Name: Kwantitatieve meting van de γ-Secretase-gemedieerde amyloïde Precursor proteïne en Notch decollete in cel-gebaseerde Luciferase verslaggever Assay platformen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Leer hoe je γ-secretase-activiteit kwantitatief meet met luciferase-reporterassays in gekweekte cellen. Deze methode helpt bij het identificeren van nieuwe modulatoren voor Alzheimer-onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs bedanken de faciliteit van de kern van het Instituut voor cellulaire en Organismic biologie, Academia Sinica, voor technische ondersteuning. Deze studie werd ondersteund door het ministerie van wetenschap en technologie, Taiwan (meest 103-2320-B-001-016-MY3 aan Y.-F. L.), het programma voor translationeel innovatie van biofarmaceutische ontwikkeling-technologie ter ondersteuning van Platform as in Scheme (NP7 aan Y.-F.L.), en de Academia Sinica (aan Y.-F.L.).

1. meting van de Luciferase verslaggever signalen, die met de splitsing van de γ-Secretase van APP-C99 of NΔE corresponderen
Opmerking: Raadpleeg de eerdere publicaties voor meer gedetailleerde beschrijvingen van de generatie van CG en NG cellen20,21.
<ol><li>
Zaad NG of CG cellen (20, 000 cellen/well) op 96-Wells microplates op een eindvolume van 200 μl per putje in groeimedium dat is samengesteld uit Dulbecco van bewerkt Eagle Medium (DMEM), vermeerderd met 10% foetale runderserum (FBS), 5 μg/mL blasticidin, 250 μg/mL antibiotica (b.v. zeocin), en 200 μg/mL hygromycin B.
	<ol>
<li>Cellen tellen met een hemocytometer.</li>
		<li>De microplates overbrengen in een bevochtigde CO2 incubator en Incubeer bij 37 ° C's nachts.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verwijder 100 μl van groeimedium uit elk putje.</li>
	<li>Voeg 100 μl per putje van groei medium met 2 μg/mL tetracycline met ofwel 0,2% dimethylsulfoxide (DMSO), 2 μM CL-387,785, 2 μM N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butylester (DAPT) of andere gerelateerde ErbB1/ErbB2-remmers.</li>
	<li>Incubeer behandelde CG of NG cellen in microplates bij 37 ° C gedurende 24 uur.</li>
	<li>150 μl per putje groeimedium uit de microplates verwijderen.</li>
	<li>Voeg 50 μl per putje luciferase assay reagens toe (Zie Tabel van materialen).</li>
	<li>
De microplates overbrengen in een luminescentie microplate lezer.
	<ol>
<li>Het handhaven van de microplates bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten met zachte agitatie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bepalen van de Firefly luciferase (FL)-uitgestoten luminescentie met behulp van een vooraf gedefinieerde programma in de luminescentie microplate lezer zijn opgeslagen.
	<ol>
<li>Open de software van de controle van het instrument (Zie Tabel van materialen voor instrument details).</li>
		<li>Selecteer in het menu 'Tool', 'Luminometry'.<ol>
<li>Kies 'Geen filter' voor emissie Filter, teek 'normaal' voor emissie diafragma, voer '1' voor tellen keer onder de instellingen 'Parameters' en klik op 'OK' om de luminescentie lezing instellen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Onder het tabblad 'Instrument beheer' en blader door de lijst met actieve protocollen en selecteer het vooraf opgeslagen protocol voor het lezen van luminescentie.</li>
		<li>Onder het tabblad 'Live weergave' definiëren de omvang van de pull-down lijst en selecteer 'Logaritme' of 'Lineaire' voor het Type.</li>
		<li>Schakel onder het tabblad 'Temperatuur' 'Off' voor plaat Verwarming.</li>
		<li>Klik op de knop 'Start' voor het uitvoeren van de luminescentie lezen.</li>
		<li>Desgewenst resultaten exporteren in een werkbladindeling te zetten m.b.v. de 'Verkenner' ingebed in de besturingssoftware.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. kwantificering van γ-Secretase activiteit
<ol><li>
Definieer een luminescentie signaal dat wordt uitgezonden door CG of NG cellen behandeld met 0,1% DMSO in groeimedium met 1 μg/mL tetracycline alleen als 100% relatieve γ-secretase activiteit.
	<ol>
<li>Schatting achtergrond luminescentie van CG of NG cellen door het behandelen van cellen met groeimedium dat niet de tetracycline omvat.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Normaliseren luciferase signalen van CG of NG cellen die worden gekweekt met groeimedium dat 1 μg/mL tetracycline en beide 1 μM CL-387,785 of 1 μM van DAPT met het luciferase signaal uitgezonden door CG DMSO-behandeld of NG cellen (100% relatieve γ-secretase activiteit, als gedefinieerd in punt 2.1).</li>
</ol>

<ol><li>Selkoe, D. J., Hardy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amyloid+hypothesis+of+Alzheimer%27s+disease+at+25+years%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease at 25 years.</a> EMBO Mol Med. 8 (6), 595-608 (2016).</li>
<li>Wolfe, M. S., Guenette, S. Y. <a target="_blank" href="http://jcs.biologists.org/content/120/18/3157">APP at a glance.</a> J Cell Sci. 120 (Pt 18), 3157-3161 (2007).</li>
<li>Karran, E., Mercken, M., De Strooper, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amyloid+cascade+hypothesis+for+Alzheimer%27s+disease%3A+an+appraisal+for+the+development+of+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">The amyloid cascade hypothesis for Alzheimer's disease: an appraisal for the development of therapeutics.</a> Nat Rev Drug Discov. 10 (9), 698-712 (2011).</li>
<li>Citron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer%27s+disease%3A+strategies+for+disease+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Alzheimer's disease: strategies for disease modification.</a> Nat Rev Drug Discov. 9 (5), 387-398 (2010).</li>
<li>Vassar, R., Kovacs, D. M., Yan, R., Wong, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+beta-secretase+enzyme+BACE+in+health+and+Alzheimer%27s+disease%3A+regulation%2C+cell+biology%2C+function%2C+and+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The beta-secretase enzyme BACE in health and Alzheimer's disease: regulation, cell biology, function, and therapeutic potential.</a> J Neurosci. 29 (41), 12787-12794 (2009).</li>
<li>Parks, A. L., Curtis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presenilin+diversifies+its+portfolio%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Presenilin diversifies its portfolio.</a> Trends Genet. 23 (3), 140-150 (2007).</li>
<li>Kukar, T. L., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18548070">Substrate-targeting gamma-secretase modulators.</a> Nature. 453 (7197), 925-929 (2008).</li>
<li>Kounnas, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+gamma-secretase+reduces+beta-amyloid+deposition+in+a+transgenic+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Modulation of gamma-secretase reduces beta-amyloid deposition in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease.</a> Neuron. 67 (5), 769-780 (2010).</li>
<li>Thathiah, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+orphan+G+protein-coupled+receptor+3+modulates+amyloid-beta+peptide+generation+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The orphan G protein-coupled receptor 3 modulates amyloid-beta peptide generation in neurons.</a> Science. 323 (5916), 946-951 (2009).</li>
<li>Flajolet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Alzheimer%27s+disease+amyloid-beta+formation+by+casein+kinase+I%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Regulation of Alzheimer's disease amyloid-beta formation by casein kinase I.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (10), 4159-4164 (2007).</li>
<li>Eisele, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gleevec+increases+levels+of+the+amyloid+precursor+protein+intracellular+domain+and+of+the+amyloid-beta+degrading+enzyme+neprilysin%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Gleevec increases levels of the amyloid precursor protein intracellular domain and of the amyloid-beta degrading enzyme neprilysin.</a> Mol Biol Cell. 18 (9), 3591-3600 (2007).</li>
<li>He, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma-secretase+activating+protein+is+a+therapeutic+target+for+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Gamma-secretase activating protein is a therapeutic target for Alzheimer's disease.</a> Nature. 467 (7311), 95-98 (2010).</li>
<li>Haapasalo, A., Kovacs, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+many+substrates+of+presenilin%2Fgamma-secretase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Alzheimers+Dis%22%5BJournal%5D)">The many substrates of presenilin/gamma-secretase.</a> J Alzheimers Dis. 25 (1), 3-28 (2011).</li>
<li>Gillman, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+and+Evaluation+of+BMS-708163%2C+a+Potent%2C+Selective+and+Orally+Bioavailable+gamma-Secretase+Inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Med+Chem+Lett%22%5BJournal%5D)">Discovery and Evaluation of BMS-708163, a Potent, Selective and Orally Bioavailable gamma-Secretase Inhibitor.</a> ACS Med Chem Lett. 1 (3), 120-124 (2010).</li>
<li>Hopkins, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ACS+chemical+neuroscience+molecule+spotlight+on+Begacestat+%28GSI-953%29%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Neurosci%22%5BJournal%5D)">ACS chemical neuroscience molecule spotlight on Begacestat (GSI-953).</a> ACS Chem Neurosci. 3 (1), 3-4 (2012).</li>
<li>Yang, T., Arslanova, D., Gu, Y., Augelli-Szafran, C., Xia, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+gamma-secretase+modulation+differentiates+inhibitor+compound+selectivity+between+two+substrates+Notch+and+amyloid+precursor+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Brain%22%5BJournal%5D)">Quantification of gamma-secretase modulation differentiates inhibitor compound selectivity between two substrates Notch and amyloid precursor protein.</a> Mol Brain. 1, 15(2008).</li>
<li>McKee, T. D., Loureiro, R. M., Dumin, J. A., Zarayskiy, V., Tate, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+cell-based+method+for+determining+the+gamma-secretase+enzyme+activity+against+both+Notch+and+APP+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">An improved cell-based method for determining the gamma-secretase enzyme activity against both Notch and APP substrates.</a> J Neurosci Methods. 213 (1), 14-21 (2013).</li>
<li>Basi, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+precursor+protein+selective+gamma-secretase+inhibitors+for+treatment+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimers+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Amyloid precursor protein selective gamma-secretase inhibitors for treatment of Alzheimer's disease.</a> Alzheimers Res Ther. 2 (6), 36(2010).</li>
<li>Liao, Y. F., Tang, Y. C., Chang, M. Y., Wang, B. J., Hu, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+small+molecular+%28D%29-leucinamides+as+potent%2C+Notch-sparing+gamma-secretase+modulators%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Discovery of small molecular (D)-leucinamides as potent, Notch-sparing gamma-secretase modulators.</a> Eur J Med Chem. 79, 143-151 (2014).</li>
<li>Liao, Y. F., Wang, B. J., Cheng, H. T., Kuo, L. H., Wolfe, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor-alpha%2C+interleukin-1beta%2C+and+interferon-gamma+stimulate+gamma-secretase-mediated+cleavage+of+amyloid+precursor+protein+through+a+JNK-dependent+MAPK+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor-alpha, interleukin-1beta, and interferon-gamma stimulate gamma-secretase-mediated cleavage of amyloid precursor protein through a JNK-dependent MAPK pathway.</a> J Biol Chem. 279 (47), 49523-49532 (2004).</li>
<li>Wang, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ErbB2+regulates+autophagic+flux+to+modulate+the+proteostasis+of+APP-CTFs+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">ErbB2 regulates autophagic flux to modulate the proteostasis of APP-CTFs in Alzheimer's disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (15), E3129-E3138 (2017).</li>
<li>Sevigny, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antibody+aducanumab+reduces+Abeta+plaques+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The antibody aducanumab reduces Abeta plaques in Alzheimer's disease.</a> Nature. 537 (7618), 50-56 (2016).</li>
<li>Golde, T. E., Koo, E. H., Felsenstein, K. M., Osborne, B. A., Miele, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gamma-Secretase+inhibitors+and+modulators%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">gamma-Secretase inhibitors and modulators.</a> Biochim Biophys Acta. 1828 (12), 2898-2907 (2013).</li>
<li>Coric, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Prodromal+Alzheimer+Disease+With+Avagacestat%3A+A+Randomized+Clinical+Trial%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Neurol%22%5BJournal%5D)">Targeting Prodromal Alzheimer Disease With Avagacestat: A Randomized Clinical Trial.</a> JAMA Neurol. 72 (11), 1324-1333 (2015).</li>
<li>Mitani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+between+gamma-secretase+inhibitors+and+modulators+on+cognitive+function+in+amyloid+precursor+protein-transgenic+and+nontransgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential effects between gamma-secretase inhibitors and modulators on cognitive function in amyloid precursor protein-transgenic and nontransgenic mice.</a> J Neurosci. 32 (6), 2037-2050 (2012).</li>
<li>Penninkilampi, R., Brothers, H. M., Eslick, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+Agents+Targeting+gamma-Secretase+Increase+Risk+of+Cancer+and+Cognitive+Decline+in+Alzheimer%27s+Disease+Patients%3A+A+Systematic+Review+and+Meta-Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Alzheimers+Dis%22%5BJournal%5D)">Pharmacological Agents Targeting gamma-Secretase Increase Risk of Cancer and Cognitive Decline in Alzheimer's Disease Patients: A Systematic Review and Meta-Analysis.</a> J Alzheimers Dis. 53 (4), 1395-1404 (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De veelbelovende resultaten van een fase 1b trial van aducanumab immunotherapie voor AD de kritische rol van Aβ hebben verankerd in de pathogenese van AD22 en suggereren dat anti-Aβ benaderingen nog steeds een levensvatbare strategie voor de ontwikkeling van anti-van de AD geneesmiddelen. We beschrijven hier, cel-gebaseerde testen voor het kwantificeren van de γ-secretase-gekatalyseerde proteolyse van APP-C99 en NΔE met behulp van firefly luciferase verslaggever systemen. APP-C99 en NΔE zijn de tw...

Oligomere vormen van amyloid-β (Aβ) worden verondersteld te zijn de primaire oorzaak van neurodegeneratie in de hersenen van patiënten die lijden aan de ziekte van Alzheimer (AD)1. Aβ peptides worden geproduceerd door de stapsgewijze splitsing van amyloïde precursor eiwit (APP), eerst door β-secretase, en vervolgens door γ-secretase2. In het afgelopen decennium, hebben therapeutische benaderingen naar behandeling van advertentie gericht op de preventie van Aβ productie3. De meerderheid van de studies hebben gericht op ofwel de vergroting van α-secretase activiteit, die kan beletsel γ-secretase splitsing van APP en daardoor verminderen de productie van Aβ of de remming van β-en/of γ-secretase activiteiten4. Helaas, niet-selectieve inhibitie van β - of γ-secretases resultaten in onvermijdelijk bijwerkingen zijn die als gevolg van interferentie met de werking van andere fysiologische substraten voor β - en γ-secretase5,6. Ten aanzien van de γ-secretase-remmers, hebben recente studies gerapporteerd de ontdekking van een aantal chemische en genetische modulatoren die Aβ productie regelen kan filtreerpapier te verwaarlozen effecten op de essentiële γ-secretase-gemedieerde verwerking van Inkeping7 ,8,9,10,11,12, echter succesvol therapeutics zijn nog niet ontwikkeld. Dus zijn verdere systematische schermen gerechtvaardigd om te ontdekken van nieuwe genetische en chemische parameters die selectief γ-secretase-gemedieerde APP verwerking moduleren kunnen.
Γ-Secretase is bekend dat het klieven van meer dan 90 verschillende membraan-verankerd eiwitten. Onder deze substraten is Notch, waarvan de activiteit is van cruciaal belang voor de cel lot vastberadenheid en differentiatie tijdens ontwikkeling13. Selectief modulerende γ-secretase-gekatalyseerde APP verwerking in de afwezigheid van invloed zijn op de inkeping verwerking essentieel voor minimaliseren Notch-gerelateerde bijwerkingen van γ-secretase-remmers, en deze selectiviteit wordt beschouwd als een primaire factor die zal dicteren van de biologische werkzaamheid van potentiële γ-secretase modulatoren voor de chronische behandeling van AD. Er zijn een aantal arylsulfonamide derivaten, zoals GSI-953 (begacestat) en BMS-708163 (avagacestat), die zijn gevonden om te exposeren krachtige en selectieve remming van de γ-secretase14,15. Een eerdere studie heeft aangetoond dat de differentiële remming van de γ-secretase splitsing van APP en Notch kan worden waargenomen met behulp van een kwantitatieve ELISA gebaseerde bepaling in combinatie met in vivo validatie met behulp van de zebravis16. Bovendien zijn assay cel-gebaseerde paradigma's vastgesteld om aan te pakken van de potentiële substraat selectiviteit van γ-secretase naar APP en Notch17,18. Met behulp van protocollen vergelijkbaar met die beschreven hierin, we hebben onlangs ontdekt een nieuwe klasse van (D)-leucinamides die krachtig γ-secretase splitsing van APP met inkeping-sparend selectiviteit19 moduleren. Samen, biedt deze collectie van studies een bewijs-van-concept ter ondersteuning van het idee dat het substraat selectiviteit en beschikbaarheid van γ-secretase onderworpen aan chemische modulatie en experimentele verificatie worden kan. Echter, deze assay platformen vaak rekenen op relatief lage-doorvoer uitlezingen en arbeidsintensieve benaderingen die mogelijk niet voldoen aan industriële normen voor de drug discovery-programma's.
We hebben recentelijk gegenereerde cel-gebaseerde luciferase reporter gene assays die kwantitatief bepalend kunnen zijn voor de katalytische activiteit van γ-secretase naar twee verschillende substraten, de 99-amino acid C-terminal fragment van APP (APP-C99) en de extracellulaire domein-verwijderd Notch peptide (NΔE). Zowel de NΔE als de APP-C99 hebben wijd gebruikt als directe substraten voor γ-secretase in verschillende testen. Voor het genereren van homogene en consistente luciferase reporter gene assays voor de splitsing van de γ-secretase van APP-C99 of NΔE, we genereerden een HEK afkomstige stabiele cellijn (CG) die constitutively een Gal4 promotor gestuurde firefly luciferase verslaggever (uitdrukt Gal4-Luc) en Gal4/VP16-gelabeld APP-C99 fusieproteïne (C99-GV). Bovendien, we genereerden een ander HEK afkomstige stabiele cellijn (NG) die constitutively Gal4-Luc en Gal4/VP16-gelabeld NΔE (NΔE-GV uitdrukt). Met behulp van deze roman substraat-specifieke γ-secretase-tests, bieden we nu een methode om te kwantificeren en te onderscheiden van de katalytische activiteit van γ-secretase naar verschillende substraten (APP-C99 in CG cellen) of NΔE in NG cellen. Bovendien waren de substraat-specifieke γ-secretase-tests ontworpen om dat bevorderlijk is voor hoge-content screening platformen. Deze tests nieuw gegenereerde γ-secretase zou de weg vrij voor de ontdekking van nieuwe γ-secretase modulatoren, die zouden kunnen cognitieve functie verbeteren door het onderdrukken van Aβ productie zonder aanleiding kunnen geven tot ongewenste remming van de inkeping voor de behandeling van de volgende generatie van advertentie.

<table><tbody><tr><td>VictorLight luminescentie plaatlezer</td><td>PerkinElmer</td><td>2030-0010</td><td></td></tr><tr><td>Klasse II, Type 2 Biologische Veiligheidscabinet</td><td>Thermo Scientific</td><td>1300 Series A2</td><td></td></tr><tr><td>CL-387,785</td><td>EMD Calbiochem</td><td>233100-1MG</td><td></td></tr><tr><td>DAPT</td><td>Merck</td><td>565770</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s Gemodificeerd Eagle Medium (DMEM)</td><td>Thermo Fisher</td><td>12100046</td><td>belangrijkste component van groeimedium</td></tr><tr><td>Foetaal bovien serum (FBS)</td><td>Thermo Fisher</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidin</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1113903</td><td></td></tr><tr><td>Zeocin</td><td>Thermo Fisher</td><td>R25005</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin B</td><td>Gibco</td><td>10687010</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytomer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR717805 Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>96-wells microplaat</td><td>Nunc</td><td>156545</td><td></td></tr><tr><td>Tetracycline</td><td>Sigma</td><td>T7660</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfaat (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Steady-Glo luciferase assay reagens</td><td>Promega</td><td>E2510</td><td></td></tr><tr><td>Bevochtigde CO2 incubator</td><td>Revco</td><td>Ultima II</td><td></td></tr><tr><td>T-REx293 cellijn</td><td>Invitrogen</td><td>R71007</td><td></td></tr><tr><td>Wallac 1420 software versie 3.0</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>instrument controle software van de luminescentie plaatlezer</td></tr></tbody></table>

kwantitatieve meting van de γ-secretase-gemedieerde amyloïde precursor proteïne en notch decollete in cel-gebaseerde luciferase verslaggever assay platformen

Quantitative Measurement of &#947;-Secretase-mediated Amyloid Precursor Protein and Notch Cleavage in Cell-based Luciferase Reporter Assay Platforms

We hebben een paar van cel-gebaseerde reporter gene assays voor het kwantitatief meten van γ-secretase splitsing van verschillende substraten ontwikkeld. Dit manuscript worden procedures beschreven die kunnen worden gebruikt om te controleren γ-secretase-gemedieerde splitsing van APP-C99 of Inkeping, met behulp van een Gal4 promotor gestuurde firefly luciferase verslaggever systeem. Deze testen werden opgericht door stabiel transfecting mede HEK293 cellen met het Gal4-gedreven luciferase verslaggever gen en ofwel het C-terminal Gal4/VP16-gelabeld fragment van APP (APP-C99; CG-cellen), of de Gal4/VP16-gelabeld Notch-ΔE (NΔE; NG cellen). Met behulp van deze verslaggever assays parallel, we hebben aangetoond dat een ErbB2-remmer, CL-387,785, bij voorkeur γ-secretase splitsing van APP-C99 in CG cellen, maar niet NΔE in NG cellen kunt onderdrukken. De differentiële reacties tentoongesteld door de CG en NG cellen, wanneer behandeld met CL-387,785, vertegenwoordigen een voorkeur kenmerkend voor γ-secretase modulatoren, en deze antwoorden staan in schril contrast tot de pan-remming van de γ-secretase geïnduceerd door DAPT. Ons onderzoek levert direct bewijs dat γ-secretase activiteiten naar verschillende ondergronden kunnen worden onderscheiden in een cellulaire context. Deze nieuwe testen kunnen dus nuttige hulpmiddelen in drugontdekking voor verbeterde AD therapieën.

Remming van ErbB2 door CL-387,785 kan de verwerking van APP-C99 door differentieel bevorderen Γ -secretase zonder Notch decollete Om vast te stellen een cel-gebaseerde test die kwantitatief het Proteolytische splijten van een bijzonder γ-secretase substraat kan meten, we genereerden de HEK293 afkomstige CG cellijn door stabiele CO transfectie van een tetracycline-afleidbare C-terminaal Gal4/VP16-gelabeld APP-C99 en een Gal4 promotor ge...

We hebben met succes twee substraat-specifieke γ-secretase tests gegenereerd. Zowel cel-gebaseerde testen hier gepresenteerd zijn ontworpen om het kwantificeren van de enzymatische activiteiten γ-secretase via de uitgang van firefly luciferase verslaggevers.

Kwantitatieve meting van de γ-Secretase-gemedieerde amyloïde Precursor proteïne en Notch decollete in cel-gebaseerde Luciferase verslaggever Assay platformen

We have developed a pair of cell-based reporter gene assays to quantitatively measure &#947;-secretase cleavage of distinct substrates. This manuscript ...

Het algemene doel van deze kwantitatieve cel-gebaseerde reportergen-test voor gamma-secretase is om het differentiële effect van vermeende gamma-secretase modulatoren op gamma-secretase-gemedieerde splitsing te onderzoeken. Deze methode kan helpen om de belangrijkste vragen in het veld van de ziekte van Alzheimer te beantwoorden, zoals de identificatie van nieuwe gamma-secretase modulatoren voor de behandeling van de ziekte van Alzheimer. Het voordeel van deze techniek is dat het een zeer efficiënt testsysteem is, en het kan gemakkelijk gamma-secretase modulatoren identificeren.De implicatie van deze techniek strekt zich uit tot de therapie van de ziekte van Alzheimer door de potentiële ontdekking van anti-AD medicijnen met minimale bijwerkingen. Deze methode kan inzicht geven in de substraatselectiviteit van gamma-secretase. Het kan ook worden toegepast op de studies van andere ziekten, zoals neuroblastoom.Personen die nieuw zijn bij deze methode kunnen worstelen met het voorzichtig verwijderen en toevoegen van celkweekmedium aan 96 microplaten, omdat te veel verstoring de uiteindelijke resultaten kan bemoeilijken. Begin deze procedure met de bereiding van NG en CG cellen, zoals vermeld in het tekstprotocol. Tel NG of CG cellen met een hemocytometer.Zaai vervolgens de cellen op 20.000 cellen per putje op 96-well microplaten op een uiteindelijk volume van 200 microliter per putje in groeimedium. Breng de microplaten over naar een bevochtigde koolstofdioxide-incubator en incubeer ze overnacht bij 37 graden Celsius. Na overnachte incubatie, verwijder 100 microliter groeimedium uit elke put.Voeg 100 microliter per putje van groeimedium toe met twee microgram per milliliter tetracycline met ofwel 0,2% dimethyl sulfaat, twee micromolair CL-387, 785, twee micromolair DAPT of andere gerelateerde ErbB1/ErbB2-remmers. Incubeer de behandelde cellen en microplaten gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius. Na incubatie, verwijder 150 microliter per putje van groeimedium van de microplaten.Voeg vervolgens 50 microliter per putje van luciferine assay reagens toe. Breng vervolgens de microplaten over naar een luminescentie microplate reader en houd ze vijf minuten op kamertemperatuur. Bepaal de door vuurvliegjes uitgezonden luminescentie met behulp van een vooraf gedefinieerd programma dat is opgeslagen in de luminescentie microplate reader.Open eerst de instrumentbesturingssoftware. Selecteer vervolgens uit het menu Gereedschap Luminometrie. Kies onder de Instellingen van Parameters Geen Filter voor emissiefilter, vink Normaal aan voor emissieopening, voer één in voor de teltijd en klik op OK om de luminescentiemeting in te stellen.Scroll onder het tabblad Instrumentbesturing door de lijst met actieve protocollen en selecteer het vooraf opgeslagen protocol voor het lezen van luminescentie. Definieer onder het tabblad Live weergave de schaal uit het vervolgkeuzemenu en selecteer Logaritmisch of Lineair voor het type. Selecteer onder het tabblad Temperatuur Uit voor het verwarmen van de plaat.Klik ten slotte op de Start-knop om de luminescentiemeting uit te voeren. Exporteer de resultaten naar een spreadsheetformaat met behulp van de Explorer die is ingesloten in de besturingssoftware. Schat de achtergrondluminescentie van CG of NG cellen behandeld met groeimedium dat geen tetracycline bevat.Definieer een luminescentiesignaal uitgezonden door CG of NG cellen behandeld met 0,1%DMSO in groeimedium bevattend één microgram per milliliter tetracycline alleen als 100% relatieve gamma-secretase activiteit. Normaliseer ten slotte de luciferine signalen van CG of NG cellen die worden gekweekt met groeimedium bevattend tetracycline en ofwel CL-387, 785 of DAPT naar het luciferine signaal uitgezonden door DMSO-behandelde CG of NG cellen. Hier getoond zijn representatieve resultaten die de kwantitatieve metingen van gamma-secretase splitsing van APP-C99 in de CG cellen demonstreren.Cellen werden behandeld met één micromolair van CL-387, 785 of DAPT in aanwezigheid van één microgram per milliliter tetracycline bij 37 graden Celsius gedurende 24 uur. De luminescentie afgeleid van gamma-secretase-gemedieerde proteolyse van C99-GV werd gekwantificeerd na de toevoeging van 100 microliter per putje van luciferine assay reagens. De luciferine signaal uitgezonden door cellen behandeld met voertuig alleen werd ingesteld op 100% relatieve luminescentie.Representatieve resultaten die de kwantitatieve metingen van gamma-secretase splitsing van N-delta-E in de NG cellen demonstreren, worden hier getoond. Evenzo werden cellen behandeld met één micromolair van CL-387, 785 of DAPT in aanwezigheid van één microgram per milliliter tetracycline bij 37 graden Celsius gedurende 24 uur. De luminescentie afgeleid van gamma-secretase-gemedieerde proteolyse van N-delta-E-GV werd gekwantificeerd na de toevoeging van 100 microliter per putje van luciferine assay reagens.De luciferine signaal uitgezonden door cellen behandeld met voertuig alleen werd ingesteld op 100% relatieve luminescentie. Eenmaal onder de knie, vereist deze techniek slechts een hands-on tijd van één tot twee uur, afhankelijk van het aantal te onderzoeken stoffen. Na de ontwikkeling ervan, heeft deze techniek de weg gebaand voor de onderzoeker in het veld van de ziekte van Alzheimer om genetische en chemische modificatoren van gamma-secretase te verkennen op zoek naar nieuwe therapeutische mogelijkheden voor de ziekte van Alzheimer.

quantitative-measurement-secretase-mediated-amyloid-precursor-protein

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

This video demonstrates the procedure of measuring γ-secretase activity in genetically modified human cells using a tetracycline-inducible system. The process involves inducing APP gene expression with tetracycline, generating amyloid-β peptides, and activating luciferase production. The bioluminescence resulting from the luciferase-substrate reaction is then measured, reflecting γ-secretase activity.

Luciferase Assay for Measuring &#947;-Secretase Activity in Human Cells

Het bereiken van een systeemniveau begrip van cellulaire processen is een doel van de hedendaagse celbiologie. We beschrijven hier strategieën voor multiplexing luciferase reporters van verschillende cellulaire functie eindpunten naar gen-functie met behulp van genoom-schaal RNAi bibliotheken ondervragen.

Een Multiplexed Luciferase-gebaseerde screening Platform voor ondervragen Kanker-geassocieerde signaaltransductie in gekweekte cellen

De overdracht van eiwitaggregaten, of proteopathische zaden, van cel tot cel kan ten grondslag liggen aan de progressie van pathologie in neurodegeneratieve ziekten. Hier wordt een nieuwe FRET-flowcytometrische assay beschreven die een specifieke en gevoelige detectie van zaaiactiviteit uit recombinante of biologische monsters mogelijk maakt.

Gevoelige detectie van Proteopathic Zaaien activiteit met FRET flowcytometrie

Dit rapport beschrijft protocollen voor het meten van degradatiesnelheden van verkeerd gevouwen eiwitten door middel van western blot of fluorescentie-gebaseerde assays. De methoden kunnen worden toegepast op de analyse van andere verkeerd gevouwen eiwitten en voor high-throughput screening.

Assays voor de afbraak van Misfolded Eiwitten in Cellen

Beschrijven we een methode om te kwantificeren van de samenvoeging van misfolded eiwitten. Onze gegevens-protocol lentivirale geïnduceerde stabiele cel lijn generatie, geautomatiseerde confocal beeldvorming en beeldanalyse van eiwit-aggregaten. Als een illustratieve toepassing onderzocht we het effect van kleine molecules biij SOD1 aggregatie op een tijd - en dosis-afhankelijke manier.

Assay ontwikkeling voor hoge inhoud kwantificering van Sod1 Mutant eiwit statistische vorming in levende cellen

Er is een vraag om preklinische testen voor een nieuwe klasse van "Wees" drugs genoemd farmacologische chaperones reproduceerbaar, snel en efficiënt. Voor patiënten die in aanmerking komen, alsmede nieuwe farmacologische chaperone drugs ontwikkelden we een eenvoudige, sterk gestandaardiseerde en veelzijdig cel cultuur gebaseerde bepaling naar het scherm.

In Vitro Enzym meting aan Test farmacologische Chaperone responsiviteit in Fabry en de ziekte van Pompe

Moleculaire beeldvorming met laser matrix-bijgewoonde desorptie/ionisatie gebaseerde imaging massaspectrometrie (MALDI-IMS) kan de gelijktijdige koppeling van meerdere analyten in biologische monsters. Hier presenteren we een protocol voor de detectie en de visualisatie van amyloïde β eiwit op weefsels van de hersenen van Alzheimer en Cerebrale amyloïde angiopathie monsters met behulp van MALDI-IMS.

Visualisatie van amyloïde β-deposito's in de menselijke hersenen met Laser Matrix-bijgewoonde desorptie/ionisatie massaspectrometrie Imaging

Dit protocol biedt een methode om te evalueren van de proteolytic activiteit van een intrinsiek laag-activiteit, één omzet protease in een cellulaire context. In het bijzonder is deze methode toegepast om te evalueren van de proteolytic activiteit van PCSK9, een belangrijke bestuurder van lipide metabolisme waarvan proteolytic activiteit vereist voor de ultieme hypercholesterolemic functie is.

Een High-Throughput Luciferase Assay te evalueren proteolyse van de Single-omzet Protease-PCSK9

In dit protocol wordt beschreven hoe u snelle Low-cost Luciferase-analyses uitvoeren bij medium-throughput met behulp van een insuline-linked Gaussia Luciferase als proxy voor insuline secretie van beta-cellen. De assay kan uitgevoerd worden met de meeste luminescentie plaat lezers en multichannel pipetten.

Meten van relatieve insuline secretie met behulp van een co-afgescheiden Luciferase surrogaat

Dit protocol legt uit hoe het effect van genetische variatie geassocieerd met neurologische ontwikkelingsstoornissen op de deubiquitylerende enzymactiviteit kan worden gemeten door recombinante eiwitzuivering te combineren met ubiquitineketensplitsingstesten.

Het meten van enzymatische activiteit van met neurologische ontwikkelingsstoornissen geassocieerde deubiquitylerende enzymen via een in vitro ubiquitineketensplitsingstest

Hier beschrijven we een gistsysteem dat menselijke γ-secretase reconstrueert. Dit systeem maakt het mogelijk om mutaties die de activiteit beïnvloeden te identificeren en te bestuderen en om γ-secretaseremmers (GSI's) te screenen. Door gebruik te maken van het functieverlies van familiale mutanten voor de ziekte van Alzheimer, is het mogelijk om te screenen op γ-secretasemodulatoren (GSM's).

Saccharomyces cerevisiae Modellen van de ziekte van Alzheimer om genen, mutaties en chemicaliën te screenen die de productie van amyloïde bèta beïnvloeden door γ-secretase

Leer hoe je γ-secretase-activiteit kwantitatief meet met luciferase-reporterassays in gekweekte cellen. Deze methode helpt bij het identificeren van nieuwe modulatoren voor Alzheimer-onderzoek.

Kwantitatieve meting van de γ-Secretase-gemedieerde amyloïde Precursor proteïne en Notch decollete in cel-gebaseerde Luciferase verslaggever Assay platformen (Video) | JoVE Journal

Kwantitatieve meting van de γ-Secretase-gemedieerde amyloïde Precursor proteïne en Notch decollete in cel-gebaseerde Luciferase verslaggever Assay platformen

Meer video's verkennen