Collectie en extractie van beroepsmatige Air monsters voor analyse van schimmel DNA

Het algemene doel van deze luchtbemonsterings- en DNA-extractiemethodologie is om schimmel-genomisch DNA te verkrijgen dat kan worden versterkt, gesequenced en taxonomisch geplaatst om potentiële schimmelgevaren binnen beroepsmatige omgevingen te identificeren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van beroepsmatige blootstellingsbeoordeling, zoals aan welke schimmelgevaren werknemers worden blootgesteld die negatieve gezondheidseffecten kunnen veroorzaken. Het grote voordeel van deze techniek is dat schimmelsoorten die niet worden gedetecteerd met behulp van kweek- of microscopie-gebaseerde methoden, kunnen worden verduidelijkt met behulp van op sequencing gebaseerde benaderingen.

Om de luchtbemonsteringsfiltercassette te monteren, plaatst u een cellulosefiltersteunpad op het rasteroppervlak van het basisstuk en plaatst u vervolgens met behulp van filtertang een filter op het filtersteunpad met de verzamelzijde naar boven. Na het monteren verzegelt u de filtercassette door de verlengingskoker in te brengen en deze stevig en gelijkmatig naar beneden te drukken met een handmatige of pneumatische pers. Plaats vervolgens de gemonteerde cassette bovenop de NIOSH-aerosolomboog en drukt u deze zo veel mogelijk naar beneden.

Gebruik een stukje 19-millimeter tape om de buitenkant van de filtercassette en de ombouw te omwikkelen die de filtercassette op zijn plaats houdt en dient als back-upafdichting om lekkage te voorkomen. Schroef de verzamelbuizen stevig en volledig in de ombouw tot ze op de bodem zitten en wikkel de afdichttape om de buizen heen als secundaire afdichting tegen lekkage. Om persoonlijke aerosolbemonstering uit te voeren, plaatst u de ombouw binnen de ademzone van de persoon.

Bevestig de ombouw aan de revers, schouder of borst en houd vervolgens de bemonsteringspomp op taillehoogte of in een rugzak. Zet de pompen aan en controleer na een minuut of de pomp functioneert. Na het voltooien van de luchtbemonstering verzamelt u de luchtombouw van het onderwerp.

Verwijder de afdichttape, schroef de buizen los en zet vervolgens een dop op ze. Plaats het derde stuk filtercassette over de filter. Veeg eerst de bemonsteringscassette af met 70%ethanol en gebruik vervolgens een cassetteopeningstool om de bemonsteringscassette te openen terwijl u werkt in een biologisch veiligheidskabinet van klasse II.

Gebruik vervolgens een filterlifter om het steunpad en de filter omhoog te tillen. Gebruik vervolgens filtertang om de filter te verwijderen en plaats deze in een steriele petrischaal. Snijd de filter in zes gelijke stukken met een steriele scalpel en plaats deze vervolgens in een twee-milliliter versterkte buis met 300 milligram glaskralen van 200 tot 500 micrometer.

Dompel de filterbevattende buis 30 seconden in vloeibare stikstof en plaats deze vervolgens snel in een parelmolenhomogenisator met een snelheid van 4,5 meter per seconde gedurende 30 seconden. Voeg 0,5 milliliter lysebuffer toe aan buizen met de resterende kleine stukjes intacte filter en voeg vervolgens 0,3 milliliter lysebuffer toe aan de 15 en 1,5 milliliter luchtombouwverzamelbuizen en vortex de buizen in een rechtopstaande en omgekeerde positie gedurende respectievelijk 10 tot 15 seconden. Breng de lysebuffer van elke verzamelbuis over naar twee-milliliter versterkte buizen met 300 milligram glaskralen.

Verwerk de buizen in de parelmolenhomogenisator gedurende 30 seconden en centrifugeer vervolgens de monsters bij 20.000 maal de zwaartekracht gedurende één minuut bij 22 graden Celsius. Na centrifugatie brengt u het supernatant over in een steriele 1,5-milliliter microcentrifugebuis en centrifugeert u het supernatant opnieuw bij 20.000 maal de zwaartekracht gedurende één minuut bij 22 graden Celsius. Na het toevoegen van 30 microliter lysereagens incubeert u de buizen gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius.

Voeg vervolgens 0,2 milliliter bindingsbuffer en 100 microgram per milliliter Proteinase K toe aan de buis en laat de buizen gedurende 10 minuten incuberen in een blokhouder op 70 graden Celsius. Voeg tenslotte 100 microliter isopropanol toe aan elke buis. Plaats vervolgens glasvezelfilterbuizen met een capaciteit van 700 microliter in twee-milliliterverzamelbuizen en breng de extractoplossingen erin over.

Na overbrenging centrifugeert u de verzamelbuizen bij 20.000 maal de zwaartekracht gedurende 30 seconden bij 22 graden Celsius. Na centrifugatie plaatst u het glasvezelfilter in verse verzamelbuizen en gooit u de verzamelbuis weg. Voeg aan elke buis 0,5 milliliter inhibitorverwijderingsbuffer toe en voer centrifugatie uit bij 20.000 maal de zwaartekracht gedurende 30 seconden bij 22 graden Celsius.

Gooi de verzamelbuis weg na centrifugatie en plaats de filterbuizen in nieuwe verzamelbuizen. Voeg vervolgens 0,5 milliliter wasbuffer toe aan elke buis en onderwerpt u deze opnieuw aan centrifugatie bij 20.000 maal de zwaartekracht gedurende 30 seconden bij 22 graden Celsius. Gooi de verzamelbuis weg en vervang deze na de centrifugatie door nieuwe. Voeg opnieuw 0,5 milliliter wasbuffer toe aan elke buis en centrifugeer bij 20.000 maal de zwaartekracht gedurende 30 seconden bij 22 graden Celsius. Om eventueel resterend wasbuffer te verwijderen, centrifugeert u tenslotte de verzamelbuizen bij 20.000 maal de zwaartekracht gedurende één minuut bij 22 graden Celsius en gooit u de verzamelbuizen weg en vervangt u ze door nieuwe. Na het toevoegen van 100 microliter warme elutiebuffer, incubeert u de buizen op de laboratoriumbank bij kamertemperatuur gedurende één tot twee minuten en centrifugeert u de verzamelbuizen bij 20.000 maal de zwaartekracht gedurende 30 seconden bij 22 graden Celsius.

Plaats de filterbuizen in een steriele 1,5-milliliter microcentrifugebuis en voer opnieuw de eluaten aan voor een andere ronde centrifugatie. Gebruik 0,5 milliliter PCR-buizen om 50-microliterreacties in drievoudig op te zetten met vijf microliter reeds geëxtraheerd DNA voor elke reactie