Kwantitatieve meting van de γ-Secretase-gemedieerde amyloïde Precursor proteïne en Notch decollete in cel-gebaseerde Luciferase verslaggever Assay platformen

Het algemene doel van deze kwantitatieve cel-gebaseerde reportergen-test voor gamma-secretase is om het differentiële effect van vermeende gamma-secretase modulatoren op gamma-secretase-gemedieerde splitsing te onderzoeken. Deze methode kan helpen om de belangrijkste vragen in het veld van de ziekte van Alzheimer te beantwoorden, zoals de identificatie van nieuwe gamma-secretase modulatoren voor de behandeling van de ziekte van Alzheimer. Het voordeel van deze techniek is dat het een zeer efficiënt testsysteem is, en het kan gemakkelijk gamma-secretase modulatoren identificeren.

De implicatie van deze techniek strekt zich uit tot de therapie van de ziekte van Alzheimer door de potentiële ontdekking van anti-AD medicijnen met minimale bijwerkingen. Deze methode kan inzicht geven in de substraatselectiviteit van gamma-secretase. Het kan ook worden toegepast op de studies van andere ziekten, zoals neuroblastoom.

Personen die nieuw zijn bij deze methode kunnen worstelen met het voorzichtig verwijderen en toevoegen van celkweekmedium aan 96 microplaten, omdat te veel verstoring de uiteindelijke resultaten kan bemoeilijken. Begin deze procedure met de bereiding van NG en CG cellen, zoals vermeld in het tekstprotocol. Tel NG of CG cellen met een hemocytometer.

Zaai vervolgens de cellen op 20.000 cellen per putje op 96-well microplaten op een uiteindelijk volume van 200 microliter per putje in groeimedium. Breng de microplaten over naar een bevochtigde koolstofdioxide-incubator en incubeer ze overnacht bij 37 graden Celsius. Na overnachte incubatie, verwijder 100 microliter groeimedium uit elke put.

Voeg 100 microliter per putje van groeimedium toe met twee microgram per milliliter tetracycline met ofwel 0,2% dimethyl sulfaat, twee micromolair CL-387, 785, twee micromolair DAPT of andere gerelateerde ErbB1/ErbB2-remmers. Incubeer de behandelde cellen en microplaten gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius. Na incubatie, verwijder 150 microliter per putje van groeimedium van de microplaten.

Voeg vervolgens 50 microliter per putje van luciferine assay reagens toe. Breng vervolgens de microplaten over naar een luminescentie microplate reader en houd ze vijf minuten op kamertemperatuur. Bepaal de door vuurvliegjes uitgezonden luminescentie met behulp van een vooraf gedefinieerd programma dat is opgeslagen in de luminescentie microplate reader.

Open eerst de instrumentbesturingssoftware. Selecteer vervolgens uit het menu Gereedschap Luminometrie. Kies onder de Instellingen van Parameters Geen Filter voor emissiefilter, vink Normaal aan voor emissieopening, voer één in voor de teltijd en klik op OK om de luminescentiemeting in te stellen.

Scroll onder het tabblad Instrumentbesturing door de lijst met actieve protocollen en selecteer het vooraf opgeslagen protocol voor het lezen van luminescentie. Definieer onder het tabblad Live weergave de schaal uit het vervolgkeuzemenu en selecteer Logaritmisch of Lineair voor het type. Selecteer onder het tabblad Temperatuur Uit voor het verwarmen van de plaat.

Klik ten slotte op de Start-knop om de luminescentiemeting uit te voeren. Exporteer de resultaten naar een spreadsheetformaat met behulp van de Explorer die is ingesloten in de besturingssoftware. Schat de achtergrondluminescentie van CG of NG cellen behandeld met groeimedium dat geen tetracycline bevat.

Definieer een luminescentiesignaal uitgezonden door CG of NG cellen behandeld met 0,1%DMSO in groeimedium bevattend één microgram per milliliter tetracycline alleen als 100% relatieve gamma-secretase activiteit. Normaliseer ten slotte de luciferine signalen van CG of NG cellen die worden gekweekt met groeimedium bevattend tetracycline en ofwel CL-387, 785 of DAPT naar het luciferine signaal uitgezonden door DMSO-behandelde CG of NG cellen. Hier getoond zijn representatieve resultaten die de kwantitatieve metingen van gamma-secretase splitsing van APP-C99 in de CG cellen demonstreren.

Cellen werden behandeld met één micromolair van CL-387, 785 of DAPT in aanwezigheid van één microgram per milliliter tetracycline bij 37 graden Celsius gedurende 24 uur. De luminescentie afgeleid van gamma-secretase-gemedieerde proteolyse van C99-GV werd gekwantificeerd na de toevoeging van 100 microliter per putje van luciferine assay reagens. De luciferine signaal uitgezonden door cellen behandeld met voertuig alleen werd ingesteld op 100% relatieve luminescentie.

Representatieve resultaten die de kwantitatieve metingen van gamma-secretase splitsing van N-delta-E in de NG cellen demonstreren, worden hier getoond. Evenzo werden cellen behandeld met één micromolair van CL-387, 785 of DAPT in aanwezigheid van één microgram per milliliter tetracycline bij 37 graden Celsius gedurende 24 uur. De luminescentie afgeleid van gamma-secretase-gemedieerde proteolyse van N-delta-E-GV werd gekwantificeerd na de toevoeging van 100 microliter per putje van luciferine assay reagens.

De luciferine signaal uitgezonden door cellen behandeld met voertuig alleen werd ingesteld op 100% relatieve luminescentie. Eenmaal onder de knie, vereist deze techniek slechts een hands-on tijd van één tot twee uur, afhankelijk van het aantal te onderzoeken stoffen. Na de ontwikkeling ervan, heeft deze techniek de weg gebaand voor de onderzoeker in het veld van de ziekte van Alzheimer om genetische en chemische modificatoren van gamma-secretase te verkennen op zoek naar nieuwe therapeutische mogelijkheden voor de ziekte van Alzheimer.