Chromatine verspreid preparaten voor de analyse van muis oöcyt progressie van profase naar metafase II

Het algemene doel van deze chromatine-uitbreidingsvoorbereiding is om chronologisch de dynamische lokalisatiepatronen van chromatine-gebonden eiwitten en de morfologie van chromosomen van oöcyten gedurende de oögenese van zoogdieren te visualiseren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van vrouwelijke reproductieve biologie, zoals homologe chromosoomparing, synapsis, DNA-reparatie en meiotische chromosoomsegregatie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het duidelijke immunolabeling en visualisatie mogelijk maakt van eiwitten die aan chromosomen zijn geassocieerd en de beoordeling van de ploïdheid van oöcyten.

Oögenese is foutgevoelig en chromosoommislokalisatie leidt vaak tot genetische ziekten. Deze methode kan worden gebruikt om ons begrip van maternale oorzaken van aneuploïdie en onvruchtbaarheid te verbeteren. Na het euthanaseren van een vrouwelijke muis die 14 tot 19 dagen post-coitum is, maak een V-vormige opening in de abdominopelvische holte.

Verwijder vervolgens de maternale baarmoederhoorn. Scheid vervolgens de embryo's van de placenta en offer de embryo's op door decapiteren. Breng ze dan over naar een 35-millimeter petrischaal met drie milliliter PBS bij 37 graden Celsius.

Verplaats vervolgens één jong naar een aparte schotel die ook is geladen met warm PBS. Na het euthanaseren van de foetus, maak een snede langs de ventrale middenlijn van de achterste helft, langs de voorste helft onder de voorpoten, en direct boven de achterpoten en staart. Open vervolgens de buik van het embryo met 3,5-inch schaar.

Gebruik een fijnpuntstang om de lever en darmen te verplaatsen of verwijderen, waardoor de geslachtsklieren zichtbaar worden. Bepaal nu of de geslachtsklieren mannelijke of vrouwelijke klieren zijn. De eierstokken bevinden zich direct onder en achter de nier, richting de achterste wand van de buikholte.

Verwijder beide eierstokken met een paar fijnpuntstang en breng ze over in een klein bakje met PBS dat op 37 graden Celsius wordt gehouden. Verzamel snel de eierstokken van alle foetussen. Dompel vervolgens in een nieuwe kleine container elke afzonderlijke set eierstokken volledig in een halve milliliter vers gemaakte hypo-extractiebuffer.

Laat ze incuberen bij 25 graden Celsius gedurende ten minste 15 minuten, maar niet meer dan 30 minuten. Gedurende de incubatie, gebruik een hydrofobe barrière PAP-pen om twee 22 bij 22 millimeter vierkanten op een schone glazen plaat te tekenen. Bereid één plaat voor elke set eierstokken.

Wanneer de incubatie voltooid is, voeg een druppel van 50 microliter 100 millimolair sucrose toe aan een schone plaat en breng één paar eierstokken in de druppel over. Gebruik nu twee naalden van 27 gauge om de eierstokken te prikkelen en de cellen daarin te vrijmaken. Verwijder en gooi met een tang de grote stukken ovarium weg.

Pipetteer vervolgens voorzichtig de sucrose-oplossing om de vrijgemaakte cellen te verspreiden. Laad vervolgens elk vierkant op een plaat met 40 microliter 1% PFA met 0,2% Triton X-100. Verspreid de oplossing rond het vierkant met behulp van een pipettentip of door de plaat heen en weer te schudden.

Laad vervolgens voor elke pool van sucrose-oplossing met cellen twee fixatiepoelen met 20 microliter gesuspendeerde cellen zodat elke plaat cellen van één set eierstokken heeft. Voor het verzamelen van MI- of MII-oöcyten, bereid en euthanaseer eerst de donormuis. Maak vervolgens een grote V-vormige opening in de abdominopelvische holte en gebruik een tang om de darmen te verplaatsen om elk baarmoederhoorn te lokaliseren.

Zoek de eierstokken in de buurt van de ribbenkast. Houd de eileider vast met een fijne tang en snijd het vet boven de ovarium met dissectieschaartjes. Terwijl u de eileider vasthoudt, gebruikt u een fijne tang om het ovarium los te maken van de bursa en brengt u de eierstokken over in een verzamelbakje met medium dat op 37 graden Celsius wordt gehouden.

Om GV-fase-oöcyten te verzamelen, gebruikt u een spuit van één milliliter met een naald van 27 gauge om de cumulus-oöcyte-complexen vrij te maken door de grote antrale follikels handmatig te puncteren. Om MII-fase-oöcyten te verzamelen, scheurt u een gat in de ampul van de eileider om ze vrij te maken in plaats van alleen een punctie te maken. Verzamel nu de oöcyten met behulp van een mondbediende glazen pipet of capillair, of gebruik een handbediende micrometer-spuit.

Sommige oöcyten kunnen omgeven zijn met cumuluscellen, andere niet. Voor de MI-oöcyten, bereid vers hyaluronidase in MEM-alpha/BSA om de oöcyten van de omringende cumuluscellen te ontdoen. Behandel voor elke verzameling oöcyten ze in een incubator met 2,5 milliliter bereide hyaluronidase gedurende drie minuten.

Breng vervolgens de MI-oöcyten over naar vers gemaakt warm MEM-alpha/BSA-medium. Gebruik daar een mondbediende glazen pipet om de afschurende kracht te leveren die nodig is om de cumuluscellen volledig los te maken. Over het algemeen vereist het succes van deze procedure de beheersing van oöcytenverzameling en -manipulatie met behulp van mondbediende glazen pipetten of capillairen.

Laat de oöcyten herstellen in de incubator. Ondertussen, laad in een verwarmde negen-wellplak 300 microliter warme Tyrode-oplossing. Laad twee putjes met 300 microliter warm MEM-alpha/BSA, en laad één putje met 300 microliter warm Waymouth-medium.

Om de zona pellucida te verwijderen, breng vijf tot tien MI- of MII-fase-oöcyten over in het bad van Tyrode-oplossing gedurende 30 tot 45 seconden terwijl u ze observeert onder een dissectiemicroscoop. Wanneer de zona pellucida zichtbaar is opgelost, breng de oöcyten onmiddellijk over naar het medium met behulp van een pipet vooraf bevochtigd met MEM-alpha/BSA-medium. Breng vervolgens de oöcyten over naar een tweede bad met verwarmd medium.

Na de tweede bad, breng de oöcyten over naar warm