door middel van deeltjesbombardement. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over door plantenhormonen gereguleerd genexpressie, zoals hoe specifieke signaalmoleculen abscisinezuur in gerstemeelzakjes geïnduceerde genen reguleren. Het grote voordeel van deze techniek is dat het een hogere doorvoer biedt dan eerdere methoden, waardoor een groot aantal genconstructen en incubatiecondities kan worden getest.Grace, een student in mijn lab, zal het protocol demonstreren. Plaats eerst een paar embryoloze korrels in het deksel van een 90 millimeter plastic petrischaaltje met 20 milliliter opneemoplossing en 20 microliter chlooramfenicol. Gebruik steriele pincetten om voorzichtig de doorzichtige zaadmantel van elke korrel te verwijderen.Het verwijderen van de zaadmantels van de gerstenkorrels is een kritische stap. Als de zaadmantels niet volledig worden verwijderd, zullen de gouden microdragers worden tegengehouden om de meelzakjes binnen te komen. Maar als het schillen te grof wordt gedaan, kunnen de meelzakjes worden beschadi

measuring-gene-expression-bombarded-barley-aleurone-layers-with

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Gen microarrays zijn krachtige tools in gen expressie profilering bij een genoom-brede niveau. Deze technologie heeft toepassing in een verscheidenheid van biologische disciplines, waaronder ontwikkelingsbiologie en toxicologie. In deze video, we detail een protocol voor de wereldwijde genexpressie analyse met behulp van een uitgebreid oligonucleotide microarray platform voor de zebravis.

Global analyse van genexpressie met behulp van een zebravis oligonucleotide microarray platform

We brengen verslag uit een methode voor de introductie, tracking en kwantitatieve analyse van de GFP expressie in plantencellen. Deze methode maakt gebruik van een speciaal ontworpen robotica systeem voor semi-continue foto collectie van grote aantallen monsters, in de tijd. We tonen ook aan het gebruik van ImageJ en ImageReady voor de analyse van foto-serie.

Robotica en Dynamic Image Analysis voor Studies van genexpressie in plantenweefsels

Macromoleculaire de handel tussen de plantencellen kan worden beoordeeld door kortstondig te drukken een fluorescent-gelabeld eiwit van belang en de analyse van de intra-en intercellulaire distributie door confocale microscopie.

Een cel-cel Macromoleculaire Transport Assay In Planta Door gebruik te maken biolistische Bombardement

We hebben uitgebreide, onpartijdige genoom-brede schermen van gen-drugs-en gen-omgeving interacties te begrijpen. Methoden voor het screenen van deze mutant collecties worden gepresenteerd.

Concurrerende Genomische Schermen van streepjescode Gist Bibliotheken

Twee aanvullende methoden op basis van flowcytometrie en microscopie gepresenteerd die de kwantificering van de enkele cel, de dynamiek van genexpressie geïnduceerd door de activering van MAPK route in gist mogelijk.

Temporele Kwantificering van MAPK geïnduceerde expressie in Single gistcellen

We ontwikkelden een protocol dat snel, gevoelig en reproduceerbaar is voor het profileren van pathogene genexpressie tijdens een infectie.

Genexpressie infecteren Microben Met behulp van een digitale Bar-codering Platform

Hier presenteren we een protocol met behulp van RNA-seq mRNA niveaus volgen na verloop van tijd tijdens de hypoxische reactie van S. cerevisiae cellen. Deze methode kan worden aangepast aan het analyseren van genexpressie tijdens elke cellulaire reactie.

Het meten van de mRNA niveaus na verloop van tijd tijdens de gist S. cerevisiae hypoxische reactie

Het protocol hier beschreven is gebaseerd op het genoom-brede kwantificeren van nieuw samengestelde mRNA gezuiverd van gistcellen aangeduid met 4-thiouracil. Deze methode maakt het mogelijk om het meten van de mRNA-synthese rekken van mRNA verval en biedt dus een nauwkeurige meting van RNA polymerase II transcriptie.

Saccharomyces cerevisiae Metabole labelen met 4-thiouracil en de kwantificering van gesynthetiseerd mRNA nieuw als een Proxy voor RNA Polymerase II activiteit

Een methode voor transcriptome profilering van granen wordt gepresenteerd. De op microarray gebaseerde genexpressieprofilering begint met de isolatie van hoogwaardig totaal RNA uit granen en gaat verder met de generatie van cDNA. Na cRNA-etikettering en microarray hybridisatie worden aanbevelingen gedaan voor signaaldetectie en kwaliteitscontrole.

Het verkrijgen van hoogwaardige transcriptoomgegevens van graanzaden door middel van een gewijzigde methode voor genexpressieprofilering

Hier gepresenteerd is een protocol voor laser-capture microdissection (LCM) van plantaardige weefsels. LCM is een microscopische techniek voor het isoleren van gebieden van weefsel op een contaminatievrije manier. De procedure omvat weefselfixatie, paraffine inbedding, sectioning, LCM en RNA extractie. RNA wordt gebruikt in de downstream weefselspecifieke, tijdelijk opgeloste analyse van transcripto's.

Laser-Capture Microdissection RNA-Sequencing voor ruimtelijke en temporale weefsel-specifieke genexpressie analyse in planten

Leer een verbeterd protocol voor het meten van genexpressie in gerst aleurone cellen via deeltjesbombardement. Deze methode combineert geautomatiseerd malen met 96-well plaat enzymassays voor hogere doorvoer.

Meten van de genexpressie in gebombardeerd gerst Aleurone lagen met grotere gegevensdoorvoer

Meer video's verkennen