Meten van de genexpressie in gebombardeerd gerst Aleurone lagen met grotere gegevensdoorvoer

Het algemene doel van deze procedure is om genexpressie van reporterconstructen te meten na het introduceren ervan in gerstemeelzakjes door middel van deeltjesbombardement. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over door plantenhormonen gereguleerd genexpressie, zoals hoe specifieke signaalmoleculen abscisinezuur in gerstemeelzakjes geïnduceerde genen reguleren. Het grote voordeel van deze techniek is dat het een hogere doorvoer biedt dan eerdere methoden, waardoor een groot aantal genconstructen en incubatiecondities kan worden getest.

Grace, een student in mijn lab, zal het protocol demonstreren. Plaats eerst een paar embryoloze korrels in het deksel van een 90 millimeter plastic petrischaaltje met 20 milliliter opneemoplossing en 20 microliter chlooramfenicol. Gebruik steriele pincetten om voorzichtig de doorzichtige zaadmantel van elke korrel te verwijderen.

Het verwijderen van de zaadmantels van de gerstenkorrels is een kritische stap. Als de zaadmantels niet volledig worden verwijderd, zullen de gouden microdragers worden tegengehouden om de meelzakjes binnen te komen. Maar als het schillen te grof wordt gedaan, kunnen de meelzakjes worden beschadigd.

Na het schillen van de zaadmantels van alle korrels, breng ze over van de petrischaaltje naar een vermiculietplaat. Plaats vervolgens de geschilde embryoloze korrels in een incubator bij 24 graden Celsius gedurende 16-20 uur. Label nu een buisje van 1,5 milliliter van elke behandeling die in het bombardementsexperiment zal worden opgenomen.

Voeg aan elke buis twee en een half microgram UBI luciferase interne controleplasmide, twee en een half microgram van een GUS reporterplasmide en de gewenste hoeveelheid van een effectorplasmide toe. Voeg ultrapuur water toe aan elke buis om het totale volume op vijf microliter te brengen. Voeg voor elke behandeling 50 microliter microdragers opgeschort in 50% glycerol toe aan elk buisje van 1,5 milliliter dat plasmide DNA bevat.

Bij de laatste stap van de microdragercoderingsprocedure, pipet acht microliter opgeschorte microdragers op elk van de vijf macrodragers en laat ze aan de lucht drogen. Zet het deeltjesbombardementsapparaat op door de vacuümpomp in te schakelen, de heliumklep te openen en vervolgens het deeltjesafleveringssysteem in te schakelen. Plaats een 1550 psi scheurafscherming in de vasthoudende dop en monteer deze op het deeltjesafleveringssysteem.

Plaats een macrodrager met de gewenste plasmidecombinatie met een stopscherm in de microdragerlanceerinrichting. Plaats de inrichting in de bovenste gleuf van de bombardementskamer. Schik vervolgens acht embryoloze korrels in een strakke radiale patroon met de dunnere uiteinden naar binnen op een filterpapiercirkel die plat op het deksel van een 90 milliliter petrischaaltje is vastgemaakt.

Plaats de schaal met de korrels in de bombardementskamer op een afstand van zes centimeter van het stopscherm. Sluit de deur en druk op de vacuümschakelaar om de bombardementskamer tot 95 kilopascal te ontluchten. Zet snel de vacuümschakelaar in de vasthoudpositie.

Houd vervolgens de vuurschakelaar ingedrukt om het monster te bombarderen. Nadat het vacuüm is losgelaten, breng de gebombardeerde korrels over naar een gelabeld 60 millimeter petrischaaltje met vier milliliter opneemoplossing met één milligram per milliliter chlooramfenicol. Herhaal dit totdat alle bombardementen zijn voltooid.

Vervolgens incubeer de gebombardeerde korrels op een schuddende platform bij 100 tpm bij 24 graden Celsius gedurende 24 uur. Gebruik pincetten om de acht gebombardeerde korrels uit het 60 millimeter petrischaaltje te verwijderen en dep ze droog op een papieren handdoek. Verdeel de korrels in twee gelabelde buisjes van twee milliliter, elk met 800 microliter maalbuffer en een vijf millimeter roestvrijstalen kraal.

Nadat de vorige stap voor alle gebombardeerde korrels is herhaald, plaats maximaal 48 buisjes van twee milliliter in twee rekken van een kraalhomogenisator. Monteer vervolgens de rekken op de homogenisator en schud de monsters gedurende drie minuten met 30 hertz. Wanneer u klaar bent, verwijdert u de rekken uit de homogenisator en plaatst u ze vijf minuten op ijs om de monsters opnieuw af te koelen.

Monteer nu de rekken in de tegenovergestelde richting op de homogenisator. Schud de monsters opnieuw gedurende drie minuten met 30 hertz. Nadat u de rekken uit de homogenisator hebt verwijderd, plaatst u ze vijf minuten op ijs om de monsters opnieuw af te koelen.

Centrifugeer vervolgens de graanextracten bij 16.000 G bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Decanteer onmiddellijk na de centrifugatie de heldere supernatanten in een tweede set microcentrifugebuisjes. Vortex elke buis kort en bewaar op ijs.

Na het overbrengen van het supernatant herstelt u de roestvrijstalen kralen van de pellets, zodat ze kunnen worden gewassen en opnieuw kunnen worden gebruikt. Voeg nu 200 microliter GUS-testbuffer toe aan elke put van een 96-welplateau. Plaats 50 microliter van elk graanextract in een van de putten en meng met de pipettepunt.

Versluit vervolgens de bovenkant van de plaat met afdichtfolie. Plaats de 96-welplateau in een incubator in het donker bij 37 graden Celsius gedurende 20 uur. Na de incubatie centrifugeert u de 96-welplateau bij 4.000 G bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten.

Wanneer u klaar bent, plaatst u de plaat op ijs. Voeg nu 250 microliter nulpunt twee molair natriumcarbonaat toe aan elke put van een zwarte 96-welplateau. Voeg zes punt twee vijf microliter van elk gecentrifugeerd GUS-testmengsel toe aan elke put van de zwarte plaat en meng met de pipettepunt.

Bevat putten met zes punt twee vijf microliter van 10-40 bij 100 micromolair, vier methylumbelliferoon als standaarden. Plaats de zwarte plaat in een platenfluorimeter. Lees de fluorescentie van methylumbelliferoon door de versterking van het instrument in te stellen, zodat een put met zes punt twee vijf microliter van 40 micromolair, vier methylumbelliferoon en 250 microliter nul