Name: Isolatie, cultuur en differentiatie van beenmerg stromale cellen en Osteoclast voorlopercellen van muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Leer de isolatie en cultuur van beenmerg stromale cellen en osteoclast voorlopercellen van muizen. Deze methode levert populaties geschikt voor differentiatie naar osteoblasten en adipocyten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd gesteund door de National Institutes of Health (R01 AR061164-01A1).

Alle experimentele procedures werden goedgekeurd door het institutionele Animal Care en gebruik Comité bij de Maine Medical Center Research Institute.
1. verzameling buizen voorbereiding
<ol><li>Maken de BMSC cultuurmedia door Minimum essentiële Medium α (MEM α) aan te vullen met 10% foetale runderserum en 1% van penicilline/streptomycine.</li>
	<li>Plaats 100 µL van de voedingsbodems BMSC in 1,5 mL microcentrifuge buizen. 3 beenderen past meestal in een enkele buis dus bereiden dienovereenkomstig.</li>
	<li>Snij de uiteinden van 200 µL Pipetteer tips genoeg zodat ze in de centrifuge buizen passen. Invoegen van de tips binnen de buizen en ervoor te zorgen dat de deksels sluiten kunnen alvorens de buizen te plaatsen op het ijs. Opmerking: Als alternatief, 0,75 mL microcentrifuge buizen met de uiteinden cut kunnen worden ingevoegd in de 1,5 mL microcentrifuge buis.</li>
</ol>2. de oogst van botten van muizen
<ol><li>Euthanaseren van de dieren met behulp van CO2 , gevolgd door cervicale dislocatie en spuiten ze met 70% ethanol. Opmerking: Zorg ervoor dat de dieren van hetzelfde geslacht en bij voorkeur dezelfde leeftijd worden gebruikt. Regelmatig gebruiken we dieren die ouder zijn 7 tot 8 weken. Het is raadzaam om bundeling van cellen van ten minste 3 dieren per experimentele groepen een betere vertegenwoordiger en reproduceerbare celpopulatie opleveren.</li>
	<li>
Plaats de euthanized muis op zijn rug op een ontleden bord. Pincet gebruiken voor het maken van een tent van huid op de buik. Maken een kleine snede (ongeveer 1 cm) met behulp van steriele ontleden schaar. Schil terug de huid naar de ledematen en de voeten van de snede om de onderbuik en de benen bloot.
	<ol>
<li>Snijden onder de enkel gezamenlijk te verwijderen van de voet. U snijdt langs de iliacale kuif op de heup te scheiden van de dijbeen-hoofd van de heupen. Terwijl de muis nog steeds op zijn rug is, maak een snede in het midden van de heupen te scheiden van de twee iliac botten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Met behulp van pluisvrije doekjes, verwijder voorzichtig de spier van het dijbeen, zijn verbeend en iliacale botten. Opmerking: Snijden zo veel van de pezen en spieren van het been als mogelijk maakt het reinigen sneller en makkelijker met de pluisvrije doekjes (bijvoorbeeld, kimwipes). Wees voorzichtig bij het bewerken van de botten, omdat ze de neiging om gemakkelijk te breken en hun kwetsbaarheid kan worden verhoogd met bepaalde genotypes.</li>
	<li>Zodra alle monsters hebben zijn ontleed, plaats ze in PBS op ijs en verplaatsen naar een steriele cultuur kap voor de resterende stappen van isolatie. Opmerking: Werken aseptisch zoveel mogelijk zal verminderen de kans op besmetting in de culturen.</li>
	<li>Maken kleine bezuinigingen (ongeveer 1 tot 2 mm) aan beide de proximale en distale uiteinden van de botten alvorens hen te plaatsen in de verdeelde tips binnen de centrifuge buizen. Opmerking: Zorg ervoor om een voldoende hoeveelheid zodat beenmerg kan worden gecentrifugeerd echter, moet worden gezorgd om te voorkomen dat snijden teveel als cel populaties de neiging te variëren op basis van nabijheid binnen de ruimte van het beenmerg.</li>
	<li>Centrifugeer bij 10.000 x g gedurende 15 s bij kamertemperatuur. Ervoor zorgen dat alle beenmerg is gespoeld en Ingehuld aan de onderkant van de buis 1,5 mL terwijl de beenderen binnen de inserts (ofwel 200 µL Pipetteer tip of 0,75 mL microcentrifuge buis zijn). Zodra alle beenmerg wordt verzameld, verwijdert u de inzetstukken met de botten uit de collectie buizen. Opmerking: Als alle beenmerg wordt geleegd, de botten zal verschijnen witte. Echter als beenmerg in bepaalde botten blijft, probeer het snijden uiteinden opnieuw en centrifugeren.</li>
</ol>3. de celsuspensie
<ol><li>Met behulp van een 25 G naald, trek pellets de cel op en neer langzaam te breken klontjes en alle monsters te combineren in een conische buis van één 15 mL. Voeg 10 mL van de Media van de cultuur van het BMSC per 500 µL van monsters.</li>
	<li>Een 70 µm filter plaatsen op de top van een conische tube van 50 mL en de celsuspensie passeren in dit filter te verwijderen mogelijk botfragmenten.</li>
</ol>4. plating en cultuur van gemengde bevolkingsgroepen van beenmergcellen (totale BMCs)
Opmerking: De cellen worden gekweekt bij 37 ° C in een broedstoof met 5% CO2.
<ol><li>Bereken het aantal cellen en hen op 1.0 x 106 cellen/cm2 in kweekmedia plaat. Het toestaan van 72 h van gemengde cultuur voor cellen te koppelen. Opmerking: We raden verdunning van de cel schorsing 20 x in cultuurmedia en verdunnen opnieuw in trypan blauwe vóór het tellen van de cellen met behulp van een hemocytometer. Voor 7-week-oude mannelijke C57Bl6/J muizen, we opleveren routinematig een aantal cellen van ongeveer 50 x 106 cellen maar leeftijd, geslacht en soort celaantal sterk kunnen beïnvloeden. Opmerking: De bevolking van een mix van cellen moet koppelen aan de onderkant van de cultuur.</li>
	<li>Na 72 uur, verwijderen van de media en nieuwe media te vervangen. Gaan met het wijzigen van de media elke andere dag en controleren op confluentie. Wanneer de cellen 80-100% confluentie bereikt, zijn ze klaar voor differentiatie. Opmerking: Omdat deze cultuur wordt vermengd met zowel BMSCs als HSCs, het kan direct gebruikt worden voor osteoblastogenesis, adipogenesis, evenals osteoclastogenesis.</li>
</ol>5. plating en cultuur van de bevolking van de Split van BMSCs (aanhangend BMSCs)
Opmerking: De cellen worden gekweekt bij 37 ° C in een broedstoof met 5% CO2.
<ol><li>Plaat alle cellen verzameld uit het dijbeen, zijn verbeend en iliacale botten van een muis in een 10 cm cultuur schotel (55 cm,2 van cultuur gebied). Opmerking: Wanneer de bundeling van 2-3 C57BL/6J muizen, plaat we meestal deze 'totaal' beenmerg bevolking in een maatkolf van 150 cm2 .</li>
	<li>Na 48u van gemengde cultuur, de media van de cultuur (met de niet-aanhanger HSCs) te verwijderen. Als osteoclastogenesis experimenten worden uitgevoerd moeten, stelt u deze bevolking van cellen van de niet-aanhanger opzij (zie punt 7), zoniet, aspirate en negeren van deze cellen.</li>
	<li>Wassen van de plaat/kolf met PBS zorgvuldig over de gekoppelde cellen niet te storen.</li>
	<li>PBS verwijderen en de cellen op te heffen door toevoeging van 0,25% trypsine en incuberen bij 37 ° C gedurende 1-3 min. Quench de trypsine door cel media toe te voegen aan de celsuspensie. Op dit punt, BMSCs, die nu worden opgeheven, kunnen worden gerekend (eerder gedaan in stap 4.1) en vergulde voor toekomstige experimenten.</li>
	<li>Bereken het aantal cellen die nodig zijn voor de beplating. Centrifugeer het vereiste volume van celsuspensie bij 1.000 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Opmerking: Cellen zijn meestal verzinkt gebaseerd op eindpunt experimenten. Bijvoorbeeld, als eiwit/RNA te isoleren plaat wij meestal op een hogere dichtheid (~1.0-2.0 x 106 cellen per putje in 6-well plaat).</li>
	<li>Verwijder het medium en resuspendeer de pellet cel in het volume van de voedingsbodems die nodig zijn voor de beplating. Plaat van de cellen in kweekmedia volgens de experimenten en laten hechten voor een paar dagen. Wanneer de BMSCs confluentie bereikt, gaat u verder met het uitvoeren van differentiatie.</li>
</ol>6. differentiatie van BMSCs
<ol><li>
Botcellen
	<ol>
<li>Osteoblast differentiatie media door toevoeging van 800 µL 1 M β-glycerol fosfaat in aanbrengt PBS en 200 µL van 0.5 M ascorbinezuur in PBS 99 mL BMSC voedingsbodems (zie stap 1.1 voor de samenstelling van de BMSC-cultuur-media).<ol>
<li>Zodra BMSCs culturen (totale BMCs uit stap 4.3) of aanhanger BMSCs uit stap 5.6 confluente, ze verschillen in botcellen door over te schakelen van de voedingsbodems osteoblast differentiatie media.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Vervang de differentiatie media om de andere dag. Cellen beginnen met de productie van witte knobbeltjes van mineralisatie. Ze visualiseren met het blote oog op de bodem van de put; Dit proces kan optreden binnen een paar dagen tot 3 weken.<ol>
<li>Uitvoeren om te beoordelen osteoblastogenesis, alkalische fosfatase kleuring en/of Von Kossa kleuring op de putten zoals beschreven in sectie 8. Opmerking: Wijzig de media zorgvuldig door het kantelen van de platen lichtjes schuin teneinde verstoring van de cel enkelgelaagde.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Adipocytes
	<ol>
<li>Adipocyte base media maken door het te mengen samen 90 mL Dulbecco bewerkt Eagle Medium (DMEM) hoge Glucose, 10 mL foetale runderserum, 1 mL penicilline/streptomycine, 100 µL 20 mM Rosiglitazon en 100 µL van 2 mM insuline. Indien nodig slaan deze media bij 4 ° C voor de week tijdens het experiment van de differentiatie.</li>
		<li>Adipocyte inductie media maken door toevoeging van 200 µL van 62,5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) en 25 µL van 1 mM dexamethason aan 25 mL Adipocyte Base Media.</li>
		<li>Zodra BMSCs culturen (totale BMCs uit stap 4.3) of aanhanger BMSCs uit stap 5.6 confluente, omzetten in de media adipocyte inductie media. Beschouw deze dag 0 van differentiatie.</li>
		<li>Na 48u, verwijder het medium en vernieuwen van de cultuur met adipocyte inductie media.</li>
		<li>Op dag 4, overschakelen naar adipocyte base media. Opmerking: Lipide druppels kunnen beginnen zo vroeg als dag 2 en dag 4 te verschijnen.</li>
		<li>Op dag 7, observeren dat cellen maximale lipide druppels hebben opgebouwd en een fenotype vergelijkbaar met een volwassen adipocyte weer te geven. Cultuur niet voorbij dit punt, omdat het leiden cel dood/detachement tot kan.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. differentiatie van HSCs in de osteoclasten
<ol><li>Osteoclast differentiatie Media maken door toevoeging van 50 µL van 25 µg/mL van Receptor Activator van NFKB Ligand (RANKL) en 15 µL van 25 µg/mL macrofaag kolonie stimulerende Factor (mCSF) tot 25 mL van de Media van de cultuur van het BMSC.</li>
	<li>Zodra de totale BMCs (uit stap 4.3) of de niet-aanhanger cellen (uit stap 5.2) zijn aangesloten op de put, cultuurmedia omschakelbaar Osteoclast differentiatie Media. Aanvullen differentiatie media om de andere dag.</li>
	<li>Observeer de osteoclast culturen dagelijks onder een microscoop op 10 X vergroting. Vaststellen dat de osteoclasten zekering en vormen van multinucleaire cellen, meestal rond dag 5-7 van differentiatie.</li>
</ol>8. vlekken
<ol><li>
Botcellen Opmerking: Voor gebruik door de alkalische fosfatase (AP) kleuring, we vaak een AP kleuring kit (Zie Tabel van materialen) volgens de richtlijnen.<ol>
<li>AP kleuring door de richtlijnen van de fabrikant van de kit uitvoeren<ol>
<li>Gecombineerd media en spoel cellen met PBS. Herstellen van de cellen met de 4% Paraformaldehyde (PFA) in PBS gedurende 12 minuten bij kamertemperatuur.</li>
			<li>In de tussentijd, maken de oplossing van de AP met behulp van de reagentia van de AP kleuring kit door toevoeging van 500 µL natriumnitriet 500 µL FRV-Alkaline oplossing en mengen zachtjes; laat staan voor 2 min. toevoegen 22,5 mL dH2O en 500 µL naftol AS-BI Alkaline. Meng voorzichtig. Let op: PFA is giftig en moet met zorg worden behandeld.</li>
			<li>Zodra de cellen worden opgelost, spoelen met PBS en AP-oplossing toevoegen aan elk putje (1 tot 2 mL per putje). Dek af met aluminiumfolie en laat vlek gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur beschermd tegen licht. De oplossing gecombineerd, wassen met gedestilleerd water en laat de plaat om te drogen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Beelden van gebeitst kolonies met behulp van een camera om observeren van alkalische fosfatase positieve cellen verwerven.</li>
		<li>U kunt ook uitvoeren Von Kossa in plaats van alkalische fosfatase kleuring. Hiervoor was putjes grondig met gedestilleerd water als eventuele resterende PBS met zilvernitraat. neerslaat
		<ol>
<li>Herstellen van de cellen met de 4% PFA in PBS gedurende 12 minuten bij kamertemperatuur. Vervolgens voegt u genoeg 5% zilvernitraat, oplossing om te dekken van de put en blootstellen aan fel licht gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Verwijder de zilvernitraatoplossing en elk putje met gedestilleerd water spoelen. 5% natrium thiosulfate oplossing aan de cellen toevoegen en laat het staan voor 3 min.</li>
		<li>De natrium-thiosulfate gecombineerd en wassen met gedestilleerd water. Laat de plaat droog en observeren van de minerale storting gekleurd in de donker bruin/zwart met blote oog.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Adipocytes
	<ol>
<li>Voor olie Red O (ORO) kleuring, vast de cellen met behulp van 10% neutraal gebufferd formaline gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.</li>
		<li>In de tussentijd, maken de ORO Stock oplossing door ontbinding 0,035 g in 10 mL isopropanol. Dit is voldoende voor een 6-well-plate. Meng en laat de oplossing met behulp van een filtreerpapier (porie maat 11 µm).</li>
		<li>Maak de ORO werken oplossing door 9 mL van de stockoplossing ORO met 6 mL gedestilleerd water verdunnen. Laat de oplossing op een rocker tot klaar voor gebruik.</li>
		<li>Bereiden van 60% isopropanol in gedistilleerd water (maken genoeg om te behandelen elk goed).</li>
		<li>Zodra de cellen worden opgelost, verwijdert u de kleefpoeders en wassen eenmaal met gedestilleerd water. Vervang het water door de 60% isopropanol oplossing voor 1 min. Opmerking: Voeg vloeistof langzaam terwijl het kantelen van de plaat; adipocytes verjagen zeer gemakkelijk.</li>
		<li>Verwijder van het isopropanol en voeg voldoende ORO werken oplossing ter dekking van alle cellen. Incubeer gedurende 15 minuten op een lage snelheid rocker bij kamertemperatuur. Verwijderen van ORO en spoel tweemaal met gedestilleerd water. Opmerking: op dit punt, ORO gebeitste lipide druppels kunnen worden gevisualiseerd onder de Microscoop.</li>
		<li>Om te kwantificeren ORO, destain de ORO door toevoeging van 1 mL 100% isopropanol en aan elk putje en schommelen langzaam gedurende 10 minuten.</li>
		<li>In de tussentijd bereidt een verdunningsreeks aan het maken van een standaard curve op basis van de volgende 8 normen met behulp van ORO werken oplossing (2.100 µg/mL) en isopropanol als een oplosmiddel: 500, 350, 300, 250, 150, 100, 75 en 0 µg Mo/mL.</li>
		<li>Laden van 200 µL van de normen en de destained monsters in triplicates op een bord en lees de absorptie bij 490 nm.<ol>
<li>Bepaal de concentratie van ORO voor elk monster gebaseerd op de standaard curve. Opmerking: Wij raden de concentratie ORO aan celaantal normaliseren. Aantal cellen kan worden gekwantificeerd door kristalviolet kleuring of de hoeveelheid van DNA.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Osteoclasten Opmerking: Als u klaar bent, wij stellen voor osteoclasten kleuring voor tartraat-resistente zuur fosfatase (TRAP) met behulp van de TRAP kleuring kit (Zie Tabel van materialen).<ol>
<li>Voor OVERVULLING kleuring, herstellen van cellen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur met 2,5% Glutaaraldehyde in PBS. In de tussentijd, maken de TRAP-oplossing door het mengen samen 50 µL van snel granaten Base oplossing, 50 µL van natriumnitriet, 4.55 mL gedestilleerd water, 50 µL van Napthol AS-Biphosphate, 200 µL van acetaat oplossing en 100 µL tartraatoplossing.</li>
		<li>Gecombineerd uit fixeer, en spoel de cellen met PBS tweemaal alvorens toe te voegen TRAP oplossing gedurende 1 uur bij 37 ° C.</li>
		<li>Wassen met gedestilleerd water voor het tellen van de osteoclasten onder een microscoop (vergroting 10 X). De TRAP+ cellen verschijnen paars met 3 of meer kernen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Friedenstein, A. J., Latzinik, N. W., Grosheva, A. G., Gorskaya, U. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marrow+microenvironment+transfer+by+heterotopic+transplantation+of+freshly+isolated+and+cultured+cells+in+porous+sponges%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Marrow microenvironment transfer by heterotopic transplantation of freshly isolated and cultured cells in porous sponges.</a> Exp Hematol. 10 (2), 217-227 (1982).</li>
<li>Chen, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+growth+and+differentiation+of+osteoprogenitors+in+mouse+bone+marrow+stromal+cell+cultures+by+increased+donor+age+and+glucocorticoid+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Inhibition of growth and differentiation of osteoprogenitors in mouse bone marrow stromal cell cultures by increased donor age and glucocorticoid treatment.</a> Bone. 35 (1), 83-95 (2004).</li>
<li>Kokabu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP3+suppresses+osteoblast+differentiation+of+bone+marrow+stromal+cells+via+interaction+with+Acvr2b%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">BMP3 suppresses osteoblast differentiation of bone marrow stromal cells via interaction with Acvr2b.</a> Mol Endocrinol. 26 (1), 87-94 (2012).</li>
<li>Ghali, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dexamethasone+in+osteogenic+medium+strongly+induces+adipocyte+differentiation+of+mouse+bone+marrow+stromal+cells+and+increases+osteoblast+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dexamethasone in osteogenic medium strongly induces adipocyte differentiation of mouse bone marrow stromal cells and increases osteoblast differentiation.</a> BMC Cell Biol. 16, 9(2015).</li>
<li>Kretlow, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+age+and+cell+passage+affects+differentiation+potential+of+murine+bone+marrow-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Donor age and cell passage affects differentiation potential of murine bone marrow-derived stem cells.</a> BMC Cell Biol. 9, 60(2008).</li>
<li>DeMambro, V. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Igfbp2+Deletion+in+Ovariectomized+Mice+Enhances+Energy+Expenditure+but+Accelerates+Bone+Loss%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Igfbp2 Deletion in Ovariectomized Mice Enhances Energy Expenditure but Accelerates Bone Loss.</a> Endocrinology. 156 (11), 4129-4140 (2015).</li>
<li>Maridas, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IGFBP-4+regulates+adult+skeletal+growth+in+a+sex-specific+manner%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">IGFBP-4 regulates adult skeletal growth in a sex-specific manner.</a> J Endocrinol. 233 (1), 131-144 (2017).</li>
<li>Nadri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+method+for+isolation+of+murine+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">An efficient method for isolation of murine bone marrow mesenchymal stem cells.</a> Int J Dev Biol. 51 (8), 723-729 (2007).</li>
<li>Sreejit, P., Dilip, K. B., Verma, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+mesenchymal+stem+cell+lines+from+murine+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Generation of mesenchymal stem cell lines from murine bone marrow.</a> Cell Tissue Res. 350 (1), 55-68 (2012).</li>
<li>Abdallah, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD34+defines+an+osteoprogenitor+cell+population+in+mouse+bone+marrow+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">CD34 defines an osteoprogenitor cell population in mouse bone marrow stromal cells.</a> Stem Cell Res. 15 (3), 449-458 (2015).</li>
<li>Akiyama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+bone+marrow+derived+mesenchymal+stem+cells+in+suspension%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Characterization of bone marrow derived mesenchymal stem cells in suspension.</a> Stem Cell Res Ther. 3 (5), 40(2012).</li>
<li>Lin, C. S., Ning, H., Lin, G., Lue, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+CD34+truly+a+negative+marker+for+mesenchymal+stromal+cells%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Is CD34 truly a negative marker for mesenchymal stromal cells?</a> Cytotherapy. 14 (10), 1159-1163 (2012).</li>
</ol>

De auteurs vermelden dat zij geen financiële belangenverstrengeling hebben.

In dit artikel worden twee methoden van cultuur van de BMSCs gepresenteerd met hun voordelen en beperkingen. Isoleren van cellen uit het beenmerg is een relatief eenvoudig proces. Verkrijgen van een vertegenwoordiger van de mesenchymale stamcellen of osteoclastic progenitoren celpopulatie kan echter uitdagende als gevolg van de verschillende cellulaire omgeving van de holte van het beenmerg.
Kweken van het geheel van de inhoud van het beenmerg biedt een nauwe weergave van de communicatie i...

Primaire lymfkliertest BMSCs worden vaak gebruikt als een in vitro model van mesenchymale stamcellen sinds hun ontdekking in de vroege jaren 19801. Inderdaad, culturen van kunststof-aanhanger cellen uit het beenmerg holte van lange beenderen gespoeld handhaven de capaciteit te differentiëren in botcellen, osteoclasten, chondrocyten of adipocytes in vele studies2,3, 4 , 5. het beenmerg is echter een unieke weefsel bestaat uit veel verschillende cel populaties, inclusief, maar niet beperkt tot, BMSCs, HSCs, endotheel en immuun cellen. Dus, isolatie en cultuur technieken kunnen opleveren cel populaties met verschillende homogeniteit. Met behulp van deze technieken voor het testen van de mogelijke differentiatie van cellen kan worden uitdagende. Bijvoorbeeld, bij het vergelijken van cellen uit muizen met verschillende genotypen, beginnend met een gemengde celpopulatie beperkt de interpretatie van de gegevens. Omgekeerd, verkrijgen van homogene bevolking van BMSCs en HSCs kan technisch moeilijk en mogelijk niet als vertegenwoordiger van een ex vivo -model.
In ons laboratorium zijn we voornamelijk geïnteresseerd in het gebruik van BMSCs als gevolg van hun potentieel te differentiëren in botcellen, osteoclasten en adipocytes. Hier presenteren we technieken van BMSCs en HSCs isolement en cultuur gebruikt om te beoordelen osteoblastogenesis of adipogenesis in vitro, evenals de culturen van HSCs te onderscheiden in de osteoclasten. Één methode gebruikt een gemengde bevolking van beenmergcellen (BMCs) met BMSCs en HSCs direct geschikt voor adipogenesis, osteoblastogenesis, en osteoclastogenesis (totale BMCs genoemd). Deze methode is een nauwere ex vivo representatie van de heterogeniteit gevonden onder de cellen van het beenmerg-communicatie. Een andere methode scheidt aanhanger uit niet-aanhanger cellen in een poging aan cultuur "zuiverder" bevolking van BMSCs en HSCs (aanhanger BMSCs genoemd). De latere methode kan de celcultuur experimenten om te starten met een meer nauwkeurige aantal BMSCs of HSCs en vermindert het potentieel van complexe indirecte effecten van andere cel populaties die in de cultuur blijven. Beide methoden zijn eerder gepubliceerd en gebruikt om verschillende onderzoek vragen6,7,8,9.

<table><tbody><tr><td>200&mu;L pipet tips&nbsp;</td><td>Rainin</td><td>17014401</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL centrifuge tubes</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>15 mL conische buis&nbsp;</td><td>VWR</td><td>89039-668</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conische buis</td><td>VWR</td><td>89039-660</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaatbuffer oplossing (PBS)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher Science</td><td>04-355-451</td><td></td></tr><tr><td>Dissectie gereedschappen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70 &mu;m filters</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>0.25% trypsine</td><td>Gibco</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>VWR</td><td>82003-820</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Electron Microscopy Science</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Alkaline Fosfatase kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>86R</td><td></td></tr><tr><td>Zilvernitraat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6506</td><td></td></tr><tr><td>Natriumthiosulfaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7026</td><td></td></tr><tr><td>Oil Red O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>190764</td><td></td></tr><tr><td>10% Neutral Buffered Formalin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5554-4L</td><td></td></tr><tr><td>Whatman filter Grade 1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z274852</td><td></td></tr><tr><td>Tartrate-Resistente Zure Fosfatase kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>387A</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>Electron</td><td>16220</td><td></td></tr><tr><td>MEM&alpha;</td><td>Gibco</td><td>12571</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal Runderserum</td><td>VWR</td><td>97068-085</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline/Streptomycine</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-glycerol fosfaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9891</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbinezuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Hoge Glucose&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>Rosiglitazone</td><td>Cayman Chemical</td><td>717410</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6634</td><td></td></tr><tr><td>IBMX</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethason</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>RANKL</td><td>Peprotech</td><td>310-01</td><td></td></tr><tr><td>mCSF</td><td>Peprotech</td><td>315-02</td><td></td></tr><tr><td>Axio Observer inverteer microscoop</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolatie, cultuur en differentiatie van beenmerg stromale cellen en osteoclast voorlopercellen van muizen

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Het beenmerg stromale cellen (BMSCs) vormen een celpopulatie routinematig gebruikt als een vertegenwoordiging van mesenchymale stamcellen in vitro. Ze bevinden zich in de holte van het beenmerg naast hematopoietische stamcellen (HSCs), die aanleiding tot rode bloedcellen, immuun progenitoren en osteoclasten geven kunnen. Dus, extracties van cel populaties uit de resultaten van de beenmerg in een zeer heterogene mix van diverse cel populaties, die kan uitdagingen aanwezig in experimenteel design en data interpretatie beschamen. Diverse isolatie en cultuur technieken zijn ontwikkeld in laboratoria met het oog op een min of meer homogene bevolking van BMSCs en HSCs invitro. Hier presenteren we twee methoden voor het isoleren van BMSCs en HSCs van lange beenderen van de muis: een methode die resulteert in een gemengde bevolking van BMSCs en HSCs en één methode die probeert te scheiden van de twee cel populaties gebaseerd op naleving. Beide methoden worden verkregen cellen geschikt voor osteogenic en adipogenic differentiatie experimenten zo goed als functionele testen.

Overzicht van de celculturen De twee cultuur technieken laten de beoordelingvan differentiatie op een gemengde populatie van BMCs bestaat uit BMSCs en HSCs (totale BMCs, figuur 1A) of een bevolking van BMSCs afgesplitst van HSCs (aanhanger BMSCs, figuur 1B). 48 hr na de cellen uit het beenmerg geïsoleerd worden en verguld (Figuur 1 c), ze snel hechten aan de onderkant van de plast...

In dit artikel presenteren we methoden om te isoleren en te onderscheiden van het beenmerg stromale cellen en hematopoietische stamcellen van lange beenderen van de muis. Twee verschillende protocollen worden gepresenteerd opbrengst andere cel populaties geschikt voor uitbreiding en differentiatie in botcellen, adipocytes en osteoclasten.

Isolatie, cultuur en differentiatie van beenmerg stromale cellen en Osteoclast voorlopercellen van muizen

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Het algemene doel van deze procedure is om beenmergstroomacellen, of BMSC's, te isoleren en te kweken. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van botten en adipocyten over voorlopercellen. Het grote voordeel van deze techniek is dat BMSC's op een relatief snelle, herhaalbare en goedkope manier kunnen worden geïsoleerd.Een visuele demonstratie van deze methode is nuttig, omdat de dissectiestappen moeilijk uit te leggen zijn met alleen tekst. Voordat u begint met de botoogstprocedure, voegt u 100 microliter beenmergstroomcelcultuurmedium toe in één microcentrifugebuis van 1,5 milliliter voor elke drie te oogsten botten. En snijdt u het uiteinde van één 200 microliter pipettentip per microcentrifugebuis af, zodat elke tip in een enkele buis past met de deksels gesloten.Plaats vervolgens de eerste 78-week-oude geëuthaniseerde muis in de rugligging op een dissectiebord en besproeit het dier met 70%ethanol. Gebruik een pincet om een tent van huid op de buik te maken en gebruik steriele dissectiescharen om een huidsnede van ongeveer een centimeter te maken. Trek de huid terug om de onderbuik en benen bloot te leggen.Snijd langs de iliacale crest

isolation-culture-differentiation-bone-marrow-stromal-cells

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Deze video toont de procedure voor de differentiatie van myeloïde dendritische cellen van de muis beenmerg. Isolatie van de muis scheenbeen en dijbeen, en verwerking van het beenmerg worden aangetoond. Foto's tonen celmorfologie voor en na de differentiatie, en figuren afbeelden cel fenotype en IL-12 productie na rijping met behulp van CpG worden weergegeven.

Cultuur van myeloïde dendritische cellen uit beenmerg precursors

In this video, we demonstrate the isolation and culture of bone marrow stromal cells from the long bones of mice. The isolated adherent BMSCs can be used for further analysis.

Isolation and Culture of Bone Marrow Stromal Cells from a Mouse Tibia

This video demonstrates the differentiation of bone marrow stromal cells (BMSCs) into adipocytes. In the two-step process, in the presence of specific growth factors and hormones, undifferentiated BMSCs first differentiate into preadipocytes. The second step involving treatment with glucose and insulin leads to the formation of mature adipocytes with multiple lipid droplets.

In Vitro Mouse Bone Marrow Stromal Cell Differentiation into Adipocytes

Osteoclasten zijn de voornaamste botresorberende cellen in het lichaam. Het vermogen om osteoclasten te isoleren in grote aantallen heeft tot aanzienlijke vooruitgang in het inzicht van osteoclast biologie. In dit protocol beschrijven we een werkwijze voor het isoleren, kweken en kwantificeren van osteoclasten in vitro.

Osteoclast Afleiding van Mouse Bone Marrow

Notch-signalering is een vorm van cellulaire communicatie die afhankelijk is van direct contact tussen cellen. Om Notch-signalering goed te induceren in vitro, moeten Notch-liganden aan cellen worden gepresenteerd in een geïmmobiliseerde toestand. Dit protocol beschrijft methoden voor in vitro stimulatie van Notch-signalering in voorlopers van muizenosteoclasten.

Stimulatie van Notch signalering in Mouse osteoclastvoorlopers

We laten zien hoe te identificeren en te isoleren 6 deelverzamelingen van myeloïde voorlopercellen uit lymfkliertest beenmerg met behulp van een combinatie van magnetische en fluorescentie sorteren (MACS en FACS). Dit protocol kan worden gebruikt voor in vitro cultuur assays (methylcellulose of vloeistof culturen), in vivo adoptief overdracht experimenten en RNA/eiwit analyses.

Identificatie en isolatie van de Oligopotent en Lineage-begaan myeloïde voorlopercellen uit beenmerg van de muis

Osteoclasten zijn weefsel-specifieke macrofagen polykaryons afgeleid van de monocyten-macrofagen afstamming van hematopoietische stamcellen. In dit protocol wordt beschreven hoe u beenmergcellen isoleren zodat grote hoeveelheden osteoclasten worden verkregen terwijl het risico op ongevallen in traditionele methoden wordt verminderd.

Isolatie, zuivering en differentiatie van osteoclast precursoren van het Rat beenmerg

Hier presenteren we een economische en efficiënte methode om zeer zuivere beenmerg-afgeleide dendritische cellen van muizen te isoleren en te genereren na 7 dagen cultuur met 10 ng / ml GM-CSF / IL-4.

Economisch en efficiënt protocol voor het isoleren en kweken van beenmerg-afgeleide dendritische cellen van muizen

Het huidige protocol beschrijft de isolatie en kweek van beenmerg-afgeleide macrofagen van muizen.

Isolatie en cultuur van beenmerg-afgeleide macrofagen van muizen

De transcriptionele heterogeniteit binnen humane adipogeen-afgeleide stromale cellen kan op enkelcellig niveau worden gedefinieerd met behulp van celoppervlaktemarkers en osteogene genen. We beschrijven een protocol dat flowcytometrie gebruikt voor de isolatie van celsubpopulaties met verhoogd osteogeen potentieel, die kunnen worden gebruikt om craniofaciale skeletreconstructie te verbeteren.

Isolatie en Verrijking van Human Adipose-afgeleide stromale cellen voor Enhanced Osteogenesis

Leer de isolatie en cultuur van beenmerg stromale cellen en osteoclast voorlopercellen van muizen. Deze methode levert populaties geschikt voor differentiatie naar osteoblasten en adipocyten.

Isolatie, cultuur en differentiatie van beenmerg stromale cellen en Osteoclast voorlopercellen van muizen

Meer video's verkennen