Detectie en kwantificering van Plasmodium falciparum in waterige rode bloedcellen door verzwakt totale reflectie infraroodspectroscopie en Multivariate Data-analyse

Het algemene doel van deze procedure is het bouwen van een regressiemodel voor de voorspelling van malariaparasietmia met behulp van ATR-FTIR spectroscopie met multivariate data-analyse. Deze methode kan helpen versnellen point-of-care diagnostiek die kunnen helpen bij het verbeteren van de resultaten van patiënten in de toekomst. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat, terwijl het model kan enige tijd duren om te bouwen, het is zeer draagbaar, gebruiksvriendelijk, zeer gevoelig, en low-cost.

Hoewel deze methode de kwantificering van malariaparasieten mogelijk maakt, kan het ook worden gebruikt om fenotypische respons op veranderingen in het milieu te observeren, zoals veranderingen in de samenstelling van parasieten als gevolg van antimicrobiële middelen. Het idee ontstond uit het werk dat we deden in het Australische Synchrotron over met malaria geïnfecteerde cellen. Dit was op eencellig niveau.

Van daaruit hebben we besloten om ATR-FTIR spectroscopie te gebruiken om de diagnostische test daadwerkelijk te ontwikkelen. Voorafgaand aan het starten van de synchronisatieprocedure, kweek 30 milliliter 3D7-stam Plasmodium falciparumparasieten zoals beschreven in het tekstprotocol. Met behulp van een geautomatiseerde pipet, resuspend de cultuur en breng het naar een 50-milliliter conische buis.

Centrifuge de cultuur bij 300 tot 400 keer g onder standaard laboratoriumvoorwaarden gedurende vijf minuten. Verwijder de supernatant door het op te stellen met een geautomatiseerde pipet zonder de pellet te storen. Gooi de afvalmedia weg in een 10%bleekmiddeloplossing.

Voeg langzaam 12 tot 15 milliliter van een 4%sorbitoloplossing toe aan de pellet en meng de cultuur door de buis af te kappen en om te keren totdat de cultuur homogeen is. Broed de cultuur op 37 graden Celsius gedurende 15 minuten. Na 15 minuten, centrifuge de cultuur voor vijf minuten.

Gebruik een geautomatiseerde pipet om de supernatant te verwijderen zonder de pellet te storen. Voeg 10 tot 15 milliliter zout toe aan de pellet en meng de oplossing door de buis af te kappen en om te keren totdat de cultuur homogeen is. Herhaal de centrifugatie en zoutoplossing was nog twee keer om alle resten van sorbitol te verwijderen.

Om deze procedure te beginnen, centrifugeren de voorraad rode bloedcellen, of RBCs. Verwijder de supernatant en wassen met 0,9% zout in totaal drie keer. Centrifuge de voorraad RBCs en de cultuur op 300 tot 400 keer g gedurende vijf minuten en gooi de supernatant van elke buis.

Label acht microcentrifugebuizen zoals aangegeven. Gebruik vervolgens een 0,2 tot 20 microliter pipet om de juiste hoeveelheid cultuur toe te voegen aan elke buis. Voeg vervolgens de juiste hoeveelheid voorraad RBC's toe aan elke buis om de gewenste verdunning van parasitemia te verkrijgen.

Centrifugeren het verse donorbloed dat in antistollingsbuizen wordt verzameld bij 1, 200 keer g en standaard laboratoriumomstandigheden gedurende 10 minuten. Verwijder het plasma door het op te stellen met een pipet en gooi het in een 10%bleekmiddel oplossing. Voeg 900 microliter geïsoleerde donor rbc's in elke microcentrifuge buis en meng grondig door het omkeren van 10 keer.

Een eenvoudige benchtop Verzwakt Total Reflection Fourier Transform Infrarood, of ATR-FTIR spectrometer zal worden gebruikt om het spectrum te verwerven. Bereid en reinig het kristal met behulp van pluisvrije doekjes gedempt met ultrazuiver water om het kristal voorzichtig te schrobben in een cirkelvormige beweging. Gebruik vervolgens nog een pluisvrij doekje om het kristal grondig te drogen.

Neem een achtergrondmeting van de lucht door op Achtergrondmeting te klikken. Maak elke 20 minuten het kristal schoon en herhaal deze meting. Open de live weergave door op Voorbeeld te klikken.

Observeer een vlakke, horizontale basislijn die aangeeft dat het kristal schoon is. Pipette 10 microliter gedeïsized water direct op het midden van het kristal en klik op Monster meten. Droog het kristal met een pluisvrij doekje en een zachte cirkelvormige beweging.

Pipette 10 microliter monster op het midden van het kristal en klik op Monster meten. Maak het kristal tussen de monsters schoon. In deze demonstratie wordt multivariate data-analyse uitgevoerd met MATLAB.

Als u wilt beginnen met de gegevensbehandeling, voert u een invoeranalyse in het opdrachtvenster in om de grafische gebruikersinterface te openen. Klik met de rechtermuisknop op het vak X om Importgegevens te zoeken. Selecteer het type bestand voor analyse.

Importeer voorbeeld-, water- en basislijnspectra als gegevenssets naar de werkplek door alle spectra in elke set afzonderlijk te selecteren, op Openen te klikken en elke set een korte naam te geven. Klik op Nieuwe variabele in het opdrachtvenster en geef de vector de naam Parasitemia. Voer de Parasitemia van elk monster in.

Klik met de rechtermuisknop op het vak X om Plotgegevens te zoeken. Klik op het pictogram Gegevens plot om de gegevens in kaart te brengen. Inspecteer de spectra op waterdampeffecten door te klikken op Zoom en in te zoomen op 1, 800 tot 1, 400 per centimeter, het duidelijkst waargenomen als korte, scherpe, smalle pieken langs de hellingen van de Amide I en Amide II banden.

Open in geval van extreme waterdamp het tabblad Voorbewerkingsgegevens bewerken en selecteer Vloeiend maken. Verminder het geluid en/of de sterke waterdampbijdragen door het monster en de waterspectra glad te strijken. Nadat u verder gegevens hebt behandeld zoals beschreven in het tekstprotocol, opent u het tabblad Gegevens bewerken en selecteert u in kolomvariabelen 2980 tot 2800 per centimeter en 1750 tot 850 per centimeter door ervoor te zorgen dat alleen de vakjes worden aangevinkt.

De gegevens zijn nu klaar voor analyse. Als u hoofdcomponentanalyse of PCA wilt uitvoeren, klikt u op Analysedecompositie en selecteert u PCA. Klik op Model bouwen.

Let op de 95%-betrouwbaarheidslimiet, de gestippelde ring, op het scoresplot tussen PC 1 en PC 2. Gebruik het gereedschap Spectra selecteren om de voorbeeldspectra te markeren met scores die buiten de limiet optreden als potentiële uitschieters. Als u gedeeltelijke minst vierkanten regressie of PLSR wilt uitvoeren, klikt u op Analyseregressie en selecteert u PLSR.

Klik met de rechtermuisknop op het Y-blok en selecteer het vectorparasitairemia-buildmodel. Analyseer het regressiemodel en de regressievector en identificeer de biologische banden. Een gedeeltelijke minst vierkanten regressie plot van RBCs spiked tussen nul tot een procent Parasitemia gegenereerd een R-kwadraat waarde van 0,87 en een wortel gemiddelde vierkante cross validatie fout van 0,13%Parasitemia.

Dit toont het vermogen van het model om de Parasitemia in elk monster te voorspellen met de bekende Parasitemia op de x-as en de voorspelde Parasitemia op de y-as. De bijbehorende regressiecoëfficiënt beschrijft de bijdrage van elke band aan de voorspellende capaciteit van het model. Hoe intenser de band, hoe meer het bijdraagt aan het model, en dus hoe de parasiet de chemische samenstelling van het bloed verandert.

De resultaten tonen aan dat het signaal van parasieten onderscheidend genoeg is van de RBC's dat ze kunnen worden gebruikt om een lineair regressiemodel te vormen voor de voorspelling van parasieten in toekomstige datasets. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek minder dan drie minuten per monster duren als deze goed wordt uitgevoerd. Tijdens een poging tot deze procedure is het belangrijk om te onthouden om de ATR-kristallen van alle resten schoon te maken.

Na deze procedure kunnen andere malariasoorten zoals P vivax en P malaria worden gemodelleerd om dergelijke vragen te beantwoorden, zoals, Is ATR-FTIR spectroscopie gevoelig genoeg om onderscheid te maken tussen soorten? Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van biospectroscopie om de detectie en kwantificering van andere door bloed overgedragen ziekteverwekkers te onderzoeken en zelfs in het bloed te analyseren, zoals glucose en ureum. Na het bekijken van deze video, moet u een goed begrip van ATR-FTIR spectroscopie en NVDA analyse om een regressie model te bouwen.

Vergeet niet dat het werken met bloed van patiënten en malaria monsters gevaarlijk kan zijn, en passende bioveiligheid niveau opleiding en insluiting moet altijd worden gedaan bij een poging deze procedure.