Name: Twee-dimensionale gelelektroforese gekoppeld aan massaspectrometrie methoden voor een analyse van menselijke hypofyse adenoom weefsel Proteoom (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 34 s
Description: Leer tweedimensionale gelelektroforese gekoppeld aan massaspectrometrie voor proteoomanalyse van menselijk hypofyse adenoomweefsel. Deze methode identificeert eiwitten met hoge gevoeligheid.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door de nationale stichting van de natuurwetenschappen van China (Grant No. 81572278 en 81272798 naar XZ), de subsidies van China "863" Plan Project (Grant No. 2014AA020610-1 tot XZ), de Xiangya ziekenhuis fondsen voor Talent inleiding (tot XZ) en de Hunan Provinciale Natural Science Foundation van China (Grant No. 14JJ7008 aan XZ). De auteurs erkennen ook de wetenschappelijke bijdrage van Dr. Dominic M. Desiderio in de Universiteit van Tennessee Health Science Center. X.Z. voortdurend ontwikkeld en 2DE-MS-methoden gebruikt voor het analyseren van de hypofyse adenoom Proteoom vanaf 2001, bedacht het concept voor het huidige manuscript schreef en herziene versie van het manuscript, de relevante werkzaamheden gecoördineerd en was verantwoordelijk voor de financiële steun en bijbehorende werk. Y.L. nam deel aan de herziening van het manuscript. Y.H deelgenomen aan collectie verwijzingen naar, en herziening van het manuscript. Alle auteurs goedgekeurd het laatste manuscript.

<ol><li>Zhan, X., Wang, X., Cheng, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pituitary+adenoma+proteomics%3A+new+progresses+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Human pituitary adenoma proteomics: new progresses and perspectives.</a> Front. Endocrinol. 7 (54), (2016).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+proteomics+analysis+of+human+pituitary+adenomas%3A+Current+status+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom.+Rev%22%5BJournal%5D)">Comparative proteomics analysis of human pituitary adenomas: Current status and future perspectives.</a> Mass Spectrom. Rev. 24 (6), 783-813 (2005).</li>
<li>Wang, X., Guo, T., Peng, F., Long, Y., Mu, Y., Yang, H., Ye, N., Li, X., Zhan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+and+functional+profiles+of+a+follicle-stimulating+hormone-positive+human+nonfunctional+pituitary+adenoma%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Proteomic and functional profiles of a follicle-stimulating hormone-positive human nonfunctional pituitary adenoma.</a> Electrophoresis. 36 (11-12), 1289-1304 (2015).</li>
<li>Karppinen, A., Kivipelto, L., Vehkavaara, S., Ritvonen, E., Tikkanen, E., Kivisaari, R., Hernesniemi, J., Setälä, K., Schalin-Jäntti, C., Niemelä, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transition+from+microscopic+to+endoscopic+transsphenoidal+surgery+for+nonfunctional+pituitary+adenomas%5BTitle%5D)+AND+%22World+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Transition from microscopic to endoscopic transsphenoidal surgery for nonfunctional pituitary adenomas.</a> World Neurosurg. 84 (1), 48-57 (2015).</li>
<li>Liu, X., Ma, S., Dai, C., Cai, F., Yao, Y., Yang, Y., Feng, M., Deng, K., Li, G., Ma, W., Xin, B., Lian, W., Xiang, G., Zhang, B., Wang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiproliferative%2C+antiinvasive%2C+and+proapoptotic+activity+of+folate+receptor+%CE%B1-targeted+liposomal+doxorubicin+in+nonfunctional+pituitary+adenoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Antiproliferative, antiinvasive, and proapoptotic activity of folate receptor α-targeted liposomal doxorubicin in nonfunctional pituitary adenoma cells.</a> Endocrinol. 154 (4), 1414-1423 (2013).</li>
<li>Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pituitary+adenoma+nitroproteomics%3A+current+status+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Oxid.+Med.+Cell.+Longev%22%5BJournal%5D)">Pituitary adenoma nitroproteomics: current status and perspectives.</a> Oxid. Med. Cell. Longev. 2013, 580710(2013).</li>
<li>Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+analysis+of+nitrotyrosine-containing+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom.+Rev%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry analysis of nitrotyrosine-containing proteins.</a> Mass Spectrom. Rev. 34 (4), 423-448 (2015).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reference+map+of+a+pituitary+adenoma+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">A reference map of a pituitary adenoma proteome.</a> Proteomics. 3 (5), 699-713 (2003).</li>
<li>Desiderio, D. M., Zhan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+study+of+the+human+pituitary+proteome%3A+The+characterization+of+differentially+expressed+proteins+in+an+adenoma+compared+to+a+control%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A study of the human pituitary proteome: The characterization of differentially expressed proteins in an adenoma compared to a control.</a> Cell. Mol. Biol. 49 (5), 689-712 (2003).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+analysis+of+the+human+pituitary+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity analysis of the human pituitary proteome.</a> Clin. Chem. 49 (10), 1740-1751 (2003).</li>
<li>Zhan, X., Evans, C. O., Oyesiku, N. M., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+and+tanscriptomics+analyses+of+secretagogin+down-regulation+in+human+non-functional+pituitary+adenomas%5BTitle%5D)+AND+%22Pituitary%22%5BJournal%5D)">Proteomics and tanscriptomics analyses of secretagogin down-regulation in human non-functional pituitary adenomas.</a> Pituitary. 6 (4), 189-202 (2003).</li>
<li>Moreno, C. S., Evans, C. O., Zhan, X., Okor, M., Desiderio, D. M., Oyesiku, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+molecular+signaling+in+human+clinically+non-functional+pituitary+adenomas+identified+by+gene+expression+profiling+and+proetomic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Novel molecular signaling in human clinically non-functional pituitary adenomas identified by gene expression profiling and proetomic analyses.</a> Cancer Res. 65 (22), 10214-10222 (2005).</li>
<li>Zhan, X., Wang, X., Long, Y., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+analysis+of+the+proteomes+in+clinically+nonfunctional+pituitary+adenomas%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med.+Genomics%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity analysis of the proteomes in clinically nonfunctional pituitary adenomas.</a> BMC Med. Genomics. 7, (2014).</li>
<li>Zhan, X., Giorgianni, F., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+analysis+of+growth+hormone+isoforms+in+the+human+pituitary%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomics analysis of growth hormone isoforms in the human pituitary.</a> Proteomics. 5 (5), 1228-1241 (2005).</li>
<li>Kohler, M., Thomas, A., Püschel, K., Schänzer, W., Thevis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+human+pituitary+growth+hormone+variants+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of human pituitary growth hormone variants by mass spectrometry.</a> J. Proteome Res. 8 (2), 1071-1076 (2009).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+pituitary+nitroproteome%3A+detection+of+nitrotyrosyl-proteins+with+two-dimensional+Western+blotting%2C+and+amino+acid+sequence+determination+with+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">The human pituitary nitroproteome: detection of nitrotyrosyl-proteins with two-dimensional Western blotting, and amino acid sequence determination with mass spectrometry.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 325 (4), 1180-1186 (2004).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitroproteins+from+a+human+pituitary+adenoma+tissue+discovered+with+a+nitrotyrosine+affinity+column+and+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Nitroproteins from a human pituitary adenoma tissue discovered with a nitrotyrosine affinity column and tandem mass spectrometry.</a> Anal. Biochem. 354 (2), 279-289 (2006).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linear+ion-trap+mass+spectrometric+characterization+of+human+pituitary+nitrotyrosine-containing+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Linear ion-trap mass spectrometric characterization of human pituitary nitrotyrosine-containing proteins.</a> Int. J. Mass Spectrom. 259, 96-104 (2007).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M., Wang, X., Zhan, X., Guo, T., Li, M., Peng, F., Chen, X., Yang, H., Zhang, P., Li, X., Chen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+proteomic+variations+of+invasive+relative+to+noninvasive+nonfunctional+pituitary+adenomas%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Identification of the proteomic variations of invasive relative to noninvasive nonfunctional pituitary adenomas.</a> Electrophoresis. 35 (15), 2184-2194 (2014).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+pathway+networks+mined+from+human+pituitary+adenoma+proteomics+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med.+Genomics%22%5BJournal%5D)">Signal pathway networks mined from human pituitary adenoma proteomics data.</a> BMC Med. Genomics. 3, 13(2010).</li>
<li>O’Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+two-dimensional+electrophoresis+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins.</a> J. Biol. Chem. 250 (10), 4007-4021 (1975).</li>
<li>Klose, J., Kobalz, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+electrophoresis+of+proteins%3A+an+updated+protocol+and+implications+for+a+functional+analysis+of+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional electrophoresis of proteins: an updated protocol and implications for a functional analysis of the genome.</a> Electrophoresis. 16 (6), 1034-1059 (1995).</li>
<li>Zhan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+of+two-dimensional+gel+electrophoresis+and+multi-dimensional+liquid+chromatography+as+proteomic+separation+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Chromatogr.+Sep.+Tech%22%5BJournal%5D)">Current status of two-dimensional gel electrophoresis and multi-dimensional liquid chromatography as proteomic separation techniques.</a> Ann. Chromatogr. Sep. Tech. 1 (2), 1009(2015).</li>
<li>Wasinger, V. C., Cordwell, S. J., Cerpa-Poljak, A., Yan, J. X., Gooley, A. A., Wilkins, M. R., Duncan, M. W., Harris, R., Williams, K. L., Humphery-Smith, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+with+gene-product+mapping+of+the+Mollicutes%3A+Mycoplasma+genitalium%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Progress with gene-product mapping of the Mollicutes: Mycoplasma genitalium.</a> Electrophoresis. 16, 1090-1094 (1995).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+the+spatial+and+quantitative+reproducibility+between+two+second-dimensional+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Differences in the spatial and quantitative reproducibility between two second-dimensional gel electrophoresis.</a> Electrophoresis. 24 (11), 1834-1846 (2003).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spot+volume+vs.+amount+of+protein+loaded+onto+a+gel.+A+detailed%2C+statistical+comparison+of+two+gel+electrophoresis+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Spot volume vs. amount of protein loaded onto a gel. A detailed, statistical comparison of two gel electrophoresis systems.</a> Electrophoresis. 24 (11), 1818-1833 (2003).</li>
<li>Zhan, X. Two-dimensional electrophoresis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZhan%2C+X+%22Experimental+Protocols+for+Medical+Molecular+Biology+in+Chinese+and+English%22">Experimental Protocols for Medical Molecular Biology in Chinese and English</a>. Zheng, W. , Peking Union Medical College Press. Beijing. 93-108 (2005).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Electrophoresis+in+Practice%3A+A+guide+to+Methods+and+Applications+of+DNA+and+Protein+Separations%22">Electrophoresis in Practice: A guide to Methods and Applications of DNA and Protein Separations</a>. Westermeier, R. , VCH Wiley. Weinheim. (1997).</li>
<li>Zhan, X., Yang, H., Peng, F., Li, J., Mu, Y., Long, Y., Cheng, T., Huang, Y., Li, Z., Lu, M., Li, N., Li, M., Liu, J., Jungblut, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+many+proteins+can+be+identified+in+a+2DE+gel+spot+within+an+analysis+of+a+complex+human+cancer+tissue+proteome%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">How many proteins can be identified in a 2DE gel spot within an analysis of a complex human cancer tissue proteome?</a> Electrophoresis. , (2018).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat er geen conflict van belang is.

2de, met inbegrip van de 2DE-MS PMF en 2DE-MS/MS, MS-methoden wordt gekoppeld is met succes gebruikt in onze lange termijn programma - het gebruik van proteomics menselijke NFPA proteomic variaties en moleculaire netwerk variaties voor de opheldering van het moleculaire mechanismen te bestuderen en ontdekking van effectieve biomarkers voor NFPAs. 2de gebaseerde vergelijkende proteomics met goede reproduceerbaarheid speelt een belangrijke rol bij de identificatie van de NFPA proteomic variaties9<su...

PA is een gemeenschappelijk tumor dat zich voordoet in de menselijke hypofyse in de hypothalamus-hypofyse-gerichte as orgaansystemen, die een belangrijke rol in de menselijke hormoonhuishouding spelen. PA bevat klinisch functionele en functioneert PAs (FPA en NFPA)1,2. NFPA is moeilijk in de vroege fase diagnose en therapie door slechts licht verhoogde hormoonspiegels (bijvoorbeeldLH en FSH) in het bloed in vergelijking met de FPA, die aanzienlijk niveaus van overeenkomstige hormonen in bloed3,4 verhoogde heeft ,5. De verduidelijking van de moleculaire mechanismen en ontdekking van effectieve biomarkers heeft belangrijke klinische betekenis in de diagnose, therapie en prognose van NFPA. Ons langetermijndoel is te ontwikkelen en gebruiken van proteomic methoden voor de analyse van NFPA voor de ontdekking van betrouwbare biomarkers te verduidelijken van de moleculaire mechanismen en herkennen van effectieve therapeutische doelen evenals diagnostische en prognostische markeringen. 2-DE combinatie met MS-methoden zijn uitgebreid gebruikt in onze lange termijn onderzoeksprogramma met betrekking tot menselijke PA Proteoom1,2,6,7, met inbegrip van de oprichting van Proteoom referentie 3,8, analyse van differentially uitgedrukte proteïnen profielen9,10,11,12,13, hormoon varianten14 kaarten ,15, posttranslationele modificaties zoals fosforylatie14 en tyrosine nitratie16,17,18, de proteomic variatie van invasieve ten opzichte noninvasive NFPAs19, en de heterogeniteit van proteomic NFPA subtypen13, die tot de ontdekking van meerdere belangrijke traject netwerken (mitochondriale dysfunctie, celcyclus disregulatie, oxidatieve stress en MAPK signalering leidde systeem de abnormaliteit) die worden gewijzigd in NFPA13,19,20.
2de scheidt proteïnen volgens hun elektrisch punt (pI) (elektrisch gericht, IEF) en moleculair gewicht (via natrium dodecyl sulfaat polyacrylamide-gelelektroforese, SDS-PAGE)1,2,3, 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23. Dit is een gemeenschappelijke en klassieke scheiding techniek op het gebied van proteomics, sinds de invoering van de begrippen van de Proteoom en proteomics in 199524. MS is de cruciale techniek voor het vinden van de identiteit van de 2DE gescheiden eiwitten, met inbegrip van PMF en MS/MS strategieën. De razendsnelle ontwikkeling van MS instrumenten, met name in de aspecten van detectie gevoeligheid en resolutie, in combinatie met de verbetering van de LC systeem, sterk verbetert de identiteit van de laag of zeer laag overvloed eiwitten in een Proteoom te maximaliseren de dekking van een Proteoom. Het daagt ook onze traditionele concepten dat slechts één of twee eiwitten aanwezig zijn in een plek in een analyse van de complexe menselijke weefsels Proteoom 2D gel en biedt een kans om het identificeren van meerdere eiwitten in een 2D gel ter plaatse in een analyse van de complexe menselijke weefsels Proteoom en de dekking van de NFPA Proteoom te maximaliseren.
Hier beschrijven we gedetailleerde protocollen van 2DE-MALDI MS PMF, 2DE-MALDI-MS/MS en 2DE-LC-MS/MS die met succes zijn gebruikt bij de analyse van menselijke NFPA Proteoom. De protocollen zijn voorbereiding van monsters, eerst dimensie (elektrisch gericht, IEF), tweede dimensie (SDS-PAGE), visualisatie van eiwitten (Zilveren kleuring en Coomassie blue kleuring), beeld analyse van 2D gel, in-gel trypsine spijsvertering, zuivering van al peptiden, PMF, MS/MS en schroeiende3,8,25,26-database. Dit protocol vertaalt bovendien gemakkelijk voor de analyse van de proteomes van andere menselijke weefsels.

<table><tbody><tr><td>Ettan IPGphor 3&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>iso-elektrisch focussysteem.</td></tr><tr><td>Ettan DALTsix multigel caster</td><td>Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ettan DALT II System</td><td>Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA</td><td></td><td>Het verticale elektroforesesysteem</td></tr><tr><td>Ettan IPGphor strip holder</td><td>Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ettan DALTsix multigel caster</td><td>Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA</td><td></td><td>Multigel caster</td></tr><tr><td>Voyager DE STR MALDI-TOF MS&nbsp;</td><td>ABI, Foster City,CA</td><td></td><td>MALDI-MS PMF</td></tr><tr><td>MALDI-TOF-TOF</td><td>Autoflex III, Bruker</td><td></td><td>MALDI-MS/MS massaspectrometer</td></tr><tr><td>LTQ-OrbiTrap Velos Pro ETD</td><td>Thermo Scientific, Waltham, MA, USA</td><td></td><td>ESI-MS/MS massaspectrometer</td></tr><tr><td>EASY-nano LC system&nbsp;</td><td>Proxeon Biosystems, Odense, Denmark</td><td></td><td>Hogeprestatievloeistofchromatografiesysteem</td></tr><tr><td>PepMap C18 trap column&nbsp;</td><td>300 &mu;m i.d. &times; 5 mm lengte; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RP C18 column</td><td>75 &mu;m i.d., 15 cm lengte; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KimWipe</td><td>Kimvipe&nbsp;</td><td></td><td>Onoplosbaar papieren handdoek</td></tr><tr><td>Watter</td><td>Gemaakt door PURELAB flex instrument</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polytron Model P710/35 homogenisator</td><td>Brinkmann Instruments, Westbury, NY</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDQuest</td><td>Bio-Rad,&nbsp; Hercules, CA</td><td></td><td>2D gelbeeldanalysesoftware</td></tr><tr><td>SEQUEST&nbsp;</td><td>Thermo Proteome Discoverer 1.3 (versienummer 1.3.0.339)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DataExplore (ver. 4.0.0.0) software</td><td></td><td></td><td>MS spectrumverwerkingssoftware</td></tr><tr><td>Mascot software</td><td></td><td></td><td>PMF-gebaseerde eiwitzoeksoftware&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>Mascot software</td><td></td><td></td><td>MS/MS-gebaseerde eiwitzoeksoftware</td></tr><tr><td>Proteome Discoverer software v.1.3 beta</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xcalibur software v.2.1</td><td></td><td></td><td>MS/MS data-acquired management software&nbsp;</td></tr><tr><td>Uniprot versie 201410.1_HUMAN.fasta</td><td></td><td></td><td>Menselijk eiwitdatabestand</td></tr><tr><td>SEQUEST (versienummer 1.3.0.339)&nbsp;</td><td></td><td></td><td>MS/MS-gebaseerde eiwitzoeksoftware I</td></tr><tr><td>MASCOT (versie 2.3.02)&nbsp;</td><td></td><td></td><td>MS/MS-gebaseerde eiwitzoeksoftware II</td></tr><tr><td>C18 ZipTip microcolumn</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PeptideMass Standard kit&nbsp;</td><td>Perspective Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit&nbsp;</td><td>Thermo&nbsp;Fisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>2-D Quant Kit</td><td>GE Healthcare</td><td>80-6483-56</td><td></td></tr><tr><td>BIS-ACRYLAMIDE</td><td>AMRESCO</td><td>0172</td><td></td></tr><tr><td>ACRYLAMIDE</td><td>AMRESCO</td><td>0341</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Thiourea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8656</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>VETEC</td><td>V900119</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>AMRESCO</td><td>0227</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>AMRESCO</td><td>0465</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>AMRESCO</td><td>M146</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Persulfate</td><td>AMRESCO</td><td>M133</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Promega, Madison, WI, USA</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>IPG buffer pH 3-10, NL</td><td>GE Healthcare</td><td>17-6000-87</td><td></td></tr><tr><td>Immobiline Dry Strip pH 3-10NL,18cm</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1235-01</td><td></td></tr></tbody></table>

twee-dimensionale gelelektroforese gekoppeld aan massaspectrometrie methoden voor een analyse van menselijke hypofyse adenoom weefsel proteoom

Two-dimensional Gel Electrophoresis Coupled with Mass Spectrometry Methods for an Analysis of Human Pituitary Adenoma Tissue Proteome

Menselijke hypofyse-adenoom (PA) is een gemeenschappelijk tumor die voorkomt in de menselijke hypofyse in de as orgaansystemen hypothalamus-hypofyse-gericht, en kan worden aangemerkt als klinisch functionele of deactiveren PA (FPA en NFPA). NFPA is moeilijk voor vroege fase diagnose en therapie toe te schrijven aan de hormonen in het bloed in vergelijking met de FPA nauwelijks te verheffen. Ons langetermijndoel is het gebruik van proteomics methoden om te ontdekken van betrouwbare biomarkers voor verduidelijking van moleculaire mechanismen van PA en erkenning van doeltreffende diagnostische, voorspellende markers en therapeutische doelen. Effectieve tweedimensionale elektroforese van het gel (2DE) gekoppeld aan massaspectrometrie (MS) methoden werden hier gepresenteerd voor het analyseren van menselijke PA-proteomes, met inbegrip van de voorbereiding van de monsters, 2D gelelektroforese, eiwit visualisatie, beeldanalyse, in-gel spijsvertering van de trypsine, peptide massa vingerafdruk (PMF) en tandem massaspectrometrie (MS/MS). 2-dimensionale gel elektroforese laser matrix-bijgewoonde desorptie/ionisatie massaspectrometrie PMF (2DE-MALDI MS PMF), 2DE-MALDI-MS/MS en MS/MS-methoden van 2DE-vloeibare chromatografie (LC) met succes zijn toegepast in een analyse van de NFPA Proteoom. Met het gebruik van een hoog-gevoeligheids-massaspectrometer, werden veel eiwitten geïdentificeerd met de 2DE-LC-MS/MS methode in elke plek in een analyse van complexe PA weefsel te maximaliseren van de dekking van menselijke PA Proteoom 2D gel.

1. 2DE-MALDI MS PMF: met de experimentele procedure hierboven beschreven, een totaal van 150 µg eiwitten werden gehaald uit FSH-uitgedrukt NFPA weefsels (vrouw, 50 jaar oud, ACTH (-), GH (-), PRL (-), LH (-), FSH (+), en TSH (-)) en bekleed met een 18 cm IPG strip (pH 3-10 NL) en een grootformaat SDS-pagina gel, dan gevisualiseerd met zilveren kleuring. We verkregen een reproduceerbare en goede 2DE gel patroon van NFPA weefsel Proteoom (<strong class="xfi...

Hier presenteren we een twee-dimensionale gelelektroforese (2DE) dat is gekoppeld aan massaspectrometrie (MS) te scheiden en te identificeren menselijke hypofyse adenoom weefsel Proteoom, waarin een goede en reproduceerbare 2DE patroon. Veel eiwitten worden bij elke 2DE plek waargenomen bij het analyseren van complexe kanker Proteoom met het gebruik van hoog-gevoeligheids MS.

Twee-dimensionale gelelektroforese gekoppeld aan massaspectrometrie methoden voor een analyse van menselijke hypofyse adenoom weefsel Proteoom

Human pituitary adenoma (PA) is a common tumor that occurs in the human pituitary gland in the hypothalamus-pituitary-targeted organ axis systems, and may ...

Het algemene doel van deze tweedimensionale gelelektroforese gecombineerd met massaspectrometrie procedure is om het menselijke hypofyse adenoom weefsel proteoom te scheiden en te identificeren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen op het gebied van proteomics. Zoals hoog proteoom.En de ontdekking van eiwitsituatie, eiwit vier en eiwitruimte. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat tweedimensionale gelelektroforese gemakkelijk kan worden gekoppeld aan hooggevoelige massaspectrometrie om proteoom te identificeren, vooral eiwitten met lage abundantie. Eiwitsituatie, eiwit vier en eiwitruimte.De implementaties van deze techniek zijn gericht op PQ iterie van diertherapie. Vanwege de belangrijke eiwitten voor eiwitruimte of eiwitpatroon zijn nuttig bij de diagnose van patiënten. We tonen een demonstratie van deze methode als de tweedimensionale gelelektroforese stappen moeilijk te leren zijn omdat het tijdrovend en arbeidsintensief is en er verschillende experimentele trucs zijn.Om deze procedure te beginnen, voegt u 250 microliter van een eerder bereide eiwitmonsteroplossing toe aan elke sleuf van een 13 centimeter IPG-striphouder. Plaats een 18 centimeter IPG-strip, gelzijde naar beneden, op elke eiwitmonsteroplossing en zorg ervoor dat u geen bubbels maakt. Voeg vervolgens drie tot vier milliliter minerale olie toe om elke IPG-strip te bedekken.Monteer vervolgens elke IPG-striphouder in een iso-elektrisch focussysteem met de puntige kant op de achterplaat en de vierkante kant op de voorplaat. Na het rehydreren van de IPG-strips gedurende 18 uur bij kamertemperatuur, stelt u de IEF-parameters in op het iso-elektrisch focussysteem met een totale looptijd van 7,5 uur en 36.875 volt uur. Na IEF, verwijdert u elke IPG-strip uit het iso-elektrisch focussysteem en verwijdert u het overtollige minerale olie met een onoplosbaar papieren handdoek.Wikt vervolgens elke strip in een laag plasticfolie en bewaart bij min 80 graden Celsius. Om een 12%PAGE-gel te gieten, voegt u dubbel gedistilleerd water, 1,5 molair tris-hydrochloride buffer, 40% acrylamide, bis-acrylamide stockoplossing, 10% immodiumpersulfaat en een timer toe aan een beker. Meng de geloplossing voorzichtig en zorg ervoor dat u geen bubbels maakt.Giet de geloplossing voorzichtig in een multigietkamer tot de verwachte gelhoogte van 19 centimeter. Voeg onmiddellijk ongeveer drie milliliter dubbel gedistilleerd water toe aan de multigietkamer om elke resilverende gel te bedekken en laat elke gel ongeveer een uur polymeriseren. Deze stap is erg belangrijk om een hoogwaardige SDS-PAGE-gel te bereiden en het water moet onmiddellijk bovenop elke gel worden toegevoegd.Bereid twee liter elektroforesebuffer en voeg de buffer toe aan de elektroforesescheidingseenheid buffertank. Nadat de gefocuste IPG-strips uit de vriezer zijn verwijderd, plaatst u ze in een plastic vat met één milliliter reducerende evenwichtsbuffer en een spoor bromofenolblauw en balanceert u ze gedurende 10 minuten met zacht schudden. Nadat de reducerende evenwichtsbuffer is verwijderd, voegt u vier milliliter excalation evenwichtsbuffer en een spoor bromofenolblauw toe aan de IPG-strips en balanceert u ze gedurende 10 minuten met zacht schudden.Tijdens gelevenwicht, demonteert u de multigietkamer en verwijdert u de voorbereide resilverende gelcassette. Spoel de gelcassette drie keer met dubbel gedistilleerd water, verwijder vervolgens overtollig water van de gelcassette met een onoplosbaar papieren handdoek en plaats deze in een gelstandaard. Spoel vervolgens de gebalanceerde IPG-strips met elektroforesebuffer en verwijder overtollig vocht op elk IPG-stripoppervlak met een onoplosbaar papieren handdoek.Plaats een IPG-strip op de resilverende SDS-PAGE-gel, zodat de plastic kant van de IPG-strip contact maakt met de langere glazen plaat met de puntige kant naar links. Voeg nu snel drie tot vier milliliter hete 1% agarose en SDS-elektroforesebuffer toe om de IPG-strip op de bovenkant van elke SDS-PAGE-gel te verzegelen en plaats de bovenkant van de IPG-strip met de bovenkant naar beneden op de bovenkant van de kortere glazen plaat, zorg ervoor dat u geen bubbels maakt. Deze stappen zijn erg belangrijk om de IPG-strip aan de SDS-PAGE-gel te verzegelen.De hete agarose-oplossingen moeten onmiddellijk worden toegevoegd en de IPG-strip moet onmiddellijk in de bovenkant van de SDS-gel worden geplaatst. Na polymerisatie, plaatst u de geassembleerde gelcassette verticaal tussen de plastic afdichtingen in een verticaal elektroforesesysteem. Plaats de bovenkant van de gel met de IPG-strip naast de kathode.Pas vervolgens het niveau van elektroforesebuffer aan om de gelcassette onder te dompelen door het juiste volume buffer toe te voegen aan het elektroforesesysteem. Verbind en stel de voeding in constante spanningsmodus in en draai gedurende ongeveer 370 minuten op 200 volt terwijl u de kleurstof monitort. Nadat de run voltooid is, haalt u de gelcassette uit het elektroforesesysteem en verwijdert u voorzichtig de gel uit de gelcassette, zorg ervoor dat u de gel niet scheurd.Breng de gel voorzichtig over naar een bak met 250 milliliter fixeeroplossing en schud de gel voorzichtig gedurende 20 minuten. Gooi vervolgens de oplossing weg en voeg 250 milliliter 50% methanol toe aan de bak. Schud vervolgens de gel voorzichtig gedurende 10 minuten.Na het schudden van de gel in dubbel gedistilleerd water, voegt u 250 milliliter sensibilisatiebuffer toe die 0,02% natriumsulfaat bevat. Schud de gel voorzichtig gedurende één minuut. Nadat de gel twee keer in dubbel gedistilleerd water is geschud, voegt u 250 milliliter zilverreactieoplossing toe en schudt u de gel gedurende 20 minuten voorzichtig.Na het schudden van de gel in dubbel gedistilleerd water, voegt u 250 milliliter ontwikkelingsoplossing toe en schudt u de gel voorzichtig totdat de gewenste kleuring is verkregen, wat doorgaans één tot drie minuten duurt

two-dimensional-gel-electrophoresis-coupled-with-mass-spectrometry

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

In this video, we demonstrate a two-dimensional gel electrophoresis method that separates individual proteins from a complex protein mixture obtained from tumor tissues of human nonfunctional pituitary adenoma (NFPA). The proteins are separated based on their electric charge in the first dimension and further separated based on molecular weights in the second dimension.

Two-Dimensional Polyacrylamide Gel Electrophoresis: A Separation Technique for Analysis of Proteins in Complex Protein Mixture Based on Charge and Molecular Weight

Source: Wulf, M., et.al. Laser Microdissection-Based Protocol for the LC-MS/MS Analysis of the Proteomic Profile of Neuromelanin Granules. J. Vis. Exp. (2021).This video demonstrates the analysis of peptide samples from neuromelanin granules (NMGs) isolated from human postmortem brain tissue. The peptides are first separated using high-performance liquid chromatography (HPLC) and then analyzed by mass spectrometry to determine their mass-to-charge ratios (m/z). Targeted peptides are fragmented...

LC-MS/MS Analysis of the Proteomic Profile of Neuromelanin Granules Isolated from Human Brain Tissue

Een gemeenschappelijke eiwitextractie protocol met behulp van ureum / thioureum / SDS buffer voor menselijke en muizen hersenweefsel maakt het identificeren van eiwitten door 2D-DIGE en de daaropvolgende karakterisering door mini 2DE immunoblotting. Deze methode maakt een meer reproduceerbare en betrouwbare resultaten te verkrijgen van menselijke biopsies en experimentele modellen.

Consensus Brain-afgeleide eiwit, Extraction Protocol voor de studie van mensen en muizen Brain Proteome behulp Zowel 2D-DIGE en Mini 2DE Immunoblotting

Hier beschrijven we een protocol dat paren twee proteomics technieken, namelijk de 2-dimensionale elektroforese (2DE) en massaspectrometrie (MS), te identificeren differentieel tot expressie / post-translationeel gemodificeerde eiwitten tussen twee of meer groepen van primaire monsters. Deze aanpak, in combinatie met functionele experimenten, maakt de identificatie en karakterisering van prognostische markers / therapeutische doelen.

Van een 2DE-Gel Spot aan Protein Functie: Lesson Learned From HS1 in Chronische Lymfatische Leukemie

Diepgaande analyses van kankercel-proteomen vergemakkelijken de identificatie van nieuwe doelen voor geneesmiddelen en diagnostische biomarkers. We beschrijven een experimentele workflow voor kwantitatieve analyse van (fosfo-)proteomen in kankercelsubpopulaties afgeleid van vloeibare en vaste tumoren. Dit wordt bereikt door cellulaire verrijkingsstrategieën te combineren met kwantitatieve Super-SILAC-gebaseerde massaspectrometrie.

Kwantitatieve Massaspectrometrische Profilering van Kanker-cel proteoom Afgeleid Van vloeibare en vaste tumoren

Hier presenteren we protocollen voor affiniteitszuivering van eiwitcomplexen en hun scheiding door blauwe natieve PAGE, gevolgd door proteïne correlatie profilering middels label vrije kwantitatieve massaspectrometrie. Deze methode is nuttig voor interactomen in verschillende proteïnecomplexen lossen.

Het oplossen van Affiniteit gezuiverde eiwit complexen door Blue inheemse PAGE en Protein Correlatie Profiling

Het protocol is bedoeld om het gebruik van een triple quadrupole mass spectrometer voor Multiple Reaction Monitoring (MRM) van eiwitten uit klinische monsters in te voeren. We hebben een systematische workflow voorzien, van monstervoorbereiding tot gegevensanalyse voor klinische monsters met alle nodige voorzorgsmaatregelen die moeten worden genomen.

Kwantitatieve Proteomics Workflow met behulp van multiple reaction monitoring gebaseerde detectie van eiwitten uit menselijk hersenweefsel

Deze methode beschrijft een eenvoudige en snelle strategie voor de karakterisering en het onderzoek van histonproteoformen.

Onthulling van histon-proteovormen met behulp van 2D-TAU gelelektroforese

Hier stellen we een op massaspectrometrie gebaseerde proteomische methode op met behulp van geïsoleerde interessegebieden in formaline-gefixeerde, in paraffine ingebedde weefselsecties. Dit protocol wordt gebruikt om proteoom te analyseren van specifieke weefselgebieden in gearchiveerde, in formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde weefselsecties.

Een gestroomlijnde aanpak voor proteomics op basis van massaspectrometrie met behulp van geselecteerde weefselregio's

Dit protocol bereidde met succes voldoende hoogwaardig neovasculair weefsel van gliomamonsters met behulp van laser-capture microdissectie voor kwantitatieve proteomics-analyse van tumorangiogenese, waarmee de beperkingen van studies die traditioneel vooral op angiogene factoren gericht zijn overwonnen en een grootschalig proteomica-profiel van glioma-angiogenese werden geleverd.

Voorbereiding van neovasculaire weefsels uit humane gliomaweefsels voor kwantitatieve proteomanalyse van tumorangiogenese

Leer tweedimensionale gelelektroforese gekoppeld aan massaspectrometrie voor proteoomanalyse van menselijk hypofyse adenoomweefsel. Deze methode identificeert eiwitten met hoge gevoeligheid.

Twee-dimensionale gelelektroforese gekoppeld aan massaspectrometrie methoden voor een analyse van menselijke hypofyse adenoom weefsel Proteoom (Video) | JoVE Journal

Twee-dimensionale gelelektroforese gekoppeld aan massaspectrometrie methoden voor een analyse van menselijke hypofyse adenoom weefsel Proteoom

Meer video's verkennen