Twee-foton Calcium Imaging in neuronale Dendrites in hersenen plakjes
March 15th, 2018
Presenteren we een methode geheel-cel patch-clamp opnamen en twee-foton imaging om vast te leggen van Ca2 + transiënten in neuronale dendrites in acute hersenen segmenten combineren.
Het algemene doel van dit experiment is om calciumverhogingen in neuronale dendrieten te bestuderen in reactie op verschillende stimulatieparadigma's met behulp van whole-cell patch-clamp opnames in neuronale soma parallel aan twee-foton calciumbeeldvorming in dendrieten. Deze methode kan worden gebruikt om calciumsignalering in kleine dendritische compartimenten te monitoren, waardoor de processen die plaatsvinden in dendritische takken tijdens de integratie van synaptische input nauw kunnen worden waargenomen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het mogelijk maakt calciumsignaleringspatronen te observeren met hoge spatie-temporele resolutie en specificiteit.
Plaats de muizenhersenen op een petrischaal met continu geoxideerd, koud ACSF-sucrose. Om hippocampale plakjes van de geëxtraheerde hersenen te bereiden, laat de hersenen ongeveer twee minuten afkoelen. Plaats daarna een stuk filterpapier op een met ijs gevulde petrischaal en breng de hersenen over op het filterpapier.
Snij vervolgens de hersenen in twee hemisferen. Lijm de gesneden hemisferen op een vibratome snijplatform en dompel het in de snijlade gevuld met ijskoud geoxideerd ACSF-sucrose. Snijd vervolgens 300 micrometer dikke plakjes bij één graad Celsius met behulp van een vibratome koeler of plaats ijs rond de vibratomelade.
Gebruik een penseel om de plakjes met de hippocampus over te brengen naar een bad met geoxideerd ACSF-herstel opgewarmd tot 37 graden Celsius. In deze stap breng je een hippocampusplakje over naar een bad onder het objectief van een laser-scanning twee-foton microscoop. Perfuseer het bad continu met geoxideerd ACSF-normaal.
Gebruik vervolgens infrarood differentieel interferentiecontrastmicroscopie om een cel van belang te lokaliseren aan de hand van grootte, vorm en positie. Vul vervolgens een stimulerende pipet met een ACSF-normaal oplossing bevattend de rode fluorofoor. Laat het zakken op de plak zodat de punt zich in hetzelfde gebied bevindt als de cel van belang.
Vervolgens vul je de patch pipet met patchoplossing en bevestig je het aan de hoofdfase. Plaats het boven de plak zodat de punt zich direct boven de cel van belang bevindt. Plaats vervolgens een spuit in de drieweg stopkraan en verbind deze via een plastic buis met de patch pipet.
Injecteer constante positieve druk in de patch pipet en houd de stopkraan in gesloten positie. Open vervolgens het MultiClamp versterkerbesturingssoftwaremodule en schakel over naar Voltage Clamp modus door op de VC-knop te klikken. Open de elektrofysiologie Clampex data acquisitie software voor het opnemen van elektrofysiologische signalen en klik op het Membrane Test pictogram om een constante vierkante voltage puls te verzenden voor het monitoren van veranderingen in de pipetweerstand.
Laat vervolgens de patch pipet zakken tot het precies boven de doelcel staat. Bij contact met het celmembraan verwijder je de druk door de stopkraan in de open positie te draaien. Breng vervolgens een lichte negatieve druk aan op de patch pipet met behulp van een lege spuit in de stopkraan totdat de pipetweerstand een gigaohm bereikt.
In het Membrane Test venster van de data acquisitie software, klem de cel op negentig millivolt. Blijf negatieve druk toepassen totdat de pipetweerstand daalt en de whole-cell configuratie is bereikt. In de MultiClamp versterkerbesturingssoftwaremodule, stel de patch configuratie in op stroomklem door op de IC-knop te klikken en neem membraaneigenschappen op in reactie op somatische injecties van hyperpolariserende en depolariserende stromen.
Wacht minimaal 30 minuten totdat de cel gevuld is met de indicatoren aanwezig in de patchoplossing. Om afbeeldingen te verkrijgen, lokaliseer een dendriet van belang met behulp van het rode fluorescentiesignaal. Zorg voor een zichtbaar antwoord door een proximaal dendriet te kiezen die korter is dan 50 micrometer, omdat de efficiëntie van AP backpropagation aanzienlijk kan afnemen met afstand in GABAerge interneuronen, en schakel over naar de xt-modus.
Stel met behulp van de laserintensiteitregelaars de twee-foton laser op een minimaal vermogensniveau waar de baseline groene fluorescentie net iets zichtbaar is, om fototoxiciteit te voorkomen. Vervolgens, in de Clampex elektrofysiologie data acquisitie software Protocol venster en beeldacquisitiesoftware, creëer een opnameproef van de gewenste duur bevattend een somatische stroominjectie van de gewenste amplitude. Klik vervolgens op de Start Record knop en verwerf de fluorescentie continu gedurende één tot twee seconden.
Herhaal de beeldacquisitie drie tot 10 keer. Wacht minimaal 30 seconden tussen enkele scans om fotobeschadiging te voorkomen. Om dendritische calciumtransienten geïnduceerd door elektrische stimulatie op te nemen, lokaliseer een dendriet van belang met behulp van het rode fluorescentiesignaal.
Plaats de stimulerende pipet op het oppervlak van de plak boven de dendriet van belang. Laat de stimulatie pipet langzaam 10 tot 15 micrometer van de dendriet zakken, minimaliseer beweging om de whole-cell configuratie niet te verstoren. Om de locatie van synaptische microdomeinen in aspineuze neuronen te visualiseren, schakel in de beeldacquisitiesoftware naar de xt-modus en plaats de lijn langs de dendritische tak van belang.
In het Protocol venster, creëer een opnameproef die de stimulatie triggert. Gebruik de acquisitiesoftware om continu langs de dendriet te scannen gedurende één tot twee seconden. Herhaal de acquisitie drie tot vijf keer, wacht 30 seconden tussen scans om fotobeschadiging te voorkomen.
Om voorlopige informatie over de morfologie van de cel te verkrijgen en een record van de locatie van de stimulatie pipet te houden, verwerf een Z-stack van de cel in het rode kanaal. Gebruik de acquisitiesoftware in xyz-modus, stel de bovenste en onderste stapelgrenzen in om de hele cel met alle processen inbegrepen af te beelden. Stel vervolgens de stapgrootte op één micrometer en start de staplacquisitie met behulp van de Start Record knop.
Wanneer de Z-stack acquisitie voltooid is, gebruik de Maximum Projection optie in de software om alle focale plannen van de stack te superimposeren en de kwaliteit van de acquisitie te verifiëren. Trek vervolgens langzaam de patch pipet uit de plak. Om de plak te fixeren voor post hoc morfologische identificatie, verwijder snel de plak uit het bad met behulp van een penseel en plaats het
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie presenteert een methode die whole-cell patch-clamp opnames combineert met twee-foton beeldvorming om calciumtransienten in neuronale dendrieten te onderzoeken met behulp van acute herfsneden. De aanpak maakt het mogelijk om calciumsignalering in kleine dendritische compartimenten te monitoren, specifiek tijdens de integratie van synaptische inputs. De hoge spatie-temporelle resolutie staat gedetailleerde observatie van neuronale dynamica in reactie op verschillende stimulatieparadigma's toe.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Elektrofysiologie
- Beeldvormingstechnieken
Achtergrond
- Calciumsignalering speelt een cruciale rol in neuronale functie en synaptische integratie.
- Het begrijpen van calciumdynamica in dendrieten kan licht werpen op neuronale verwerking en plasticiteit.
- Whole-cell patch-clamp opnames staan nauwkeurige meting van spanning en stroom in neuronen toe.
- Twee-foton beeldvorming biedt de mogelijkheid om calciumdynamica met hoge resolutie te visualiseren.
Doel van de studie
- Om calciumverhoging in neuronale dendrieten te onderzoeken in reactie op verschillende stimulatieprotocollen.
- Om whole-cell patch-clamp en twee-foton beeldvorming gelijktijdig te gebruiken voor verbeterde observatie.
- Om gedetailleerde analyse van synaptische integratie in dendritische takken mogelijk te maken.
Gebruikte methoden
- Het platform gebruikt omvat acute herfsneden bereid uit muizenhippocampi.
- Whole-cell patch-clamp opnames worden uitgevoerd op neuronale soma terwijl twee-foton calciumbeeldvorming zich richt op dendritische compartimenten.
- Kritieke stappen omvatten de voorbereiding van de herfsneden, het vestigen van de whole-cell configuratie, en sequentiële beeldacquisities.
- De methodologie benadrukt het behoud van celintegriteit en minimalisering van fotoschade tijdens beeldvorming.
Belangrijkste resultaten
- De methode maakte hoge-resolutie observatie van calciumtransienten mogelijk in reactie op elektrische stimulatie.
- Belangrijke bevindingen omvatten de demonstratie van differentiële calciumsignaleringpatronen in dendritische takken.
- Deze techniek onthulde inzichten in synaptische integratie en dendritische compartimentalisatie.
Conclusies
- Deze studie demonstreert een krachtige aanpak om calciumdynamica in neuronale dendrieten te monitoren.
- De bevindingen versterken het begrip van synaptische integratieprocessen op dendritisch niveau.
- De methodologie heeft bredere implicaties voor het bestuderen van neuronale plasticiteit en andere calcium-afhankelijke mechanismen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Monitoring calcium signaling in neuronal dendrites provides mechanistic insights into synaptic integration and plasticity, which are critical for target validation in CNS drug discovery. The ability to resolve spatiotemporal dynamics in subcellular compartments supports de-risking of therapeutic hypotheses by linking molecular targets to functional neuronal outputs. This approach enhances predictive confidence in early discovery by enabling direct observation of target engagement effects on dendritic excitability and signal processing.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by linking target modulation to dendritic calcium signaling patterns in GABAergic interneurons.
- Operational Value: Provides high-resolution functional readouts that clarify pathway involvement and reduce mechanistic ambiguity in target validation.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by revealing whether compounds induce expected subcellular signaling responses in disease-relevant neuronal systems.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Combines electrophysiological confirmation of neuronal health with imaging-ready dendritic compartments for reliable compound screening.
- Quantitative Output: Generates spatially resolved calcium transient amplitudes and kinetics as measurable endpoints for dose-response analysis.
- Reproducibility: Standardized slice preparation and imaging parameters enable cross-run consistency essential for assay validation.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Applicable to studying dendritic signaling in inhibitory interneurons implicated in epilepsy, schizophrenia, and cognitive disorders.
- Translational Continuity: Bridges in vitro findings to preclinical models by preserving native dendritic architecture and synaptic physiology in acute brain slices.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether target engagement produces expected subcellular signaling changes before advancing to in vivo efficacy studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification, providing functional validation of target modulation in neuronal dendrites prior to phenotypic screening campaigns.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by revealing how target modulation alters calcium signaling dynamics in dendritic branches during synaptic integration.
- Screening: Enables assay development with quantitative, spatially resolved calcium readouts that distinguish compound effects across dendritic compartments.
- Analytics: Delivers high-resolution temporal and spatial calcium flux measurements that allow comparison of stimulation paradigms and drug-induced changes.
- Translational Research: Maintains physiological relevance through acute brain slice preparation, supporting continuity to preclinical validation of target effects on dendritic function.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for evaluating multiple targets across neuronal types using standardized electrophysiology-imaging integration.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by directly observing target-mediated changes in dendritic calcium signaling linked to synaptic plasticity.
- Operational Value: Standardizes dual-modality readouts (electrophysiology + imaging) for consistent, reproducible data generation across projects.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early functional validation of target engagement in subcellular neuronal compartments.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on whether compounds produce expected dendritic signaling profiles in disease-relevant interneurons.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electrophysiology, two-photon microscopy, and fluorescent calcium indicator handling.
- Dependent on laser-scanning two-photon microscope, patch-clamp amplifier, and perfusion system for slice viability.
- Necessitates standardization of slice preparation, imaging depth, and stimulation parameters across users and sites.
- Adaptation to different neuronal types may require optimization of dendritic targeting and indicator loading efficiency.
- Practical limitations include photodamage risk during prolonged imaging and technical challenge of maintaining whole-cell configuration in fine dendrites.
