Name: Volwassen muis DRG Explant en losgekoppeld van cel modellen om te onderzoeken Neuroplasticiteit en reacties op milieu beledigingen, met inbegrip van de virale infectie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Leer een ex vivo DRG-explantatiemethode voor muizen om neuroplasticiteit en reacties op virale infecties te bestuderen. Deze techniek behoudt orgaanachtige complexiteit essentieel voor neuron-glia-interactieonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We bedanken de Imaging core-faciliteit in het Midwesten Universiteit (MWU) en de groep studenten [Chanmoly Seng, Christopher Dipollina, Darryl Giambalvo en Casey Sigerson] voor hun bijdragen in celkweek en imaging werk. Dit onderzoekswerk werd gesteund door de de MWU Intramural subsidiefinanciering M.F. en onderzoek start-up fondsen aan V.T.

Alle procedures met inbegrip van het gebruik van de dieren zijn goedgekeurd door de institutionele beoordeling bestuur goedgekeurde protocollen (IACUC-Midwesten University).
1. oogsten DRG van muis embryo 's
<ol><li>
De volwassen muizen door verstikking methode (CO2) gevolgd door onthoofding euthanaseren. Onmiddellijk overgaan tot het operatief verwijderen van de wervelkolom.
	<ol>
<li>De wervelkolom bloot door het kappen van de huidlaag dorsally met fijne schaar. Het isoleren van de wervelkolom door te snijden door middel van de ribben aan weerszijden van de kolom en het heiligbeen scheiden van de wervelkolom van de rest van het dier.</li>
		<li>Monteer de wervelkolom (ventrale kant naar boven) op een chirurgische mat met behulp van naalden/spelden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Met behulp van fijn schaar maken een double snijd aan beide zijden van de wervel lichamen aan de ventrale zijde van de gracht vertebral bloot.</li>
	<li>Onder een chirurgische Microscoop (vergroting ingesteld op 4 X), schaar voorzichtig hiermee kunt het ruggenmerg aan de kant om de contralaterale spinale dorsale wortels bloot te stellen en om te vinden van de Deutsche Reichsbahn, langs de dorsale wortels van de perifere zenuwen. Elke ganglion is gedeeltelijk verborgen in de lat. foramen.</li>
	<li>Verkrijgen van de Deutsche Reichsbahn, knijpen de achterwortelganglia (tussen het ruggenmerg en de DRG) met een pincet en trek voorzichtig uit de DRG uit de lat. foramen.</li>
	<li>Plaats de tweede verlostang op de spinale zenuw perifere aan de Deutsche Reichsbahn en trek de DRG samen met de spinale zenuw en spinale wortel.</li>
	<li>Plaats de verzamelde DRG in een 35 mm petrischaal met 3 mL ijskoud serum mediagroep (SFM)34.</li>
	<li>Overdracht van elke individuele DRG in een droog glas petrischaal onder een chirurgische Microscoop, schoon en trim uit overtollige vezels en bindweefsel nog steeds verbonden met de DRG met behulp van een mes. De DRG is herkenbaar als een uitpuilend transparante structuur langs de witte spinale zenuw/root. Bloedvaten worden vaak gevonden rond de Deutsche Reichsbahn.</li>
	<li>Plaats de schoongemaakte DRG in een nieuwe petrischaal met ijskoude SFM media.</li>
	<li>Verdun het mengsel van de gelatine-achtige eiwit (Zie Tabel van materialen) in ijskoude SFM (1:1).</li>
	<li>Plaat de DRG ex vivo in 12-Wells-platen vooraf bedekt met 10/20 µL van het mengsel van de gelatine-achtige eiwitten en zet ze in de incubator bij 37 ° C en 5% CO2 voor 30-60 min.</li>
	<li>Voeg voorzichtig 1.5-2 mL SFM aan het systeem van de cultuur te dekken van de gehele explant en handhaven de explantaten op het kweken van voorwaarden (37 ° C en 5% CO2). Opmerking: Dit is een belangrijke stap, omdat de DRG wordt verankerd aan het glas-gerechten alleen door het mengsel gepolymeriseerde gelatine-achtige eiwitten. Tijd van polymerisatie en pipetting vaardigheden zijn cruciaal voor het voorkomen van drijvende.</li>
	<li>Het medium van de groeiende DRG elke 72 h wijzigen en laat de DRG groeien voor zo lang als nodig.</li>
</ol>2. het isoleren van eencellige neuronen van DRG
<ol><li>Plaats alle de DRG verzameld in een 1,5 mL steriele buis met 1,2 mL F12 media met 1,25 mg/mL collagenase IV en het Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2 voor 45 min. Herhaal deze stap voor een andere 45 min na de eerste incubatie.</li>
	<li>Behandelen explantaten met 2 mL F12 media trypsine (0,025%) voor 30 min met onmiddellijk na de behandeling collagenase IV bij 37 ° C en 5% CO2.</li>
	<li>Incubeer met F12 media foetale runderserum (FBS; 33%) met 2 mL bij 37 ° C en 5% CO2 voor 15 min.</li>
	<li>Wassen explantaten driemaal met 2 mL F12 media en overgaan tot het mechanisch te distantiëren met een glazen pipet totdat de media bewolkt verandert. Opmerking: Deze procedure betrekt collectie van schoon/getrimd DRG van het dier zoals uiteengezet in de voorafgaande sectie. Bij het uitvoeren van mechanische dissociatie van explantaten, zacht en gebruik geen overmatige kracht aangezien het tot morsen en verlies van werkende materiaal leiden kan.</li>
	<li>Filtreer de gedissocieerde celcultuur door een 0,22 µm filter te verwijderen alle onzuiverheden en overtollig bindweefsel. Centrifugeer de gefilterde cel lysate (2.500 x g) gedurende 2 minuten.</li>
	<li>Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet cel in 500 µL van neurobasal media met supplement voor neuronale cultuur (1 x), antibiotica mengsel (1 x), L-glutamaat (0.5 mM), en zenuwen groeifactor (5 µg/mL) (Zie Tabel van materialen).</li>
	<li>Plaat de gedissocieerde cellen in laminin beklede cover dia's (50 µg/mL; Zie Tabel van materialen) op een voorkeur celdichtheid. Het bepalen van de celdichtheid met behulp van een cel counter. Opmerking: We vergulde cellen op 25.000 cellen/cover dia. Deze techniek maakt het mogelijk dissociatie van neuronen zowel satelliet gliacellen. Het gliale onderdeel samen met de pseudounipolar neuronen gekweekte speelt een cruciale rol voor neuronale overleven.</li>
</ol>3. HSV-1 infectie DRG explantaten of DRG-afgeleide gedissocieerde cellen
Nota: Dit werk werd gedaan door de bioveiligheid niveau 2 (BSL-2) eisen waaraan we hebben een volledig uitgeruste laboratorium dat is erkend door het Midwesten Universiteit bioveiligheid Comité strikt te volgen. Een KOS stam van HSV-1 werd gebruikt in deze studie. Neem passende metingen en veiligheidsmaatregelen volgens plaatselijke instellingen richtsnoeren als werken met virusstammen.
<ol><li>Bepalen en voor te bereiden van het virus in de juiste verdunningen in SFM media te infecteren het model. Het virus wordt gebruikt in deze studie was KOS stam van HSV-1. Als werken met DRG afkomstige losgekoppeld cellen, gebruikt u 1 eenheid van multipliciteit van infectie (MOI) voor infectie, wat betekent dat het aantal virus gelijke het aantal cellen.</li>
	<li>Als het infecteren van de Deutsche Reichsbahn explants, gebruiken het aantal virionen (b.v., 10.000 virionen) omdat een exact aantal cellen in een explant kan niet worden bepaald.</li>
	<li>Plaats de explant/cellen worden besmet met het virus in een steriele cel plaat of buis met een mengsel van SFM media en virus. Opmerking: Wij 25.000 virionen gebruikt voor een cover dia met 25.000 cellen (1 MOI). We gebruiken om te infecteren een explant, 10.000 virionen.</li>
	<li>Plaats van de cel plaat of buis bij 37 ° C gedurende infectie plaatsvinden; tijdstip van de viral blootstelling kan variëren afhankelijk van virale infectiviteit. Opmerking: Virale binnenkomst werd bevestigd met behulp van de ortho-nitrofenyl-β-galactoside (ONPG) en 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactopyranoside (X-gal) testen26.</li>
</ol>4. immunofluorescentie
<ol><li>Corrigeer de explantaten en eencellige monsters in 4% formaline bereid in een fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Wassen monsters 3 keer voor elke 10 min in PBS.</li>
	<li>Incubeer de monsters met de gewenste primaire antilichamen (anti-β-tubuline, anti-peripherin, anti-heparan sulfaat (HS), en/of anti-glycoproteïne D (gD) antilichaam; Zie Tabel van materialen voor verdunningen) verdund in PBS buffer met 0,3% Triton-X (PBST) en 10 % normale geit serum. Opslaan monsters bij 4 ° C's nachts.</li>
	<li>Wassen van de monsters 3 keer voor elke 10 min met PBS. Incubeer monsters bij kamertemperatuur gedurende 1 uur in de passende secundair antilichaam (488 en/of Cy3; Zie Tabel van materialen voor verdunningen) verdund in PBS.</li>
	<li>Wassen van de monsters 3 keer voor elke 10 min met PBS. Incubeer de monsters met Hoechst kleurstof (1,5 µM) in PBS gedurende 20 min vóór montage stap.</li>
	<li>Monteer de monsters op glas dia's met behulp van een fluorescentie montage medium en dekglaasje aan.</li>
</ol>

<ol><li>Muratori, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+new+neurons+in+dorsal+root+Ganglia+in+adult+rats+after+peripheral+nerve+crush+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Plast%22%5BJournal%5D)">Generation of new neurons in dorsal root Ganglia in adult rats after peripheral nerve crush injury.</a> Neural Plast. , 860546(2015).</li>
<li>Dellarole, A., Grilli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+dorsal+root+ganglia+sensory+neurons+express+the+early+neuronal+fate+marker+doublecortin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Adult dorsal root ganglia sensory neurons express the early neuronal fate marker doublecortin.</a> J Comp Neurol. 511 (3), 318-328 (2008).</li>
<li>Devor, M., Govrin-Lippmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+in+adult+rat+dorsal+root+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis in adult rat dorsal root ganglia.</a> Neurosci Lett. 61 (1-2), 189-194 (1985).</li>
<li>Farel, P. B., Boyer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+effects+of+nerve+injury+on+estimates+of+sensory+neuron+number+in+juvenile+bullfrog%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Transient effects of nerve injury on estimates of sensory neuron number in juvenile bullfrog.</a> J Comp Neurol. 410 (2), 171-177 (1999).</li>
<li>Geuna, S., Borrione, P., Poncino, A., Giacobini-Robecchi, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+morphometrical+changes+in+dorsal+root+ganglion+neurons+innervating+the+regenerated+lizard+tail%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Morphological and morphometrical changes in dorsal root ganglion neurons innervating the regenerated lizard tail.</a> Int J Dev Neurosci. 16 (2), 85-95 (1998).</li>
<li>La Forte, R. A., Melville, S., Chung, K., Coggeshall, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+neurogenesis+of+adult+rat+dorsal+root+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Somatosens+Mot+Res%22%5BJournal%5D)">Absence of neurogenesis of adult rat dorsal root ganglion cells.</a> Somatosens Mot Res. 8 (1), 3-7 (1991).</li>
<li>Pannese, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigations+on+the+Ultrastructural+Changes+of+the+Spinal+Ganglion+Neurons+in+the+Course+of+Axon+Regeneration+and+Cell+Hypertrophy+I.+Changes+during+Axon+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Z+Zellforsch+Mikrosk+Anat%22%5BJournal%5D)">Investigations on the Ultrastructural Changes of the Spinal Ganglion Neurons in the Course of Axon Regeneration and Cell Hypertrophy I. Changes during Axon Regeneration.</a> Z Zellforsch Mikrosk Anat. 60, 711-740 (1963).</li>
<li>Popken, G. J., Farel, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+neuron+number+in+neonatal+and+adult+rats+estimated+by+means+of+stereologic+and+profile-based+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Sensory neuron number in neonatal and adult rats estimated by means of stereologic and profile-based methods.</a> J Comp Neurol. 386 (1), 8-15 (1997).</li>
<li>Tandrup, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+estimates+of+number+and+size+of+rat+dorsal+root+ganglion+cells+in+studies+of+structure+and+cell+survival%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Unbiased estimates of number and size of rat dorsal root ganglion cells in studies of structure and cell survival.</a> J Neurocytol. 33 (2), 173-192 (2004).</li>
<li>Sarikcioglu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+severe+crush+injury+on+axonal+regeneration%3A+a+functional+and+ultrastructural+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Reconstr+Microsurg%22%5BJournal%5D)">Effect of severe crush injury on axonal regeneration: a functional and ultrastructural study.</a> J Reconstr Microsurg. 23 (3), 143-149 (2007).</li>
<li>Varejao, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+morphological+assessment+of+a+standardized+rat+sciatic+nerve+crush+injury+with+a+non-serrated+clamp%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Functional and morphological assessment of a standardized rat sciatic nerve crush injury with a non-serrated clamp.</a> J Neurotrauma. 21 (11), 1652-1670 (2004).</li>
<li>Hanack, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA+blocks+pathological+but+not+acute+TRPV1+pain+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">GABA blocks pathological but not acute TRPV1 pain signals.</a> Cell. 160 (4), 759-770 (2015).</li>
<li>Pagadala, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+NR1+subunit+of+NMDARs+in+primary+sensory+neurons+leads+to+hyperexcitability+and+pain+hypersensitivity%3A+involvement+of+Ca%282%2B%29-activated+small+conductance+potassium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Loss of NR1 subunit of NMDARs in primary sensory neurons leads to hyperexcitability and pain hypersensitivity: involvement of Ca(2+)-activated small conductance potassium channels.</a> J Neurosci. 33 (33), 13425-13430 (2013).</li>
<li>Zhang, X. L., Albers, K. M., Gold, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation-induced+increase+in+nicotinic+acetylcholine+receptor+current+in+cutaneous+nociceptive+DRG+neurons+from+the+adult+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Inflammation-induced increase in nicotinic acetylcholine receptor current in cutaneous nociceptive DRG neurons from the adult rat.</a> Neuroscience. 284, 483-499 (2015).</li>
<li>Zhu, Y., Lu, S. G., Gold, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+inflammation+increases+GABA-induced+depolarization+of+rat+cutaneous+dorsal+root+ganglion+neurons+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Persistent inflammation increases GABA-induced depolarization of rat cutaneous dorsal root ganglion neurons in vitro.</a> Neuroscience. 220, 330-340 (2012).</li>
<li>Amir, R., Devor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+cross-excitation+between+afferent+A-+and+C-neurons+in+dorsal+root+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Functional cross-excitation between afferent A- and C-neurons in dorsal root ganglia.</a> Neuroscience. 95 (1), 189-195 (2000).</li>
<li>Kim, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupled+Activation+of+Primary+Sensory+Neurons+Contributes+to+Chronic+Pain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Coupled Activation of Primary Sensory Neurons Contributes to Chronic Pain.</a> Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).</li>
<li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li>
<li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-Region-Specific+Organoids+Using+Mini-bioreactors+for+Modeling+ZIKV+Exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure.</a> Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).</li>
<li>Lowery, L. A., Van Vactor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+trip+of+the+tip%3A+understanding+the+growth+cone+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The trip of the tip: understanding the growth cone machinery.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (5), 332-343 (2009).</li>
<li>Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of axon guidance.</a> Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).</li>
<li>Miller, C., Shanks, H., Witt, A., Rutkowski, G., Mallapragada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oriented+Schwann+cell+growth+on+micropatterned+biodegradable+polymer+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Oriented Schwann cell growth on micropatterned biodegradable polymer substrates.</a> Biomaterials. 22 (11), 1263-1269 (2001).</li>
<li>Clark, P., Connolly, P., Curtis, A. S., Dow, J. A., Wilkinson, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topographical+control+of+cell+behaviour%3A+II.+Multiple+grooved+substrata%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Topographical control of cell behaviour: II. Multiple grooved substrata.</a> Development. 108 (4), 635-644 (1990).</li>
<li>Antinone, S. E., Smith, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+axon+transport+of+herpes+simplex+virus+and+pseudorabies+virus%3A+a+live-cell+comparative+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Retrograde axon transport of herpes simplex virus and pseudorabies virus: a live-cell comparative analysis.</a> J Virol. 84 (3), 1504-1512 (2010).</li>
<li>Holland, D. J., Miranda-Saksena, M., Boadle, R. A., Armati, P., Cunningham, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anterograde+transport+of+herpes+simplex+virus+proteins+in+axons+of+peripheral+human+fetal+neurons%3A+an+immunoelectron+microscopy+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Anterograde transport of herpes simplex virus proteins in axons of peripheral human fetal neurons: an immunoelectron microscopy study.</a> J Virol. 73 (10), 8503-8511 (1999).</li>
<li>Sharthiya, H., Seng, C., Van Kuppevelt, T. H., Tiwari, V., Fornaro, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HSV-1+interaction+to+3-O-sulfated+heparan+sulfate+in+mouse-derived+DRG+explant+and+profiles+of+inflammatory+markers+during+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurovirol%22%5BJournal%5D)">HSV-1 interaction to 3-O-sulfated heparan sulfate in mouse-derived DRG explant and profiles of inflammatory markers during virus infection.</a> J Neurovirol. 23 (3), 483-491 (2017).</li>
<li>Zerboni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+1+tropism+for+human+sensory+ganglion+neurons+in+the+severe+combined+immunodeficiency+mouse+model+of+neuropathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus 1 tropism for human sensory ganglion neurons in the severe combined immunodeficiency mouse model of neuropathogenesis.</a> J Virol. 87 (5), 2791-2802 (2013).</li>
<li>Koyuncu, O. O., Hogue, I. B., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus+infections+in+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Virus infections in the nervous system.</a> Cell Host Microbe. 13 (4), 379-393 (2013).</li>
<li>Swanson, P. A. 2nd, McGavern, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+diseases+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Virol%22%5BJournal%5D)">Viral diseases of the central nervous system.</a> Curr Opin Virol. 11, 44-54 (2015).</li>
<li>Tyler, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+viral+infections+of+the+central+nervous+system%3A+part+2%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Neurol%22%5BJournal%5D)">Emerging viral infections of the central nervous system: part 2.</a> Arch Neurol. 66 (9), 1065-1074 (2009).</li>
<li>Preston, C., Efstathiou, S., et al. Ch 33. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPreston%2C+C+%22Human+Herpesviruses+Biology%2C+Therapy%2C+and+Immunoprophylaxis%22">Human Herpesviruses Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis</a>. Campadelli-Fiume, G., Arvin, A., Mocarski, E., et al. , Cambridge University Press. (2007).</li>
<li>Roizman, B., Whitley, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inquiry+into+the+molecular+basis+of+HSV+latency+and+reactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">An inquiry into the molecular basis of HSV latency and reactivation.</a> Annu Rev Microbiol. 67, 355-374 (2013).</li>
<li>Arvin, A., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWhitley%2C+R+%22Human+Herpesviruses%3A+Biology%2C+Therapy%2C+and+Immunoprophylaxis%22">Human Herpesviruses: Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis</a>. , (2007).</li>
<li>Fueshko, S., Wray, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LHRH+cells+migrate+on+peripherin+fibers+in+embryonic+olfactory+explant+cultures%3A+an+in+vitro+model+for+neurophilic+neuronal+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">LHRH cells migrate on peripherin fibers in embryonic olfactory explant cultures: an in vitro model for neurophilic neuronal migration.</a> Dev Biol. 166 (1), 331-348 (1994).</li>
<li>Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+heparan+sulphate+in+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The role of heparan sulphate in inflammation.</a> Nat Rev Immunol. 6 (9), 633-643 (2006).</li>
<li>Zhang, X., Wang, B., Li, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+of+heparan+sulfate+and+heparanase+in+neuroinflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biol%22%5BJournal%5D)">Implications of heparan sulfate and heparanase in neuroinflammation.</a> Matrix Biol. 35, 174-181 (2014).</li>
<li>Du, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+GABAergic+signaling+within+sensory+ganglia+controls+peripheral+nociceptive+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Local GABAergic signaling within sensory ganglia controls peripheral nociceptive transmission.</a> J Clin Invest. 127 (5), 1741-1756 (2017).</li>
<li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel%3A+a+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te openbaarmaking.

De ex vivo DRG model is uiterst nuttig om te onderzoeken van een breed scala aan evenementen zoals neuron-glia interactie en het effect van de communicatie op beide neuronale en gliale metabolisme37. Verder, de DRG-model kan worden gebruikt als een rendabele tool inspelen op relevante vragen betreffende pathogeen mechanisme en bijbehorende markeringen door het ontwikkelen van ex vivo systemen voor chronische en latente acute fase van infectie of in een bepaalde ziekte. Bovendien,...

In dit manuscript rapporteren we een methode voor het verkrijgen van een organotypic ex vivo model van een muis afgeleid DRG modelsysteem als een bewaarde weefsel-achtige communicatie te onderzoeken van een breed scala aan biologische reacties op PNS beledigingen variërend van neuron-gliale interactie, Neuroplasticiteit, inflammatoire merkers, virale infectie. Daarnaast ontwikkelden we verder een protocol wilt maken van een primaire co cultuur van DRG-afgeleide één sensorische neuronen en satelliet cellen.
De DRG zijn grijs-zaak-eenheden van de satelliet langs de dorsale wervelkolom wortels van spinale zenuwen buiten het centrale zenuwstelsel (CNS) gelegen. De Deutsche Reichsbahn, gelegen in de nabijheid van lat. foramen, huis pseudounipolar sensorische neuronen en satelliet gliacellen. De pseudounipolar neuronen zijn voorzien van een enkele neurite die splitst in een perifere proces uitvoeren van somatische en viscerale ingangen van perifere doelstellingen aan de cel lichaam, en een centrale proces waarmee sensorische informatie van de cel lichaam in het centraal zenuwstelsel. Een bindweefsel capsule definieert en isoleert van deze perifere cluster van zenuwcellen en gliacellen van de CNS. Geen postnatale cel migratie naar of van de DRG ooit is beschreven en een lokale stamcel niche is verantwoordelijk voor neurogene gebeurtenissen in de gehele leven1. Dus, dit model is bijzonder geschikt om te studeren volwassen neurogenesis, axonogenesis, reageren op traumatische laesie, en cel dood2,3,4,5,6,7 ,8,9 .
Op het gebied van neuroregeneration, de DRG geoogst van in vivo en reproduceert transplanteren in vitro axonotmesis, een voorwaarde van de schade in welke axonen zijn volledig verbroken en de neuronale cel lichaam wordt losgekoppeld van het bezenuwde doel10 ,11. Het is algemeen bekend dat perifere zenuw letsel leiden verminderde en verhoogde genexpressie in de DRG tot kan en veel van deze veranderingen het gevolg van regeneratieve processen zijn maar velen kunnen ook een resultaat van immune reactie of een andere reactie van de non-neuronale cellen. Met behulp van een ex vivo systeem van geïsoleerde DRG, sommige van deze complexiteit is verwijderd en mechanistische trajecten kunnen gemakkelijker worden onderzocht.
Naast haar centrale rol bij het overbrengen van sensorische input voor de CNS, de overvloed van receptoren voor vele neurotransmitters, met inbegrip van GABA12,13,14,15 op het niveau van de neuronale soma, evenals bewijs van interneuronal cross-excitatie kan suggereren dat DRG zijn geavanceerde voorlopige integrators van sensorische input16,17. Deze nieuwe bevindingen verlenen naar de DRG explant de kenmerken van een mini-neuronale netwerksysteem vergelijkbaar met andere "mini brein" modellen, die nerveus-weefsel-specifieke organoids gebruikt voor bredere proefvelden van onderzoek en therapeutische benadering van neurologische ziekten18,19. Deze bewijzen samen met het feit dat de DRG een discrete en welomschreven cluster van neuronale weefsel daaromheen een bindweefsel capsule is, maken het een geschikt orgaan voor transplantatie- ex vivo .
Kweken muis DRG presenteert een aantrekkelijk meercellige optie model van menselijke pathophysiologies als gevolg van structurele en genetische gelijkenissen tussen de soorten. Een grote opslagplaats van transgene muis stammen is bovendien zeer bevorderlijk voor toekomstige mechanistische studies. Neurite uitbreiding zowel tijdens de ontwikkeling en na blessure vereist mechanische interacties tussen groei kegel en substraat20,-21. Nano - en micro-patroon substraten zijn gebruikt als instrumenten om direct uitvloeisel van de neurite en hun capaciteit om te reageren op topografische kenmerken in hun microenvironments aan te tonen. Neuronen hebben aangetoond dat overleven, houden, migreren en hun axonen ga oppervlaktekenmerken zoals groeven in substraten22,23te oriënteren. Echter, deze studies hebben typisch gekweekte cellijnen gebruikt en het is moeilijk te voorspellen hoe de primaire neuronale cellen zal reageren op welomschreven, fysieke signalen in vivo of ex vivo.
De ex vivo explant model van muis DRG gebruikt voor dit voorstel bootst de echte cel-cel interactie en biochemische signalen rond groeiende axonen. Van de vele verschillende experimentele paradigma's variërend van axonale regeneratie, neurosphere productie, tot neuroinflammation, de DRG explant blijft model om te dienen als een waardevol instrument te onderzoeken van de virale infectie en latentie aspect binnen sensorische ganglia24,25,26,27.
Het zenuwstelsel (NS) is in het algemeen doel voor virale infecties28,29,30. De meeste virussen infecteren epitheliale en endothelial cel oppervlakken en maken hun weg uit de oppervlakte weefsel aan de NS via perifere zenuwen sensorische en motorische vezels. In het bijzonder het herpes simplexvirus type 1 (HSV-1) na een eerste infectie in epitheliale cellen een levenslang latentie bij voorkeur in de sensorische ganglia vestigt de DRG de PNS31,32. HSV-1 neuroptropic vermogen van het infecteren van de PNS leidt uiteindelijk tot neurologische ziekten33.

<table><tbody><tr><td>Adult Mice NIH/Swiss</td><td>Harlan Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>35mm petri dish</td><td>Cell Treat</td><td>229635</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel ECM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1270</td><td>gelatinous eiwitmengsel</td></tr><tr><td>F12 Media</td><td>Gibco</td><td>11765-054</td><td>*Onderdeel van SFM media</td></tr><tr><td>Collagenase IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6178</td><td></td></tr><tr><td>0.22um filter</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal media</td><td>Gibco</td><td>10888-022</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>Supplement voor neuronale cultuur</td></tr><tr><td>PSN antibiotica</td><td>Gibco</td><td>15640-055</td><td>*Onderdeel van SFM media Antibiotische mix</td></tr><tr><td>L-glutamaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td>*Onderdeel van SFM media</td></tr><tr><td>NGF</td><td>Alomone Labs</td><td>N-100</td><td>Nerve growth factor</td></tr><tr><td>Laminine gecoate dekglasjes</td><td>Neuvitro</td><td>GG-14-Laminin</td><td></td></tr><tr><td>ONPG substraat</td><td>Pierce</td><td>34055</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>Invitrogen</td><td>15520034</td><td></td></tr><tr><td>Antibody anti-B-tubuline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8328</td><td>1:2000 verdunning</td></tr><tr><td>Antibody anti-peripherin</td><td>Millipore</td><td>AB1530</td><td>1:1000 verdunning</td></tr><tr><td>Hoechst kleurstof</td><td>Thermo Fisher</td><td>62249</td><td>1.5 &micro;M eindconcentratie</td></tr><tr><td>Anti-heparine sulfaat</td><td>US Biological</td><td>H1890-10</td><td>0.180555556</td></tr><tr><td>Anti gD antilichaam</td><td>Virostat</td><td>196</td><td>1:10 verdunning</td></tr><tr><td>BSA&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153-100G</td><td>*Onderdeel van SFM media</td></tr><tr><td>BME</td><td>Gibco</td><td>21010-046</td><td>*Onderdeel van SFM media</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021-1KG</td><td>*Onderdeel van SFM media</td></tr><tr><td>KIT (Insulin-transferrine-Selenium-A)</td><td>Gibco</td><td>51300-044</td><td>*Onderdeel van SFM media</td></tr><tr><td>Vitamine-C</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4403</td><td>*Onderdeel van SFM media</td></tr><tr><td>Putrescine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7505</td><td>*Onderdeel van SFM media</td></tr><tr><td>488 (geit anti-muis)</td><td>Life Technologies</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 (geit anti-konijn)</td><td>Jackson Immunoresearch laboratories</td><td>111-165-003</td><td></td></tr><tr><td>Normaal Geit serum&nbsp;</td><td>Vector</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>Formaline Oplossing</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT5014-120ML</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-031</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284-500ML</td><td></td></tr><tr><td>VectaShield</td><td>Vector</td><td>H-1500</td><td>Flurescentie berging</td></tr><tr><td>Diamond White Glass Dekglasjes</td><td>Globe Scientific</td><td>1380-20</td><td></td></tr></tbody></table>

volwassen muis drg explant en losgekoppeld van cel modellen om te onderzoeken neuroplasticiteit en reacties op milieu beledigingen, met inbegrip van de virale infectie

Adult Mouse DRG Explant and Dissociated Cell Models to Investigate Neuroplasticity and Responses to Environmental Insults Including Viral Infection

Dit protocol beschrijft een ex vivo -model van de muis afkomstige dorsal root ganglia (DRG) explant en in vitro DRG afkomstige co cultuur van gedissocieerde sensorische zenuwcellen en gliacellen satelliet. Dit zijn handige en veelzijdige modellen te onderzoeken van een verscheidenheid van biologische reacties fysiologische en pathologische omstandigheden van het perifere zenuwstelsel (PNS) variërend van neuron-gliale interactie, Neuroplasticiteit, gekoppeld neuroinflammation en virale infectie. Het gebruik van de DRG explant is wetenschappelijk voordelig in vergelijking met simplistische afzonderlijke cellen modellen om meerdere redenen. Bijvoorbeeld, als een organotypic cultuur kunt de DRG explant ex vivo overdracht van een gehele neuronale netwerk, met inbegrip van de extracellulaire communicatie die een belangrijke rol in alle functies voor de neuronale en gliale. Verder, DRG explantaten kunnen ook worden gehandhaafd ex vivo voor enkele dagen en de kweekomstandigheden kunnen worden verstoord als gewenst. Bovendien, kan de geoogste DRG in een in vitro co cultuur van primaire sensorische zenuwcellen en gliacellen satelliet te onderzoeken neuronale-gliale interactie, neuritogenesis, axonale kegel interactie met de extracellulaire verder worden losgekoppeld communicatie, en meer in het algemeen, de diverse aspecten die zijn gekoppeld aan de neuronale metabolisme. Dus biedt het systeem van de DRG-explant een grote mate van flexibiliteit te bestuderen van een breed scala aan gebeurtenissen met betrekking tot de biologische, fysiologische en pathologische omstandigheden op een kosteneffectieve manier.

Meerdere aspecten van Neuroplasticiteit en neuron-omgeving interactie kunnen worden onderzocht met behulp van de Deutsche Reichsbahn en een gedissocieerde eencellige cultuur model. We begonnen de studies door het isoleren van een DRG explant en DRG-afgeleide gedissocieerde cellen zo schematisch weergegeven in Figuur 1. Zowel weefsel en afzonderlijke cellen modellen kunnen worden geanalyseerd met behulp van een verscheidenheid van moleculaire technieken zoals immunofluorescentie, westelijke v...

In dit verslag zijn de voordelen van organotypic culturen en gedissocieerde primaire culturen van muis-afgeleide dorsal root ganglia gemarkeerd om te onderzoeken van een breed scala van mechanismen die zijn gekoppeld aan neuron-gliale interactie, Neuroplasticiteit, neuroinflammation, en reactie op virale infectie.

Volwassen muis DRG Explant en losgekoppeld van cel modellen om te onderzoeken Neuroplasticiteit en reacties op milieu beledigingen, met inbegrip van de virale infectie

This protocol describes an ex vivo model of mouse-derived dorsal root ganglia (DRG) explant and in vitro DRG-derived co-culture of dissociated sensory ...

Het algemene doel van deze procedure is om een ex vivo model van dorsale wortelganglia explantaat en/of DRG-afgeleide primaire gedissocieerde celmodel te creëren om neuronale reacties op omgevingssignalen te onderzoeken. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van neuroplasticiteit, of neuro-ontsteking als reactie op blootstelling aan pathogenen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de dorsale wortelganglia explantaten de orgaan-achtige complexiteit behouden, wat nuttig is om de celcyclus in actie te laten gaan en veranderingen in het intercellulaire micro-omgeving als gevolg van specifieke behandelingen.Zorgvuldige demonstratie van deze methode is erg cruciaal, aangezien het identificeren en oogsten van DRG's vrij moeilijk kan zijn vanwege hun grootte en locatie. Om deze procedure te beginnen, bloot de wervelkolom door de huidlaaag van het dier dorsoaal te snijden met fijne schaar. Vervolgens isoleer de wervelkolom door de ribben aan beide zijden van de kolom en door het heiligbeen te snijden, waardoor de wervelkolom gescheiden wordt van de rest van het dier.Vervolgens monteer de wervelkolom met de ventrale kant omhoog op ee

adult-mouse-drg-explant-dissociated-cell-models-to-investigate

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

This video demonstrates a method to develop dorsal root ganglia or DRG explant culture and DRG-dissociated cell models using isolated mouse DRG tissues. These models help to study various mechanisms with neuron-glial interactions in a controlled environment.

Generating Dorsal Root Ganglion Explant and Dissociated Cell Culture

This video demonstrates the generation of a neuronal injury model in mouse primary cerebellar granule neurons. It outlines the steps involved in inducing neuronal injury using NMDA, an excitatory neurotransmitter receptor agonist, and glycine, a co-agonist. NMDA and glycine bind to specific neuronal receptors, causing their overstimulation and resulting in a massive intracellular calcium influx, which leads to neuronal cell damage and death.

Modeling Neuronal Injury in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

This video outlines the generation of a neuronal injury model using reactive oxygen species (ROS) in mouse primary cerebellar granule neurons. It details the process of inducing oxidative stress by adding high concentrations of hydrogen peroxide. ROS exposure causes DNA strand breaks and genomic instability. Additionally, the oxidation of cellular proteins impairs their functions, while lipid peroxidation compromises membrane integrity. This cascade leads to cytochrome c release and caspase...

Modeling Reactive Oxygen Species-Induced Neuronal Death in Mouse Cerebellar Granule Neurons

Celkweekmodellen gedetailleerde controle milieuomstandigheden en dus een krachtig platform om verschillende aspecten van neuronale cel biologie. We beschrijven een snelle, goedkope en betrouwbare wijze te isoleren, dissociëren en cultuur sensorische neuronen van kippenembryo's. Details van de ondergrond voorbereiding en immuuncytochemie zijn ook aanwezig.

Isolatie en Cultuur van Gedissocieerde sensorische neuronen van Chick Embryo

In dit artikel beschrijven we, in detail, een protocol voor het genereren van neurosfeerculturen uit postnatale muisneurale stamcellen afkomstig van de belangrijkste muisneurogene niches. Neurosferen worden gebruikt om neurale stamcellen te identificeren uit hersenweefsel waardoor de schatting van voorloper celnummers. Bovendien kunnen deze 3D-structuren worden verguld met differentiërende omstandigheden, waardoor neuronen, oligodendrocyten en astrocyten ontstaan, waardoor het cellot kan worden...

Isolatie en uitbreiding van Neurosferen van Postnatale (P1−3) Muis Neurogene Niches

Het voetpad inentingsmodel is een waardevol hulpmiddel voor het karakteriseren van virale geïnduceerde neuro-inducerende reacties in vivo. Het biedt met name een duidelijke beoordeling van virale kinetiek en bijbehorende immunopathologische processen die in het perifere zenuwstelsel worden geïnitieerd.

Mouse Footpad Inenting Model om virale geïnduceerde neuro-ontstekingsreacties te bestuderen

Hier presenteren we een protocol voor in vitro isolatie van meerdere gliacelpopulaties van een muis CNS. Deze methode maakt de segregatie van regionale microglia, oligodendrocytenvoorlopercellen en astrocyten mogelijk om de fenotypen van elk in verschillende cultuursystemen te bestuderen.

Dissectie en isolatie van Murine Glia uit meerdere regio's van het centrale zenuwstelsel

We presenteren een in vitro model om olfactorisch verwarmend glia (OEG) neuroregeneratief vermogen te beoordelen, na neuraal letsel. Het is gebaseerd op een cocultuur van axotomized volwassen retinale ganglion neuronen (RGN) op OEG monolagen en daaropvolgende studie van axonale regeneratie, door het analyseren van RGN axonale en somatodendritische markers.

Cocultuur van Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons met Olfactory Ensheathing Glia, als een In Vitro Model van Volwassen Axonale Regeneratie

Dit protocol presenteert een unieke manier om celculturen van het centrale zenuwstelsel te genereren uit embryonale dag 17 muizenhersenen voor neuro(immuno)logisch onderzoek. Dit model kan worden geanalyseerd met behulp van verschillende experimentele technieken, waaronder RT-qPCR, microscopie, ELISA en flowcytometrie.

Het opzetten van gemengde neuronale en gliale celculturen van embryonale muizenhersenen om infectie en aangeboren immuniteit te bestuderen

Dit protocol beschrijft de viraal-gemedieerde ectopische expressie van Neurod1 na corticale ischemische beroerte. Neurod1 wordt toegediend (1) met behulp van het Cre-Flex AAV-systeem bij wildtype muizen tijdens de subacute fase na een beroerte (7 dagen) en (2) met behulp van een enkele AAV-vector in voorwaardelijke reportermuizen tijdens de chronische fase na een beroerte (21 dagen).

AAV-systemen en muismodellen voor het onderzoeken van ectopische expressie van neurod1 in getransduceerde cellen op subacute en chronische tijden na ischemische beroerte

Hier bieden we een gedetailleerde methodologie voor het isoleren van het netvlies van het oog van de muis voor uitgebreide ex vivo experimenten. Dit protocol benadrukt het toegankelijk maken van deze technisch veeleisende benadering voor onderzoekers die willen profiteren van de onderzoeksmogelijkheden die worden geboden door retinale glia in situ te houden in levend weefsel.

Een ex vivo explantatiemodel voor het bestuderen van gliale interacties in het netvlies van de muis

Leer een ex vivo DRG-explantatiemethode voor muizen om neuroplasticiteit en reacties op virale infecties te bestuderen. Deze techniek behoudt orgaanachtige complexiteit essentieel voor neuron-glia-interactieonderzoek.

Volwassen muis DRG Explant en losgekoppeld van cel modellen om te onderzoeken Neuroplasticiteit en reacties op milieu beledigingen, met inbegrip van de virale infectie (Video) | JoVE Journal

Volwassen muis DRG Explant en losgekoppeld van cel modellen om te onderzoeken Neuroplasticiteit en reacties op milieu beledigingen, met inbegrip van de virale infectie

Meer video's verkennen