Een efficiënte In Vitro omzetting methode door een Transcriptionally gereglementeerde Sleeping Beauty systeem verpakt in een defecte lentivirale Vector integratie
12 januari 2018
Dit protocol beschrijft een methode om stabiele integratie van een gen van belang in het menselijk genoom door het transcriptionally gereglementeerde Sleeping Beauty -systeem. Voorbereiding van de integratie van defecte lentivirale vectoren, de in vitro -transductie van menselijke cellen en de moleculaire test op getransduceerde cellen worden gemeld.
Het algemene doel van deze methode is om stabiele integratie van een gen van belang in het menselijk genoom van primaire cellen te bereiken door middel van het transcriptioneel gereguleerd Sleeping Beauty-systeem dat is verpakt in integratiefoutieve lentivirale vectoren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van gentherapie, zoals de integratie van het gen van belang in primaire cellen met behulp van het Sleeping Beauty-systeem. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat het inductible hyperactieve Sleeping Beauty-systeem efficiënt primaire cellen levert die resistent zijn tegen verschillende transfectiemethoden.
De procedure wordt gedemonstreerd door Daniela Benati, een post-doc in mijn lab. Voorafgaand aan de dag van transductie worden de humane primaire keratinocyten gekweekt zoals beschreven in het tekstprotocol. Om subconfluente keratinocyten in cultuur los te maken, verwijder het medium, was de cellen met 1X PBS en voeg een milliliter voorverwarmde trypsinewerkoplossing toe aan elke put.
Incubeer gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius in de cellencultuurincubator. Resuspendeer de cellen van een put grondig en breng de celsuspensie over in een centrifugeerbuisje met twee milliliter serumbevattend medium. Spoel de put eenmaal af met drie milliliter 1X PBS en voeg de gespoelde oplossing toe aan de centrifugeerbuis met de celsuspensie.
Centrifugeer gedurende vijf minuten bij 580 keer g en gooi het supernatant weg. Was de cellen met vijf milliliter 1X PBS, centrifugeer gedurende vijf minuten bij 580 keer g en gooi het supernatant weg. In een 15 milliliter polypropyleen buisje verdun 1,6 keer 10 tot de vijfde keratinocyten in één milliliter CFAD-medium.
Bereid voor elke conditie één verdunning voor. De drie Integratiefoutieve Lentivirale of IDLV-vectoren zijn eerder bereid zoals beschreven in het tekstprotocol. IDLVTKSB draagt de TET-gereguleerde hyperactieve SB100X transposen.
IDLVrtTA codeert voor de modulator en IDLVT2 draagt het gen van belang. GFP in dit voorbeeld geflankeerd door transposon omgekeerde herhalingen. Verdun de lentivirale vectoren in één milliliter CFAD-medium in aanwezigheid van 20 microliter polybreen zoals aangegeven in deze tabel.
Een, twee en drie zijn negatieve controles zonder vectoren. Vier en vijf bevatten IDLVTKSB en IDLVrtTA. Zes, zeven, acht en negen bevatten alle drie de lentivirale vectoren.
Transduceer cellen in suspensie door elke lentivirale vectorverdunning toe te voegen aan de corresponderende keratinocytensuspensie. Verwijder het medium van de dodelijk bestraalde 3T3-J2 feedercellen die een dag eerder zijn teruggespoeld en plateer de getransduceerde keratinocyten erop. Na het transduceren van een put, gaat u verder met de volgende.
Incubeer gedurende 30 minuten bij 25 graden. Breng vervolgens de cellen over naar 37 graden gedurende zes uur. Voeg na zes uur één milliliter CFAD-medium toe aan elke put.
Voeg één micromolar doxycycline toe aan put vijf, acht en negen. Breng de cellen terug naar 37 graden Celsius. Verwerk vervolgens de cellen in elke put zoals beschreven in het tekstprotocol.
Voor cytofluorometrische analyse moeten de op dag drie en zes gedetacheerde getransduceerde primaire keratinocyten worden onderscheiden van de 3T3-J2 feederlaag door de cellen te labelen met een muis monoklonaal APC-geconjugeerd antifeeder-antilichaam. Bereid voor elk monster vier milliliter kleurbuffer door 5%FBS, 500 millimolair EDTA en 1X PBS te combineren. Was de losgehechte cellen met één milliliter kleurbuffer.
Centrifugeer gedurende vijf minuten bij 580 keer g en gooi het supernatant weg. In een buisje voor flowcytometrie-acquisitie, resuspendeer vijf keer 10 tot de vierde cellen in 100 microliter kleurbuffer. Voeg twee microliter antifeeder-antilichaam toe in een verdunning van een op 50 en meng goed.
Incubeer gedurende 30 minuten op ijs in het donker. Na 30 minuten, was met twee milliliter kleurbuffer. Centrifugeer gedurende vijf minuten bij 580 keer g.
Gooi het supernatant weg en resuspendeer in 200 microliter kleurbuffer. Gebruik een flowcytometer geconfigureerd met een blauwe laser, een rode laser en filters voor detectie van GFP- en APC-fluorescentie om APC- en GFP-signalen te verwerven. De GFP-positieve celaandeel van de APC-negatieve celapopulatie geeft getransduceerde keratinocyten aan.
Voer realtime PCR uit door reacties in drievoudig in een 96-wellsplaat op te zetten in een uiteindelijk reactievolume van 25 microliter. Elke reactie bevat één microliter cDNA, 12,5 microliter 2X mastermix, 1,25 microliter primers in 20X probemix en 10,25 microliter steriele water. Voer realtime PCR uit volgens dit PCR-programma, één cyclus bij 95 graden Celsius gedurende 10 minuten, vervolgens 40 cycli van 95 graden Celsius gedurende 15 seconden en 60 graden Celsius gedurende één minuut en houd bij vier graden Celsius.
Analyseer ten slotte de realtime PCR-gegevens zoals beschreven in het tekstprotocol. Expressieanalyse van HeLa-cellen getransduceerd met toenemende doses transposen in modulatorvectoren plus of minuus doxycycline toonde aan dat hoge doses van beide IDLV's nodig waren om SB100X-expressie sterk te induceren. Kwantitatieve analyse van SB100X-expressie op HeLa-cellen getransduceerd met transposenvector in aanwezigheid of afwezigheid van de modulatorvector onthulde een achtvoudige activering boven de achtergrond in aanwezigheid van doxycycline.
Het transcriptioneel gereguleerd Sleeping Beauty-systeem kan ook worden gebruikt in primaire cellen. SB100X-expressie op keratinocyten getransduceerd met transposen en modulatorvectoren vertoonde een vijftienvoudige activering boven de uit-toestand. Het transpositie-experiment uitgevoerd in keratinocyten getransduceerd met de drie IDLV-vectoren plus of minuus doxycycline gaf aan dat 12%van de cellen behandeld met doxycycline stabiel ten minste één kopie van GFP in hun genoom integreerde.
Eenmaal onder de knie, kan de vitale transductie in primaire cellen in acht uur worden uitgevoerd, cytofluorometrische analyse in twee uur en express
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode om stabiele integratie van een gen van belang in het menselijk genoom te bereiken met behulp van het transcriptioneel gereguleerd Sleeping Beauty-systeem. Het proces omvat de bereiding van integratie-defecte lentivirale vectoren, in vitro transductie van menselijke cellen en moleculaire assays op de getransduceerde cellen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Gentherapie
- Celbiologie
- Moleculair biologie
Achtergrond
- Het Sleeping Beauty-systeem is een transposon-gebaseerde methode voor genoverdracht.
- Integratie van genen in het menselijk genoom is cruciaal voor stabiele expressie.
- Primaire cellen zijn vaak resistent tegen traditionele transfectiemethoden.
- Deze methode beoogt de efficiëntie van genintegratie in primaire cellen te verbeteren.
Doel van het onderzoek
- Om stabiele genintegratie in primaire menselijke cellen te bereiken.
- Om het Sleeping Beauty-systeem te gebruiken voor efficiënte genoverdracht.
- Om uitdagingen in gentherapie met betrekking tot transfectie van primaire cellen aan te pakken.
Gebruikte methoden
- Bereiding van integratie-defecte lentivirale vectoren.
- In vitro transductie van menselijke primaire keratinocyten.
- Moleculaire assays om genintegratie te beoordelen.
- Gebruik van trypsine voor celdetachment voorafgaand aan transductie.
Belangrijkste resultaten
- Demonstratie van stabiele genintegratie in primaire cellen.
- Efficiënte overdracht van genen met behulp van het Sleeping Beauty-systeem.
- Succesvolle transductie van menselijke primaire keratinocyten.
- Validatie van moleculaire assays voor het beoordelen van integratie.
Conclusies
- Het Sleeping Beauty-systeem is effectief voor genintegratie in primaire cellen.
- Deze methode biedt een betrouwbare benadering voor gentherapietoepassingen.
- Toekomstige studies kunnen voortbouwen op dit protocol om andere genen van belang te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This method addresses a critical bottleneck in gene therapy: achieving stable transgene integration in primary human cells resistant to conventional transfection. By combining a transcriptionally regulated hyperactive Sleeping Beauty transposase with integration-defective lentiviral delivery, it enables tunable, efficient genomic modification in therapeutically relevant cell types. The approach supports preclinical de-risking by providing a reproducible platform for functional validation before clinical translation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables precise interrogation of gene function through stable, inducible genomic integration in primary cells.
- Operational Value: Overcomes transfection limitations in hard-to-transduce primary cells, expanding target validation scope.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates isogenic cell populations with defined transgene copy number for consistent phenotypic screening.
- Operational Value: Provides quantitative GFP-based readout via flow cytometry to assess integration efficiency across conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports dose-dependent transgene expression tuning via doxycycline, enabling mechanistic de-risking of therapeutic constructs.
- Operational Value: Demonstrated 12% stable integration in primary keratinocytes, establishing a benchmark for preclinical efficacy assessment.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum, enabling stable cell line generation for target validation and lead optimization studies.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing by allowing controlled, long-term transgene expression in disease-relevant primary cells.
- Screening: Enables assay-ready cell populations with reproducible integration for compound screening campaigns.
- Analytics: Delivers quantifiable endpoints (GFP+ fraction, qPCR validation) to compare transduction conditions and optimize vector dosing.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical work by validating transgene performance in primary cells prior to in vivo studies.
- Enterprise Reuse: The IDLV-based delivery system can be adapted across multiple genes of interest and cell types, supporting platform scalability.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in transgene behavior through stable, inducible integration reducing epigenetic silencing risks.
- Operational Value: Standardized workflow using lentiviral transduction and doxycycline induction ensures reproducibility across labs and cell types.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions by confirming functional integration before investing in downstream development.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of gene therapy candidates based on demonstrable primary cell engineering efficiency.
Implementation Considerations
- Requires expertise in lentiviral vector production, primary cell culture, and inducible expression systems.
- Dependent on access to HEK293T packaging cells, flow cytometry, and qPCR instrumentation for validation.
- Necessitates standardization of vector dosing and doxycycline concentration across cell types to ensure consistent transposition efficiency.
- Adaptation to diverse primary cell models may require optimization of transduction conditions and selection markers.
- Practical limitation: Efficiency depends on achieving sufficient co-delivery of transposase, modulator, and transposon vectors, necessitating titer optimization.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:51
Transduction of Human Primary Keratinocytes
4:31
Cytofluorimetric Analysis of Transduced Primary Keratinocytes
6:24
Quantitative RT-PCR (qRT-PCR)
7:24
Results: Sleeping Beauty System Achieves Stable Integration of a GOI in the Human Genome
8:40
Conclusion
