Gedrags- en reproductieve gevolgen van embryonale blootstelling aan toxische stoffen in lage dosis op lange termijn

Het algemene doel van deze procedures is om de langetermijneffecten van lage dosis BPA-blootstelling in vroege embryogenese te onderzoeken. C.elegans-embryo's worden gedurende een beperkte periode blootgesteld aan BPA en getest bij het bereiken van de volwassenheid op vruchtbaarheid en leergedrag. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen te beantwoorden over de langetermijnontwikkelingseffecten van blootstelling aan toxische stoffen zoals bisfenolen en andere hormoonverstorende stoffen.

Het grote voordeel van deze techniek is dat het mogelijk maakt om langdurige en subtiele effecten van toxische stoffen op de ontwikkeling te testen door middel van kwantitatieve gedragsanalyses op een eenvoudig te gebruiken ongewerveld laboratoriummodel. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot het begrijpen van de ontwikkelings- en neurale basis van schadelijke gezondheidseffecten van blootstelling aan toxische stoffen, zelfs in lage doses. We hadden voor het eerst het idee voor deze experimenten toen we ons realiseerden dat een aantal complexe of multifactoriële stoornissen een of andere ontwikkelingscomponent leek te hebben.

Die zijn mogelijk gedeeltelijk te wijten aan abnormale expressie van kritische genen. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal omdat de stappen voor het aanleren van aanrakingsgewoonten moeilijk te leren zijn alleen via tekstgebaseerde instructies. De dag voor synchronisatie, zet N2-wormen over naar platen van 100 millimeter die NGM-medium bevatten, verspreid met E.coli OP50.

Door een plak van ongeveer één centimeter vierkant te snijden. Laat de wormen drie dagen groeien bij 20 graden Celsius. Na drie dagen, wanneer de platen bevolkt zijn met goed gevoede, volwassen volwassenen die zichtbare embryo's bevatten, begint u met synchronisatie door elke plaat eerst te wassen met vijf milliliter M9-buffer en het vocht over te brengen naar een steriele 15 milliliter conische centrifugeerbuis.

Centrifugeer gedurende vier minuten bij 3.000 keer grootheid bij kamertemperatuur. Na de centrifugatie, gebruik een tien milliliter pipette om voorzichtig het supernatant van elke losse pellet van volwassen wormen te verwijderen. Voeg vervolgens 5 milliliter vers bereide hypochlorietoplossing toe aan elke pellet wormen en meng voorzichtig.

Centrifugeer gedurende vier minuten bij 3.000 keer grootheid bij kamertemperatuur. Het is van cruciaal belang om gesynchroniseerde populaties te verkrijgen. Het bereiden van een verse hypochlorietoplossing helpt bij het voorkomen van besmetting en niet-gesynchroniseerde dieren.

Gebruik vervolgens een tien milliliter pipette om het supernatant te verwijderen en was de zeven milliliter M9-buffer. Herhaal deze stap twee keer. Na de laatste wassing, voeg ongeveer 100 microliter M9-buffer toe aan de eieren.

Breng vervolgens ongeveer 50 microliter eieren over naar microfugebuisjes van twee milliliter die BPA bevatten, verdund in S-buffer. Pas de hoeveelheid S-buffer aan om de juiste uiteindelijke concentratie BPA per buisje te verzekeren, zoals getoond in de tabel. Plaats de buisjes op een schuddende of roterende shaker, bewegend met 25 kantels per minuut, of 25 RPM gedurende vier uur bij 20 graden Celsius.

Na vier uur plaatst u de buisjes in buisjeshouders en laat de wormen bezinken. Gooi het supernatant weg en zet de wormen over naar NGM-platen gezaaid met OP50 E.coli. Laat de wormen 60 uur groeien bij 20 graden Celsius.

Onderzoek de platen elke dag op besmetting. Besmette NGM-platen zijn meestal verkleurd en vergezeld van individuele kolonies. Controleer wormen onder de microscoop op overbevolking.

Gebruik eerst een met vuur gesteriliseerde 30 gauge platina draad om ongeveer tien gesynchroniseerde jonge volwassen wormen over te brengen naar nieuwe, ongezaaide NGM-platen. Laat de wormen vijf minuten ongestoord om ze de tijd te geven om zich aan te passen aan de nieuwe plaat. Steriliseer vervolgens een wenkbrauwhaar aan het uiteinde van een houten prikker of tandenstoker door het in 70% ethanol te dopen.

Veeg af met een schone, pluisvrije doek en wacht een minuut tot het ethanol is verdampt. Tik zachtjes op de worm op het hoofd met de wenkbrauwhaar. Herhaal de aanrakingen, waarbij u tien seconden tussen de aanrakingen laat om de worm te laten herstellen.

Ga door met aanraken, laat tien seconde interstimulusintervallen toe totdat de worm niet meer achteruit beweegt. Noteer het aantal aanrakingen dat nodig is voor dit gewoontegedrag. Het toestaan van een interval van tien seconden tussen de aanrakingen is belangrijk, omdat dit het dier hersteltijd geeft en helpt bij het verkrijgen van consistente habituatiegedragsanalyses.

Volwassen dieren die embryonaal zijn blootgesteld aan een micromolar of hogere concentratie BPA's, legden significant minder eieren in vergelijking met de controle, vertegenwoordigd door de horizontale lijn. Volwassen dieren afgeleid van embryo's die zijn blootgesteld aan BPA-concentraties zo laag als 0,1 micromolar, vertonen niet-associatieve tekorten op basis van het verhoogde aantal voorste aanrakingen dat nodig is voor hen om te wennen. Bij het voorbereiden van embryo's voor BPA-blootstelling is het belangrijk om een plaat te kiezen met goed gevoede C.elegans-volwassenen met volwassen eieren zichtbaar onder de dissectiemicroscoop om een voldoende steekproefomvang te hebben.

Deze techniek baant de weg voor onderzoekers op het gebied van milieutoxicologie om de effecten van toxines en andere hormoonverstorende stoffen op gedrag te evalueren en mechanistische experimenten te ontwerpen. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u vroege C.elegans-embryo's aan BPA kunt blootstellen en hoe u het habituatiegedrag kunt testen bij de resulterende volwassenen afgeleid van de BPA-blootgestelde embryo's.