Een kwantitatieve Dot Blot Assay voor AAV titratie en het gebruik ervan voor functionele beoordeling van het Adeno-associated Virus Assembly-activeren eiwitten

Deze methode kan zowel gezuiverde als niet-gezuiverde AV-vac-titers bepalen en de mogelijkheid beoordelen van de AAV AAP om de assemblage van cognate en heterologe AV-serotype-capside te bevorderen. Het grootste voordeel van deze techniek is dat het een eenvoudige, goedkope methode is die de nadelen van andere AAV-titratiemethoden vermijdt. Hoewel deze methode veelal is gebruikt voor AAV-vectorkwantificering, kan deze ook worden toegepast om verschillende fundamentele vragen over AAV-biologie te beantwoorden, zoals getoond in dit protocol.

Op dag nul, na het kweken van HEK 293-cellen tot 90% confluency, bereid het transfectie-reagens voor door de plasmiden in 96 microliter PBS zonder calcium of magnesium te mengen in steriele 1,5 milliliter microcentrifugebuisjes. Zoals aangegeven in deze tabel, is de totale hoeveelheid DNA twee microgram per putje. Voeg vier microliter PEI-oplossing toe aan de PBS-plasmid-DNA-mix.

Het uiteindelijke volume is ongeveer 100 microliter of 5%volume van het kweekmedium. Vortex de buisjes kort en incubeer het DNA PEI-mengsel gedurende 15 minuten op kamertemperatuur. Na de incubatie, draai de buisjes kort in een microcentrifuge om de vloeistof naar de bodem te verzamelen.

En voeg het DNA PEI-mengsel druppelsgewijs toe aan het kweekmedium in elke put van de HEK 293-kweekplaat. Schud vervolgens voorzichtig de platen en plaats ze terug in een incubator van 37 graden Celsius met 5%CO2. Transfectie van HEK 293-cellen is een essentieel onderdeel van dit protocol voor productie van virus met hoge titer.

Gezonde, laag-passage-nummer cellen moeten worden gebruikt en er moet voor worden gezorgd dat de monolayer van de cellen niet wordt verstoord. Op dag een en twee, onder een omgekeerde fluorescentiemicroscoop, observeer cellen die getransfecteerd zijn met het PCMVGFP-plasmide om de transfectie-efficiëntie te beoordelen. Op dag vijf, pipet de cellen en het virusbevattende medium op en neer of gebruik een cellscraper om alle cellen te schrapen.

Breng vervolgens de suspensie over in 15 milliliter polypropyleen conische buisjes. Bewaar de monsters bij min 80 graden Celsius tot gebruik. Om de virale deeltjes te herstellen, ontdooi de bevroren buisjes snel in een waterbad van 37 graden Celsius.

Vortex vervolgens de buisjes krachtig gedurende een minuut om de herstel van AAV uit de cellen te maximaliseren. Pellet het celdebris door centrifugatie bij 3.700 keer G en vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Breng vervolgens 200 microliter van het supernatant van elke buis over in gelabelde microcentrifugebuisjes met schroefdopjes voor de dot blot-test.

Om de monsters te behandelen met Serratia marcescens endonuclease, bereid mix A en mix B reagentia. Voeg 10 microliter van elk reagens toe aan elke monsterbuis. Vortex de monsters gedurende vijf seconden en draai ze kort om het vocht naar de bodem van de buisjes te verzamelen.

Bekijk vervolgens de buisjes gedurende ten minste een uur op 37 graden Celsius. Na kort draaien van de monsters, voer de proteinase K-behandeling uit door mix C-reagens voor te bereiden en 180 microliter aan elke buis toe te voegen. Na het voortdurend draaien en kort draaien van de buisjes opnieuw, incubeer ze gedurende een uur op 55 graden Celsius.

Zodra de monsters terug op kamertemperatuur zijn, voeg 200 microliter fenol-chloroform toe en vortex de buisjes gedurende een minuut. Draai vervolgens de monsters in een microcentrifuge bij 16.100 keer G en kamertemperatuur gedurende ten minste vijf minuten. Breng 320 microliter van de waterige laag of 80%van het waterige vloeistofvolume over in een nieuwe standaard microcentrifugebuis.

Deze overdrachtstap is van cruciaal belang, aangezien hetzelfde volume uit het monster moet worden genomen om de nauwkeurigheid voor AAV-kwantificering te behouden. Er moet voor worden gezorgd dat de organische fase wordt vermeden bij het verwijderen van de waterige laag. Bereid het mix D-reagens voor en voeg 833 microliter toe aan elke monsterbuis.

Na het voortdurend draaien van de buisjes, incubeer ze gedurende ten minste 20 minuten bij min 80 graden Celsius. Na centrifugatie, giet het supernatant af en demp de buisjes eenmaal op een schone papieren handdoek. Pipetteer ongeveer 500 microliter 70%ethanol in elke buis en vortex de buisjes gedurende vijf seconden.

Na het opnieuw draaien van de monsters, giet het supernatant af en demp de buisjes eenmaal op een schone papieren handdoek. Droog vervolgens de pellets bij 65 graden Celsius voordat ze worden opgehangen in TE-buffer. Om de dot blot-test uit te voeren, bereid plasmide-DNA-standaarden voor door AAV-vector-genoomplasmide-DNA te verdunnen tot 10 nanogram per microliter in water of Tris-HCL-buffer.

Breng een aliquot van 25 microliter van het verdunde plasmide-DNA over in een verse buis en lineariseer het met een geschikt restrictie-enzym in een reactievolume van 50 microliter gedurende een uur. Voeg 450 microliter water of TE toe aan de buis met het verteerde plasmide-DNA-standaard en meng grondig. Breng vervolgens 70 microliter van deze mengsel over in een nieuwe 1,5 milliliter microcentrifugebuis met 1.330 microliter water of TE om een verdunde plasmide-standaard te maken.

Om de dot blot-apparatuur op te zetten, snijd met een schaar het blotmembrane naar een geschikte grootte voor het aantal monsters en standaarden. Week het membraan 10 minuten in water voordat u het op de dot blot-apparatuur plaatst. Bedek vervolgens de ongebruikte putten.

Voeg water toe aan de putten waarin de monsters worden geladen. Breng een vacuüm aan, trek het water door de putten, controleer op fouten en draai vervolgens de schroeven weer vast. Test opnieuw indien nodig.

Breng 400 microliter van elke verdunde plasmide-DNA-standaard aan op elke put en laad vier banen van standaardverdunningen. Gebruik twee afzonderlijke aliquotten van de standaardvertering en laad deze in duplicaat. Breng vervolgens 200 microliter per put van el