Isolatie, cultuur en differentiatie van beenmerg stromale cellen en Osteoclast voorlopercellen van muizen

Het algemene doel van deze procedure is om beenmergstroomacellen, of BMSC's, te isoleren en te kweken. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van botten en adipocyten over voorlopercellen. Het grote voordeel van deze techniek is dat BMSC's op een relatief snelle, herhaalbare en goedkope manier kunnen worden geïsoleerd.

Een visuele demonstratie van deze methode is nuttig, omdat de dissectiestappen moeilijk uit te leggen zijn met alleen tekst. Voordat u begint met de botoogstprocedure, voegt u 100 microliter beenmergstroomcelcultuurmedium toe in één microcentrifugebuis van 1,5 milliliter voor elke drie te oogsten botten. En snijdt u het uiteinde van één 200 microliter pipettentip per microcentrifugebuis af, zodat elke tip in een enkele buis past met de deksels gesloten.

Plaats vervolgens de eerste 78-week-oude geëuthaniseerde muis in de rugligging op een dissectiebord en besproeit het dier met 70%ethanol. Gebruik een pincet om een tent van huid op de buik te maken en gebruik steriele dissectiescharen om een huidsnede van ongeveer een centimeter te maken. Trek de huid terug om de onderbuik en benen bloot te leggen.

Snijd langs de iliacale crest van elke heup om de femurhoofden van het bekken te scheiden, en maak een snede door het midden van het bekken om de iliacale botten te scheiden, en snijd onder de enkelgewrichten om de voeten te verwijderen. Scheid vervolgens het scheenbeen van het dijbeen door op het kniegewricht te snijden. Gebruik vervolgens pluisvrije doekjes om voorzichtig het spierweefsel van de femurs, scheenbeenderen en iliacale botten te verwijderen.

Wanneer alle botten zijn verzameld, plaatst u de monsters in PBS op ijs en brengt u de monsters over naar een steriele kweekkap. Maak met behulp van een steriele techniek een snede van één tot twee millimeter aan zowel de proximale als distale uiteinden van elk bot voordat u drie botten in elke gemodificeerde micropipettip in de microcentrifugebuizen plaatst. Oogst het beenmerg uit de botten door centrifugatie, waarbij u controleert of het merg volledig is gepelleteerd tot de bodem van elke microcentrifugebuis aan het einde van de centrifugatie.

Als al het merg is verzameld, zien de botten er wit uit. Verwijder de micropipettips en de botten uit de opvangbuizen voor de juiste bioveiligheidsverwijdering. Om de beenmergcellen te beplateren, gebruikt u eerst een spuit van één milliliter uitgerust met een naald van 25 gauge om de pellets langzaam op te schorsen en eventuele klonters te breken, en verzamelt u de monsters in één conische buis van 15 milliliter.

Voeg 10 milliliter beenmergstroomcelcultuurmedium toe per 500 microliter monster en filter de celsuspensie door een filter van 70 micron in een conische buis van 50 milliliter om eventuele botfragmenten te verwijderen. Na het tellen, zaait u de beenmergcellen met een dichtheid van een keer 10 tot de zesde cellen per vierkante centimeter in vers kweekmedium voor een incubatie van 72 uur bij 37 graden Celsius en 5%CO2. Op dag drie vervangt u het supernatant door vers medium, waarbij het medium om de twee dagen wordt vervangen totdat de cellen 80% tot 100% confluency bereiken.

Om een gesplitste beenmergcellen populatiecultuur te beplateren, beplatelt u de geoogste beenmergcellen van één muis in een celkweekschaal van 10 centimeter gedurende 48 uur in vers kweekmedium in een celkweekincubator. Op dag twee van de kweek, verwijdert u het niet-aderente supernatant dat hematopoëtische stamcellen bevat, en wast u de plaat voorzichtig met PBS, zonder de adherente beenmergcellen te verstoren. Vervang het PBS door 0,25% trypsine.

Na een tot drie minuten bij 37 graden Celsius, blust u de reactie met vers celkweekmedium en telt u de cellen in de resulterende celsuspensie. Centrifugeert u het juiste aantal cellen voor beplatering en suspendeert u het pellet opnieuw in voldoende vers kweekmedium voor de gewenste beplateringsdichtheid. Plaats vervolgens de platen in de celkweekincubator tot confluency.

Om differentiatie van beenmergstroomcel osteoblasten te induceren, vervangt u het celkweekmedium om de twee dagen door differentiatiemedium, totdat de cellen beginnen witte noduli van mineralisatie te produceren die macroscopisch kunnen worden waargenomen. Om differentiatie van beenmergstroomcel adipocyten te induceren, vervangt u het celkweekmedium van een confluente beenmergcellen kweek door adipocyteninductiemedium. Na twee dagen kweek, vervangt u het supernatant door vers adipocyteninductiemedium, en schakelt u op dag vier over op adipocytenbasismedium.

Op dag zeven bevestigt u dat de cellen lipidedruppels hebben opgehoopt en een fenotype vertonen dat vergelijkbaar is met dat van volwassen adipocyten. Om de hematopoëtische stamcellen te differentiëren in osteoclasten, wanneer een totale beenmergcellen kweek of niet-aderente celkweek adhereerd, vervangt u het celkweekmedium door osteoclastdifferentiatiemedium. Vervang het medium om de twee dagen en controleer dagelijks op osteoclastdifferentiatie onder een lichtmicroscoop bij 10x vergroting totdat de osteoclasten fuseren en meerkernige cellen vormen, meestal rond dag vijf tot zeven van differentiatie.

Confluente culturen van BMSC's kunnen worden gedifferentieerd in osteoblasten met behulp van een osteogeen medium dat bestaat uit ascorbinezuur en bèta-glycerofosfaat. Na een paar dagen differentiatie beginnen de osteoblasten alkalische fosfatase te gaan uitdrukken. Verdere differentiatie zal de productie van osteoïde matrix en uiteindelijk de mineralisatie van deze matrix uitlokken.

Interessant is dat slechts een deel van de cellen zich in vitro tot osteoblasten zal differentiëren, zoals blijkt uit kristalvioletkleuring. Of gemengde populaties of gesplitste beenmergcellen populaties worden gebruikt, slechts een deel van de cellen zal zich differentiëren tot adipocyten, die zichtbaar zijn als ronde cellen met meerdere lipidvacuolen die kunnen worden gekleurd met olierode O kleurstof. Menselijke stamcelculturen aangevuld met muis celstimulerende factor en RANKL zullen snel fuseren om meerkernige cellen te vormen die positief kleuren voor TRAP.

Deze osteoclasten zijn in staat om in vitro mineraalmatrix te resorberen en kunnen worden gebruikt om osteoclastische