Een verbeterde methode voor de verzameling van de cerebrospinale vloeistof van narcose muizen
19 maart 2018
Dit protocol beschrijft een verbeterde techniek voor de overvloedige hoeveelheid cerebrospinale vloeistof (CSF) met geen besmetting uit bloed. Met grotere sample collectie en zuiverheid, kunnen meer analyses worden uitgevoerd met behulp van CSF om ons begrip van ziekten die de hersenen en het ruggenmerg beïnvloeden.
Het algemene doel van deze procedure is om de verzameling van hersenvocht uit muizen te verbeteren zonder besmetting van bloed. Deze methode biedt een eenvoudige en betrouwbare manier om CSF te verzamelen voor het monitoren van biomarkers van neurale ziekten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de toevoeging van de micromanipulator om te helpen bij de verzameling van CSF uit muizen de besmetting van bloed tijdens de verzameling vermindert.
Begin door een getrokken glazen capillair in een capillairhouder te plaatsen die stevig is gemonteerd op een micromanipulator. Gebruik vervolgens, terwijl je door een dissectiemicroscoop kijkt, rechte pincetten om de punt van de aangescherpte capillair te breken, zodat de binnendiameter van de gebroken punt ongeveer 10 tot 20 micron is. Bevestig vervolgens een dunne buis en een spuit aan het andere uiteinde van de capillairhouder, verbind de dunne buis en de spuit met een driewegklep en schuif de driewegklep open.
Duik vervolgens de spuit in om eventuele verontreinigingen te verdrijven en creëer een positieve druk in de capillaire buis. Herhaal dit een paar keer door de spuit los te koppelen en weer aan te sluiten op de driewegklep. Trek vervolgens lucht aan tot 100 tot 200 microliters voordat de spuit weer wordt aangesloten op de driewegklep.
Beweeg de micromanipulator met de glazen capillair naar de zijkant om schade tijdens de chirurgische procedure te voorkomen. Voordat je met de operatie begint, zorg ervoor dat de muis volledig verdoofd is door alle vier de ledematen te knijpen en de afwezigheid van een reactie te observeren. Gebruik vervolgens dissectiescharen om het haar aan de achterkant van het hoofd van de muis te knippen en bij te knippen van boven de ogen tussen de oren tot aan de onderkant van de nek.
Bevestig het hoofd van de muis met behulp van een stereotaxische frame muisadapter. Zorg ervoor dat het hoofd niet kan bewegen en stevig vastzit in de adapter door voorzichtig neer te drukken op het hoofd van de muis. Gebruik schaar en gebogen pincetten om door de muizenhuid te snijden over de achterkant van de nek en vervolgens door het midden van de schedel tussen de oren en ogen van de muis.
Trek de huid en het weefsel uit elkaar en uit het gebied boven de cisterna magna. Terwijl je door de dissectiemicroscoop kijkt, dissecteer voorzichtig de laatste dunne laagjes spier over de basis van de schedel met behulp van pincetten en beweeg deze spierlagen naar de zijkant en uit het gebied van belang. Zodra de dura over de cisterna magna is blootgelegd, gebruik een nat wattenstaafje om het membraan schoon te vegen en gebruik vervolgens een droog wattenstaafje om het gebied te drogen.
De cisterna magna ziet er driehoekig uit met een tot twee grote bloedvaten die door het gebied lopen. Aan welke kant dan ook van of tussen de bloedvaten is optimaal voor capillaire inbrenging en CSF-verzameling. Zodra de cisterna magna is blootgelegd, gebruik de micromanipulator om de glazen capillair uit te lijnen op de achterkant van het muizenhoofd zodat de aangescherpte punt net achter het membraan staat in een hoek van 30 tot 45 graden.
Duik vervolgens een keer of een paar keer met de spuit en beweeg vervolgens de zuiger terug 100 tot 200 microliters om ervoor te zorgen dat er geen verontreinigingen zijn en dat er negatieve druk in de glazen capillair is. Beweeg vervolgens de capillairpunt dichter naar het membraan totdat weerstand kan worden gezien, maar zonder het membraan te puncteren. Tik op de micromanipulator bediening om voorzichtig de capillairbuis door het membraan te tikken.
CSF zou automatisch in de capillairbuis moeten worden gezogen zodra de opening is gepuncteerd. Laat de capillair op zijn plaats om langzaam CSF te verzamelen. Als de CSF is gestopt met stromen, trek dan langzaam de spuit ongeveer 50 microliters op om meer negatieve druk in de capillair te creëren.
Tien tot vijftien microliters CSF wordt in 10 tot 30 minuten verzameld. Zodra het gewenste volume CSF is verzameld, sluit de buis door de driewegklep te sluiten en verwijder de spuit die op de buis is aangesloten. Open en sluit vervolgens de buis om een gelijkmatige druk te creëren in de capillair, de buis en het gebied buiten de capillair.
Verbind vervolgens de spuit weer en verwijder voorzichtig de glazen capillair uit de muis met behulp van micromanipulator. Plaats vervolgens de verzamelbuis met één microliter van 20X protease-remmer onder de aangescherpte punt van de glazen capillair. Open de buis en duik voorzichtig met de spuit.
Het CSF zou uit de capillair moeten stromen en in de verzamelbuis moeten vallen. Na verzameling, centrifugeer de CSF in pulsen om het monster te mengen met de protease-remmer op de bodem van de verzamelbuis. CSF-monsters kunnen worden gealiquoteerd en vervolgens worden opgeslagen voor verdere analyse bij min 80 graden Celsius.
CSF dat is verzameld uit APP/PS1-muizen vertoonde een significante toename in niveaus van menselijk A beta 42 op 12 maanden oud. Bij wilde muizen werd geen humaan A beta 42 gedetecteerd. Zodra de procedure is beheerst, kan deze in één uur worden uitgevoerd als deze correct wordt uitgevoerd.
Terwijl je deze procedure probeert, is het belangrijk om te onthouden om bloedvaten te vermijden bij het inbrengen van de capillair en om slechts kleine aanpassingen te maken met de micromanipulator tijdens de verzameling van CSF om besmetting met bloed te voorkomen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een verbeterde methode voor het verzamelen van cerebrospinale vloeistof (CSF) uit muizen met minimale bloedcontaminatie. Door gebruik te maken van een micromanipulator, verbetert deze techniek de zuiverheid en het volume van het monster, waardoor een betere analyse van biomarkers bij neurale ziekten mogelijk wordt.
Belangrijke onderzoekscomponenten
Wetenschappelijke sector
- Neurowetenschap
- Analyse van cerebrospinale vloeistof
- Onderzoek naar neurologische ziekten
Achtergrond
- CSF is essentieel voor het begrijpen van ziekten die de hersenen en het ruggenmerg aantasten.
- Besmetting door bloed tijdens het verzamelen kan onderzoeksresultaten compromitteren.
- Verbeterde verzamelmethoden kunnen de monsterintegriteit voor biomarkeranalyse verbeteren.
- Deze techniek is bedoeld om de studie van neurodegeneratieve aandoeningen te vergemakkelijken.
Doel van het onderzoek
- Om een betrouwbare methode te ontwikkelen voor het verzamelen van CSF uit muizen.
- Om bloedbesmetting tijdens het verzamelproces te minimaliseren.
- Om nauwkeuriger monitoring van biomarkers voor neurale ziekten mogelijk te maken.
Gebruikte methoden
- De methode maakt gebruik van een micromanipulator met een glazen capillair voor nauwkeurige CSF-verzameling uit de cisterna magna.
- Muizen worden goed verdoofd en chirurgische technieken worden toegepast om de cisterna magna bloot te leggen voor capillaire inbrenging.
- Er worden geen multiomics-workflows gerefereerd; de focus ligt op CSF-verzameling.
- De procedure kan met oefening in ongeveer een uur worden voltooid.
- CSF wordt na verzameling gemengd met een proteaseremmer voor conservering.
Belangrijkste resultaten
- De techniek maakt het mogelijk om 10 tot 15 microliters CSF binnen 10 tot 30 minuten te verzamelen.
- CSF verzameld uit APP/PS1-muizen vertoonde een significante toename van menselijke A beta 42-niveaus op 12 maanden.
- Er werd geen A beta 42 gedetecteerd in wild-type muizenmonsters.
- De efficiëntie van de procedure en het vermogen om bloedbesmetting te vermijden zijn succesvol aangetoond.
Conclusies
- Deze studie toont een effectieve methode aan voor het verkrijgen van CSF uit muizen met minimalisering van besmetting.
- De verbeterde zuiverheid en het volume van de verzamelde CSF kunnen de biomarkeranalyse in neurologisch onderzoek verbeteren.
- Het draagt bij aan een beter begrip van de cerebrospinale vloeistofdynamiek bij neurologische aandoeningen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Reliable cerebrospinal fluid (CSF) collection is essential for biomarker discovery in neurodegenerative disease research, where sample purity directly impacts data quality and target validation confidence. This method addresses a critical bottleneck in murine neuroscience workflows by enabling higher-yield, low-contamination CSF extraction, supporting more robust mechanistic de-risking of therapeutic hypotheses. Improved CSF accessibility enhances translational continuity from target identification to preclinical biomarker monitoring.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through biomarker analysis in a disease-relevant system with reduced mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Provides reproducible access to CSF for longitudinal monitoring of target engagement and pathway modulation.
- Predictive Value: Supports biomarker-based go/no-go decisions by improving confidence in target-related molecular changes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers purified CSF samples suitable for quantitative biomarker assays, enhancing screening reliability.
- Operational Value: Standardizes sample preparation, reducing variability in downstream analytical workflows.
- Scalability: Enables consistent CSF collection across cohorts, supporting assay validation and reproducibility.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports biomarker alignment from discovery through preclinical validation using disease-relevant models.
- Mechanistic De-risking: Allows monitoring of target biomarkers like human A beta 42 in APP/PS1 mice, strengthening predictive confidence.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables data-driven progression decisions based on detectable biomarker changes in neural disease models.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing a reliable upstream sample source for biomarker analysis, bridging target validation and lead optimization phases.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through biomarker measurement in CSF.
- Screening: Enables assay-ready sample generation with consistent volume and purity for compound evaluation.
- Analytics: Yields quantitative biomarker readouts (e.g., human A beta 42) that facilitate comparative analysis across conditions.
- Translational Research: Connects CSF biomarker dynamics to preclinical disease progression in genetic models.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, reusable capability for CSF collection across neuroscience discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation through cleaner, higher-volume biomarker data.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization of CSF collection across laboratories and studies.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by reducing failed experiments due to contaminated or insufficient samples.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on reliable biomarker fluctuations in preclinical models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgery and micromanipulator operation for precise capillary positioning.
- Dependent on dissection microscopy, stereotaxic framing, and fluid handling instrumentation.
- Necessitates cross-team standardization of surgical and collection protocols to ensure reproducibility.
- Adaptation to other models may require anatomical adjustments due to variations in cisterna magna accessibility.
- Practical limitations include dependence on operator skill and potential physiological variability in CSF yield.
