Visualiseren van intracellulaire SNARE mensenhandel door fluorescentie levensduur microscopie Imaging

Het algemene doel van dit experiment is om complexvorming van SNARE-eiwitten in levende cellen te visualiseren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen op het gebied van membraantransport, zoals het identificeren van de sets van SNARE-eiwitten die de specifieke organellatransportstappen katalyseren. Het grote voordeel van deze techniek is dat het een directe visualisatie mogelijk maakt van de cellocaties waar SNAREs zich bezighouden met complexvorming.

In dit experiment worden 900.000 HeLa-cellen verdeeld over drie Eppendorfbuisjes gebruikt voor transfectie. Transfecteer de cellen zoals beschreven in het tekstprotocol met de volgende constructen. Voorbeeldnummer één met de syntaxinin-4 mCitrine constructie, voorbeeldnummer twee met de syntaxinin-4 mCitrine en VAMP3-mCherry, en voorbeeldnummer drie met syntaxinin-3 gefuseerd met zowel mCitrine als mCherry.

Kweek de getransfecteerde cellen in hoog-glucose DMEM voorzien van 10%FCS en 1%antibioticum antimycotisch bij 37 graden Celsius met 5%CO2 in een celkweekincubator overnacht. Op de volgende dag, aspireer het medium en was de cellen eenmaal gedurende twee minuten met levend celbeeldvormingsmedium. Plaats daarna de cellen in vers beeldvormingsmedium.

Om deze procedure te beginnen, plaats voorbeeldnummer twee op 37 graden Celsius, op een verwarmde stage, onder een time domain fluorescentie levensduur beeldvorming confocale microscoop met een gepulseerde excitatiebron voor de donorfluorofoor en tijdsgebonden data-acquisitie. Selecteer voorafgaand aan elke fluorescentie levensduur beeldvorming microscopie of FLIM meting een cel met zichtbare expressie van de mCitrine en mCherry gelabelde SNARE-eiwitten en neem een confocale afbeelding op van 256 bij 256 pixels met gelijktijdige excitatie van beide fluoroforen. Neem een FLIM-afbeelding op door op FLIM run te klikken, waarbij de FLIM-afbeelding wordt opgenomen met dezelfde afmetingen en ruimtelijke resolutie als de eerder opgenomen confocale afbeelding.

Neem de afbeelding op met minimaal 50.000 fotonen voor gehele cel FLIM-analyse of minimaal 400 fotonen per pixel. Het is belangrijk om de FLIM-metingen op minstens één micrometer van het glasoppervlak op te nemen om reflecties te vermijden. Herhaal de beeldvorming van meerdere cellen in voorbeeldnummer twee en voor cellen in voorbeeldnummer één en voorbeeldnummer drie.

Plaats vervolgens een schone glazen deksel op de microscoopstage voor het opnemen van een instrumentresponsfunctie of IRF. Stem de monochromator van de emissiedetector af op de excitatiegolflengte en klik op de knop FLIM run om een FLIM-afbeelding op te nemen met de terugverstrooiing van de glazen deksel. De foto-opnamen worden geconverteerd naar FLIM-afbeeldingen met de PT32ICS conversiesoftware.

Configureer de software. Stel de uitvoer in op ImageJ voor het genereren van FLIM-afbeeldingen. Stel de afbeeldingsgrootte in op 256 bij 256 pixels en het kanaal op twee.

Druk op converteren en laad een of meer foton-sporen. Houd de controle-toets ingedrukt om meerdere foton-sporen te selecteren. FLIM-afbeeldingen moeten worden gegenereerd in dezelfde map waar de foton-sporen zijn opgeslagen.

Begin met het openen van de gegevensanalysesoftware die geschikt is voor fitting met deconvolutie. Importeer het tekstbestand dat de histogrammen bevat voor elke foton-spoor. Herschik de tabel zodat de IRF in de tweede kolom van de tabel staat, naast de tijdswaarden in kolom A. Bepaal de kwaliteit van de opgenomen foton-sporen door alle kolommen te selecteren.

Analyseer geen foton-sporen met een hoge reflectiepiek. Een voorbeeld wordt hier getoond. Gebruik de controle-toets om alle kolommen te selecteren die de kwaliteitsgecontroleerde levensduur histogrammen bevatten die zullen worden gepast, evenals de IRF in kolom B, en laad de niet-lineaire fitting.

Laad de gedeconvolveerde fitfunctie in door deze functie toe te voegen aan de analysesoftware. Selecteer het fitfunctiebestand. Deze functie past de fluorescentie levensduur histogrammen met een mono exponentiële vervalfunctie aan die gedeconvolveerd is met de IRF.

Voer X-as schaling uit van de aangepaste curven. Pas de curven aan door op fit te drukken. Dit zal de fit omzetten en een rapportblad genereren in de array met de tabel die de fluorescentie levensduur offsets en amplitudes bevat.

Het zal ook een gegevensblad genereren met de aangepaste curven en de residuen van de fit. Getoonde zijn representatieve confocale afbeeldingen van helocellen die alleen syntaxin vier mCitrine expresseren, syntaxin vier mCitrine met VAMP3 mCherry, of de syntaxin drie mCitrine mCherry tandemconstructie. In deze bijbehorende fluorescentie levensduurbeelden geeft de kleur de gemiddelde schijnbare fluorescentie levensduur aan.

De afbeeldingen werden vervolgens geconvoleerd met de fluorescentie intensiteiten van de mCitrine donor fluorofoor. Volgende zijn dezelfde afbeeldingen met fitting met bi-exponentiële vervalfuncties. De pixelkleuren geven de geschatte fractionen van syntaxin vier in complex met VAMP3 aan.

De instrumentresponsfunctie van de setup werd gemeten met behulp van de terugverstrooiing op de glaswaterinterface. Hele cel levensduur histogrammen worden getoond voor cellen die alleen syntaxin vier mCitrine expresseren, co-expresserend syntaxin vier mCitrine met VAMP3 mCherry, en die de syntaxin drie mCitrine mCherry tandemconstructie expresseren. Panel E toont een overlay van de vervalcurven van panelen B, C en D. De inlays tonen dezelfde grafieken, maar met logaritmische schaling van de Y-as.

Een fluorescentie levensduur histogram opgenomen te dicht bij het oppervlak van de microscoopdeksel resulteerde in een grote reflectiepiek, weergegeven door het geelgekleurde gebied. Ten slotte wordt een levensduur histogram met representatieve fit met bi-exponentiële vervalfunctie getoond. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in twee tot vier uur worden uitgevoerd als deze goed wordt uitgevoerd.

Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden om meerdere cellen op te nemen, omdat de expressieniveaus van de donor en de interceptor SNARES de levensduur kunnen beïnvloeden. Na deze procedure kunnen de cellen worden geactiveerd om type specifieke