Name: Detectie en kwantificering van Plasmodium falciparum in waterige rode bloedcellen door verzwakt totale reflectie infraroodspectroscopie en Multivariate Data-analyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-02T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: Leer ATR-FTIR spectroscopie met multivariate data-analyse voor detectie en kwantificering van Plasmodium falciparum in rode bloedcellen. Deze draagbare, kosteneffectieve methode versnelt malariadiagnostiek op het punt van zorg.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Aan de auteurs financiering werd verstrekt door de Australian Research Council (toekomst Fellowship FT120100926 aan BRW), nationale gezondheids- en medische onderzoek Raad van Australië (Program grant en Senior Research Fellowship aan JGB; Vroege carrière Fellowships JSR; Infrastructuur voor onderzoek instituten ondersteuning regeling subsidie aan het Instituut Burnet), en de Victoriaanse staat regering operationele infrastructuur ondersteuning subsidie aan het Instituut Burnet. Wij erkennen Mr. Finlay Shanks voor instrumentele ondersteuning.

Raadpleeg de juiste Material Safety Data Sheets (MSDS) en zoeken passende Biosafety Level 2 (BSL-2) opleiding. Alle kweken stappen moeten worden gedaan in een kast van BSL-2 met behulp van aseptische techniek, wat betekent dat er een risico van blootstelling aan schadelijke UV-straling van de decontaminatie stappen, naald stick verwondingen, en potentiële biologische blootstelling en infectie als de cultuur van de parasiet eventuele verwondingen invoert. Bovendien, voorraad bloed van bloedbanken alleen vertoond voor bepaalde ziekten en de mogelijkheden voor het verspreiden van bloed overgedragen ziekten is een potentieel risico. Zoek onmiddellijk medische hulp in het voorkomen van letsel.
1. voorbereiding en meting van 3D 7 Plasmodium falciparum parasiet verdunningsreeks
Opmerking: Plasmodium sp. cultuur is zeer gevoelig. Gebruik vers/lopende reagentia en voeden van de parasieten regelmatig door het veranderen van de media. Feed culturen onder 5% parasitemia elke tweede dag; feed culturen tussen 6-10% parasitemia of twee keer per dag; en culturen tussen 11-20% tot 4 keer per dag voeden. Parasieten die beginnen te verhongeren zal verliezen hun vorm en beginnen te contracteren. In een dergelijk geval, voeden en Verdun onmiddellijk door het veranderen van de media en voorraad RBC. verzamelen het bloed van de donor in bloed collectie buizen met heparine als antistollingsmiddel en maatregel binnen de eerste 6 uur toe te voegen.
<ol><li>Cultuur totaal 30 ml van 3D 7 stam Plasmodium falciparum parasieten volgens het standaardprotocol totdat de parasitemia bereikt 10% ringen.</li>
	<li>
Synchronisatie van parasieten
	<ol>
<li>11 uur na de shizogeny in de levenscyclus van de parasiet, resuspendeer de cultuur en de overdracht in een conische buis van 50 mL, met behulp van een geautomatiseerde precisiepipet.</li>
		<li>Centrifugeer de cultuur op 300-400 x g en standaard laboratoriumomstandigheden (25° C en 100 kPa) gedurende 5 minuten.</li>
		<li>Verwijder de bovendrijvende vloeistof door het opstellen met een pipet of met behulp van een pipet van Pasteur gekoppeld aan een vacuüm zonder de pellet te verstoren. Gooi afval media in een 10% bleekwater oplossing.</li>
		<li>Langzaam toevoegen van 12-15 mL van 4% sorbitol-oplossing aan de pellet met behulp van een geautomatiseerde precisiepipet en meng de cultuur door aftopping en omkeren van de buis totdat de cultuur homogeen is.</li>
		<li>Incubeer de cultuur bij 37 ° C gedurende 15 minuten.</li>
		<li>Centrifugeer de cultuur op 300-400 x g en standaard laboratoriumomstandigheden gedurende 5 minuten.</li>
		<li>Verwijder het supernatant zoals beschreven in stap 1.2.3.</li>
		<li>10 – 15 mL zoutoplossing 0,9% toevoegen aan de pellet en meng de oplossing door de aftopping en omkeren van de buis totdat de cultuur homogeen is.</li>
		<li>Herhaal de stappen 1.2.6–1.2.8 tweemaal meer te wassen van alle resten van sorbitol.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Voorbereiding van de verdunningsreeks van parasitemia
	<ol>
<li>Wassen voorraad RBC zoals in stappen 1.2.6–1.2.9.</li>
		<li>Centrifugeer de cultuur op standaard laboratoriumomstandigheden, voorraad RBC bij 300 – 400 x g gedurende 5 min en weggeworpen zoals in stap 1.2.3.</li>
		<li>Label microcentrifuge buizen als 0, 0.010%, 0,025%, 0,075%, 0.100%, 0.250%, 0.750% tot 1.000%, en voeg µL van 0, 1 µL, 2.5 µL, 7,5 µL, 10 µL, 25 µL, 75 µL en 100 µL van cultuur respectievelijk met behulp van een pipet 0.2-20 µL.</li>
		<li>Voeg 100 µL, 99 µL, 97.5 µL, 92,5 µL, 80 µL, 75 µL, 25 en 0 µL van voorraad RBC buizen gelabelde 0% 0.010%, 0,025%, 0,075%, 0.100%, 0.250%, 0.750%, en 1.000%, respectievelijk.</li>
		<li>Centrifugeer het bloed van de vers van de donor verzameld in anticoagulatie buizen op 1.200 x g en standaard laboratoriumomstandigheden gedurende 10 minuten.</li>
		<li>Verwijder het plasma door het opstellen met een pipet en zoals beschreven in stap 1.2.3 te verwijderen.</li>
		<li>Voeg 900 µL van geïsoleerde RBC in elke buis microcentrifuge en meng door het omkeren van 10 x.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Spectrale overname
	<ol>
<li>De begeleidende spectrale acquisitie-programma gebruikt, klikt u op "Instrument Set-Up" en de parameters-collectie ingesteld op het volgende: 128 scans voor achtergrond; 32 scans voor monster; en resolutie tot 8/cm over het maximale sample-bereik van het instrument.</li>
		<li>Stel de temperatuur van de ATR-FTIR spectrometer per fabrikant aanbeveling of 's nachts.</li>
		<li>Reinig het kristal door voorzichtig schrobben in een draaiende beweging met behulp van lint gratis doekjes getemperd met ultrazuiver water. Vervolgens grondig droog met behulp van een ander lint gratis veeg.</li>
		<li>Neem een meting van de achtergrond van de lucht door te klikken op "Achtergrond Measurement". Iedere 20 min, schoon het kristal zoals in stap 1.4.3 en herhaal deze meting.</li>
		<li>De live view openen door te klikken op 'Voorvertoning'. Observeer een platte, horizontale basislijn die aangeeft dat het kristal schoon is.</li>
		<li>Pipetteer 10 µL van gedeïoniseerd water rechtstreeks naar het midden van het kristal en klik op "Maatregel voorbeeld". Herhaal deze meting water na elke vijfde sample.</li>
		<li>Droog het kristal met behulp van de gratis wissen van een lint en een zachte cirkelmotie.</li>
		<li>Pipetteer 10 µL van monster en klik op "Maatregel voorbeeld".</li>
		<li>Reinig het kristal tussen monsters zoals in stap 1.4.3.</li>
		<li>Herhaal deze stappen totdat 3 replicatieonderzoeken worden overgenomen, ervoor zorgend om de volgorde van zowel de monsters en de replicaten randomize.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. multivariate Data-analyse (MVDA)
Opmerking: Gegevensverwerking moet worden gedaan over de gehele dataset om te voorkomen dat lawaai en de toevoeging van pieken van niet-biologische oorsprong. In tegenstelling, analyseren over de biologisch relevante regio's: 2980-2800/cm en 1750-850/cm.
<ol><li>
Gegevensverwerking Opmerking: Twee software, bijvoorbeeld Matlab (voortaan aangeduid als de software 1) en de Chemometrie X (voortaan aangeduid als de software 2) worden gebruikt als voorbeelden voor MVDA. 1 software heeft de mogelijkheid van het uitvoeren van MVDA zonder de toevoeging van een grafische gebruikersinterface (GUI). Het is echter raadzaam om te kopen een GUI (Tabel van materialen). De volgende instructies wanneer met betrekking tot software 1 zal veronderstellen dat is samen met de commercieel beschikbare GUI toolbox, en het voorbeeldscript voor de behandeling van de gegevens is gekoppeld.<ol>
<li>De geschikte multivariate data analysesoftware niet openen, klik op "Gegevens importeren" en selecteer het type bestand voor analyse.<ol>
<li>In software 1, kunt u het "Analyse" ingevoerd door het opdrachtvenster te openen van de GUI. Klik met de rechtermuisknop het X-vak om te zoeken naar "Gegevens importeren".</li>
			<li>In software 2, klikt u op het tabblad "Bestand" om te vinden "Importeren".</li>
		</ol>
</li>
		<li>Importeer spectra van het monster, water en basislijn als gegevenssets in de werkruimte door alle spectra in elke reeks afzonderlijk te selecteren en te klikken op "Open" en geef elke set een korte naam, bijvoorbeeld 'wat' voor dataset van water spectra.</li>
		<li>Selecteer nieuwe tabel/matrix door te klikken op "nieuwe Matrix/Vector" en genereren een n × 1 vector, waarbij n staat voor het aantal monsters. De parasitemia van elk monster input en geven de vector de naam 'Parasitemia'.<ol>
<li>In software 1, klikt u op "Nieuwe variabele" in het opdrachtvenster.</li>
			<li>Software 2, klik op het pictogram "Nieuwe Matrix".</li>
		</ol>
</li>
		<li>Gegevens uitzetten door te klikken op de "Plot gegevens pictogram". Inspecteer de spectra voor waterdamp effecten door te klikken op "Zoom" en inzoomen op 1800-1400/cm; duidelijkst waargenomen als korte, scherpe, smalle pieken langs de hellingen van het amide ik en amide II bands.</li>
		<li>In gevallen van extreme waterdamp, tabblad bewerken/pre-proceskleuren gegevens openen, en selecteer "Smoothing". Verminderen van het lawaai en/of sterke waterdamp bijdragen door de spectra van het monster en water met behulp van maximaal 25 punten voor smoothing of een waterdamp correctie methode gebruiken.</li>
		<li>Juist niet-horizontale basislijn met behulp van de basislijn correctie algoritme indien van toepassing, onder het zelfde lusje van het bewerken/pre-proceskleuren gegevens in stap 2.1.4.</li>
		<li>Gemiddelde water spectra en kopieer de rijen in een n × m matrix gelijk is aan het monster dataset en brengen tot 70% intensiteit door vermenigvuldiging met 0,7.<ol>
<li>In software 1, doen in het opdrachtvenster door het invoeren van het volgende script "AverageWater=mean(WaterDataset)". Vervolgens kopieer-plak de rijen zodat deze overeenkomen met de verzameling voorbeeldgegevens. Verklein de intensiteit en input "AverageWater70 = AverageWater * 0.70".</li>
		</ol>
</li>
		<li>Gemiddelde water spectra van elk monster spectrum aftrekken.<ol>
<li>In software 1, doen in het opdrachtvenster door het invoeren van het volgende script "WaterCorrectedData = SampleDataset-AverageWater70".</li>
		</ol>
</li>
		<li>Open het tabblad bewerken/pre-proceskleuren gegevens toe te passen van een tweede afgeleide functie, en vervolgens de gegevens normaliseren door één normale variate (SNV) functie te selecteren en center gegevens betekenen.<ol>
<li>In software 1, kunt u dat doen in een keer. Selecteer eerst "Afgeleide", en ingang 25 punten van vloeiend maken, polynomiale rangorde 3 en afgeleide orde op het monster ingesteld met behulp van 25 punten vloeiend en een Savitzky-Golay-functie. Selecteer vervolgens "SNV" en "Betekenen Center". Klik op "Oke/Apply".</li>
		</ol>
</li>
		<li>Open het tabblad bewerken/pre-proceskleuren gegevens en "Kolom variabelen", Selecteer in 2,980 – 2.800/cm en 1.750-850/cm door ervoor te zorgen dat alleen hun vakjes zijn aangevinkt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Data-analyse
	<ol>
<li>Hoofdcomponentenanalyse (PCA)<ol>
<li>Klik op "analyse | Decompositie"en selecteer partnerschaps-en samenwerkingsovereenkomst.<ol>
<li>In software 1, klikt u op "Build Model".</li>
				<li>Input in software 2, de methoden van de partnerschaps-en samenwerkingsovereenkomst. Ingang van het optimale aantal onderdelen van de opdrachtgever (PC's) - in dit werk, 7 - en een maximum van 100 iteraties en selecteer Kruis-validatie voor de validatiemethode wordt gebruikt. Klik "Run".</li>
			</ol>
</li>
			<li>De begrenzing van het vertrouwen van 95%, de onderbroken ring, op het perceel van de scores tussen PC1 en PC2 observeren.</li>
			<li>Mark de spectra van het monster met scores die zich voordoen buiten de limiet als potentiële uitschieters met behulp van de "Selecteer Spectra Tool".</li>
			<li>Als de gemarkeerde spectra hoog uitsluiten Hotellings T2 -waarden en hoge Q storingswaarden hen van verdere analyse.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Gedeeltelijke Least Squares Regression (PLS-R)<ol>
<li>Klik op "analyse | Regressie"en selecteer"PLS-R".<ol>
<li>Klik in software 1, recht op Y blok en selecteer de vector "Parasitemia | Bouwen van het Model".</li>
				<li>Input in software 2, de methoden van PLS-R. Selecteer de vector "Parasitemia" als de "Y verwijzing" en de dataset monster als "X Data Set" en selecteer Kruis-validatie als de validatiemethode wordt gebruikt. Klik "Run".</li>
			</ol>
</li>
			<li>Analyseren van het regressiemodel. R-2 waarden over 0,80 en kwadratische gemiddelde fout van cross-validatie (RMSECV) waarden die kleiner dan 0,1% parasitemia zijn zijn aanvaardbaar modellen.</li>
			<li>De regressie-vector analyseren en identificeren van de biologische bands.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Hommel, M., Gilles, H. Chapter 20. <a target="_blank" href="https://books.google.com/books/about/Topley_Wilson_s_Microbiology_and_Microbi.html?id=vs_3lgEACAAJ">Topley & Wilson's Microbiology and Microbial Infections. Vol. 5 Parasitology</a>. Collier, L., Balows, A., Sussman, M. , Arnold. Great Britain. 361(1998).</li>
<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.who.int/malaria/publications/world-malaria-report-2016/report/en/">World Malaria Report 2016</a>. , (2016).</li>
<li>Rogers, W. Chapter 105. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRogers%2C+W+%22Manual+of+Clinical+Microbiology%22">Manual of Clinical Microbiology</a>. Murray, P., Baron, E., Pflaller, M., Tenover, F., Yolken, R. , American Society for Microbioogy, USA. 1355(1999).</li>
<li>White, N. J. Chapter 9. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWhite%2C+NJ+%22Manson%27s+Tropical+Infectious+Diseases%22">Manson's Tropical Infectious Diseases</a>. 23, Elsevier, USA. 532-600 (2014).</li>
<li>Lindblade, K. A., Steinhardt, L., Samuels, A., Kachur, S. P., Slutsker, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+silent+threat%3A+asymptomatic+parasitemia+and+malaria+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Anti+Infect+Ther%22%5BJournal%5D)">The silent threat: asymptomatic parasitemia and malaria transmission.</a> Expert Rev Anti Infect Ther. 11 (6), 623-639 (2013).</li>
<li>Hanscheid, T., Grobusch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+useful+is+PCR+in+the+diagnosis+of+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Parasitol%22%5BJournal%5D)">How useful is PCR in the diagnosis of malaria.</a> Trends Parasitol. 18 (9), 395-398 (2002).</li>
<li>Joanny, F., Löhr, S. J., Engleitner, T., Lell, B., Mordmüller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limit+of+blank+and+limit+of+detection+of+Plasmodium+falciparum+thick+blood+smear+microscopy+in+a+routine+setting+in+Central+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22Malar+J%22%5BJournal%5D)">Limit of blank and limit of detection of Plasmodium falciparum thick blood smear microscopy in a routine setting in Central Africa.</a> Malar J. 13 (1), 234-241 (2014).</li>
<li>World Health Organisation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Malaria+Rapid+Diagnostic+Test+Performance%3A+results+of+WHO+product+testing+of+malaria+RDTs%3A+round+6+%282014-2015%29%22">Malaria Rapid Diagnostic Test Performance: results of WHO product testing of malaria RDTs: round 6 (2014-2015)</a>. , (2014).</li>
<li>Khoshmanesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+quantification+of+early-stage+malaria+parasites+in+laboratory+infected+erythrocytes+by+attenuated+total+reflectance+infrared+spectroscopy+and+multivariate+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Detection and quantification of early-stage malaria parasites in laboratory infected erythrocytes by attenuated total reflectance infrared spectroscopy and multivariate analysis.</a> Anal Chem. 86, 4379-4386 (2014).</li>
<li>Martin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+common+anticoagulants+in+detection+and+quantification+of+malaria+parasitemia+in+human+red+blood+cells+by+ATR-FTIR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Anal%22%5BJournal%5D)">The effect of common anticoagulants in detection and quantification of malaria parasitemia in human red blood cells by ATR-FTIR spectroscopy.</a> Anal. 142 (8), 1192-1199 (2017).</li>
<li>Fabian, H., Mäntele, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFabian%2C+H+%22Handbook+of+Vibrational+Spectroscopy%22">Handbook of Vibrational Spectroscopy</a>. , John Wiley & Sons, Ltd. (2006).</li>
<li>Whelan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+the+reversible+B+to+A-like+transition+of+DNA+in+eukaryotic+cells+using+Fourier+transform+infrared+spectroscoptMonitoring+the+reversible+B+to+A-like+transition+of+DNA+in+eukaryotic+cells+using+Fourier+transform+infrared+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">Monitoring the reversible B to A-like transition of DNA in eukaryotic cells using Fourier transform infrared spectroscoptMonitoring the reversible B to A-like transition of DNA in eukaryotic cells using Fourier transform infrared spectroscopy.</a> Nucleic Acid Res. 39 (13), 5439-5448 (2011).</li>
<li>Wood, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+hydration+and+DNA+conformation+in+interpreting+infrared+spectra+of+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Soc+Rev%22%5BJournal%5D)">The importance of hydration and DNA conformation in interpreting infrared spectra of cells and tissues.</a> Chem Soc Rev. 45, 1980-1998 (1980).</li>
<li>Plyler, E. K. <a target="_blank" href="http://nvlpubs.nist.gov/nistpubs/jres/048/jresv48n4p281_A1b.pdf">Infrared spectra of methanol, ethanol, and rn-propanol.</a> J Res Natl Bur Stand. 48 (4), (1952).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

PLS-R-model is een gecontroleerde multivariate methode waarmee wordt gezocht naar een lineaire relatie, Y = bX + E, tussen de voorspellende variabelen X (hier, de absorptie bij elke golfgetal) en een continu variabele Y (hier, het niveau van de parasitemia). Kortom, het model combineert de variabelen in X bij het maken van een nieuwe reeks van latente variabelen (LVs) die de variantie in X gecorreleerd met Y vangen, en berekent de vector van een regressie (b) een nieuwe resultaten van het spectrum in de schatting van de ...

Malaria is een van de meest verwoestende ziekten van onze tijd; meer dan de helft van de bevolking woont in endemische gebieden in gevaar en het onevenredig jaagt de slechte1,2,3,4. Een groot deel van het probleem is de asymptomatische dragers en vroege fase patiënten die fungeren als reservoirs voor mosquito vectoren5, waardoor pieken van infectie tijdens natte seizoenen en toestaand het om te volharden in gemeenschappen. Malaria wordt veroorzaakt door vijf Plasmodium parasieten, de meest dodelijke daarvan is P. falciparum , waardoor de meest ernstige vorm van de ziekte-2.
Technieken voor de diagnose van malaria zijn op dit moment minder dan perfect. Optische microscopie, de huidige gouden standaard, kan alleen detecteren 62-88 parasieten/µL afhankelijk van de gebruikte methode6. Bovendien, als gevolg van de intensiteit en de hoge vaardigheid vereist, in vele regio's microscopie misdiagnoses > 50% van de gevallen, vooral die met lage parasitemie niveaus2, die rechtstreeks kan worden toegeschreven aan het gebrek aan hulpbronnen in het gebied en de resultaten in het misbruik van anti-malaria drugs. De andere 2 belangrijkste diagnostische methoden zijn snelle Diagnostische Tests (RDTs), die gebruik maken van antilichamen voor de detectie, en Polymerase Chain Reaction (PCR) tests, die discrimineren en kwantificeren van parasieten uit DNA. Momenteel zijn RDTs uitsluitend kundig voor speurder P. falciparum en P. vivax van ten minste 100 parasieten/µL bloed wat resulteert in zeldzamere vormen van de ziekte worden onbehandeld. 7 , 8 daarentegen PCR testen discrimineren en kwantificeren van de verschillende soorten Plasmodium bij een gevoeligheid van 0.0004-5 parasieten/µL bloed. Echter, het dure reagentia, apparatuur en technische vaardigheid vereist, en is dus niet geschikt voor de toepassing van het veld.
Een zeer gevoelige, betrouwbare en betaalbare techniek is essentieel voor het verbeteren van de diagnose tijden, en dus betere geduldige resultaten en ziekteverwijdering mogelijk te maken. Verzwakte totale reflectie Fourier transformatie (ATR-FTIR) spectroscopie biedt een mogelijke oplossing voor dit probleem. Vorige werk heeft aangetoond dat het mogelijk was om detecteren en kwantificeren van P. falciparum in methanol vaste bloedfilms bereiken de detectiegrenzen van < 1 parasiet/µL bloed (< 0.0002% parasitemia)9, die vergelijkbaar met PCR methodes is. Recente studies hebben aangetoond dat het mogelijk is te detecteren en kwantificeren van parasieten in waterige monsters en dus het elimineren van de fixatie stap. Factoren zoals waterdamp, spectrale lawaai en gegevens behandeling moeten echter worden in aanmerking genomen voor optimale resultaten10.
Dit protocol heeft tot doel nieuwe gebruikers leert verwerven ATR-FTIR spectra en een regressiemodel voorbereiden met de opsporing van P. falciparum van waterige rode bloedcellen (RBC) monsters10.

<table><tbody><tr><td>Donor blood</td><td>-</td><td>-</td><td>Moet worden verzameld door een opgeleide medische professional</td></tr><tr><td>Stock blood</td><td>Australian Red Cross`</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>3D7 Plasmodium falciparum</td><td>The Burnet Institute</td><td>-</td><td>Laboratoriumstam wild type equivalent</td></tr><tr><td>RPMI-1640 media met L-hepes zonder Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R6504</td><td></td></tr><tr><td>Albumax (Gibco)</td><td>Thermofisher</td><td>E003000PJ</td><td>Als portie in 50 mL falcon tubes en bewaar in de vriezer</td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Giemsa Stain</td><td>Sigma Aldrich</td><td>48900</td><td></td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S1876</td><td>Moet worden gefilterd voor gebruik in cultuur</td></tr><tr><td>Blood collection tubes (Vacutainers)</td><td>Becton, Dickonson and Company</td><td>367671</td><td></td></tr><tr><td>Immersion Oil</td><td>Thermofisher</td><td>M3004</td><td></td></tr><tr><td>50 mL culture dishes</td><td>Falcon</td><td>353025</td><td></td></tr><tr><td>25mL pipette tips</td><td>Falcon</td><td>357515</td><td></td></tr><tr><td>10mL pipette tips</td><td>Falcon</td><td>357530</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Slides</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8902</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge tubes 50 mL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T2318</td><td></td></tr><tr><td>Automated pipette controller</td><td>Integra-biosciences</td><td>155 015</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend X1R Centrifuge</td><td>Thermofisher</td><td>75004260</td><td></td></tr><tr><td>Forma&trade; 310 Direct Heat CO2 Incubators</td><td>Thermofisher</td><td>310TS</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse E-100 Binocular Microscope</td><td>Nikon Instruments</td><td>E100_2CE-MRTK-1</td><td>Wanneer gekocht, zorg ervoor dat de 100x lens een olie-immersie lens is</td></tr><tr><td>Bruker Alpha Ft-IR Spectrometer met ATR Quick Snap Attachment</td><td>Bruker</td><td>9308-3700</td><td>Zorg ervoor dat u "Eco-ATR" attachment aanvraagt bij aankoop</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks Inc</td><td></td><td>Multivariate data analyse software</td></tr><tr><td>The Unscrambler X</td><td>CAMO</td><td></td><td>Multivariate data analyse software</td></tr><tr><td>PLS-Toolbox</td><td>Mathworks, Inc.</td><td></td><td>GUI voor Matlab</td></tr></tbody></table>

detectie en kwantificering van plasmodium falciparum in waterige rode bloedcellen door verzwakt totale reflectie infraroodspectroscopie en multivariate data-analyse

Detection and Quantification of Plasmodium falciparum in Aqueous Red Blood Cells by Attenuated Total Reflection Infrared Spectroscopy and Multivariate Data Analysis

We tonen een methode voor de kwantificering en opsporing van parasieten in waterige rode bloedcellen (RBC) met behulp van een eenvoudige benchtop verzwakt totale reflectie Fourier Transform Infrared (ATR-FTIR) spectrometer in combinatie met Multivariate Data-analyse ( MVDA). 3D 7 P. falciparum werden gekweekt voor 10% parasitemia ring fase parasieten en gewend spike verse donor geïsoleerd RBC een verdunning als reeks wilt maken tussen 0 – 1%. 10 µL van elk monster werden geplaatst in het midden van het venster van de diamant ATR te verwerven van het spectrum. De sample data werd behandeld om de signaal / ruisverhouding en te verwijderen van de bijdrage van water, en vervolgens de tweede afgeleide werd toegepast om op te lossen van de spectrale eigenschappen. De gegevens werden vervolgens geanalyseerd met behulp van twee soorten MVDA: eerste belangrijkste componenten analyse (PCA) om uitschieters waarna gedeeltelijke regressie met kleinste kwadraten (PLS-R) om te bouwen van het model van de kwantificering.

Gedeeltelijke kleinste kwadraten (PLS-R) uitzetten en de bijbehorende regressie vector, Figuur 1a en 1b respectievelijk, laten zien dat het signaal van parasieten onderscheiden genoeg van de RBC die ze kunnen worden gebruikt om de vorm een lineaire regressie model moet worden gebruikt voor de voorspelling van parasieten in toekomstige gegevensverzamelingen.
Een robuuste, lineaire PL...

Hier presenteren we een protocol voor de detectie en kwantificering van Plasmodium falciparum in besmette waterige rode bloedcellen, met behulp van een verzwakte totale reflectie infrared spectrometer en multivariate data-analyse.

Detectie en kwantificering van Plasmodium falciparum in waterige rode bloedcellen door verzwakt totale reflectie infraroodspectroscopie en Multivariate Data-analyse

We demonstrate a method of quantification and detection of parasites in aqueous red blood cells (RBCs) by using a simple benchtop Attenuated Total ...

Het algemene doel van deze procedure is het bouwen van een regressiemodel voor de voorspelling van malariaparasietmia met behulp van ATR-FTIR spectroscopie met multivariate data-analyse. Deze methode kan helpen versnellen point-of-care diagnostiek die kunnen helpen bij het verbeteren van de resultaten van patiënten in de toekomst. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat, terwijl het model kan enige tijd duren om te bouwen, het is zeer draagbaar, gebruiksvriendelijk, zeer gevoelig, en low-cost.Hoewel deze methode de kwantificering van malariaparasieten mogelijk maakt, kan het ook worden gebruikt om fenotypische respons op veranderingen in het milieu te observeren, zoals veranderingen in de samenstelling van parasieten als gevolg van antimicrobiële middelen. Het idee ontstond uit het werk dat we deden in het Australische Synchrotron over met malaria geïnfecteerde cellen. Dit was op eencellig niveau.Van daaruit hebben we besloten om ATR-FTIR spectroscopie te gebruiken om de diagnostische test daadwerkelijk te ontwikkelen. Voorafgaand aan het starten van de synchronisatieprocedure, kweek 30 milliliter 3D7-stam Plasmodium falciparumparasieten zoals beschreven in het tekstprotocol. Met behulp van een geautomatiseerde pipet, resuspend de cultuur en breng het naar een 50-milliliter conische buis.Centrifuge de cultuur bij 300 tot 400 keer g onder standaard laboratoriumvoorwaarden gedurende vijf minuten. Verwijder de supernatant door het op te stellen met een geautomatiseerde pipet zonder de pellet te storen. Gooi de afvalmedia weg in een 10%bleekmiddeloplossing.Voeg langzaam 12 tot 15 milliliter van een 4%sorbitoloplossing toe aan de pellet en meng de cultuur door de buis af te kappen en om te keren totdat de cultuur homogeen is. Broed de cultuur op 37 graden Celsius gedurende 15 minuten. Na 15 minuten, centrifuge de cultuur voor vijf minuten.Gebruik een geautomatiseerde pipet om de supernatant te verwijderen zonder de pellet te storen. Voeg 10 tot 15 milliliter zout toe aan de pellet en meng de oplossing door de buis af te kappen en om te keren totdat de cultuur homogeen is. Herhaal de centrifugatie en zoutoplossing was nog twee keer om alle resten van sorbitol te verwijderen.Om deze procedure te beginnen, centrifugeren de voorraad rode bloedcellen, of RBCs. Verwijder de supernatant en wassen met 0,9% zout in totaal drie keer. Centrifuge de voorraad RBCs en de cultuur op 300 tot 400 keer g gedurende vijf minuten en gooi de supernatant van elke buis.Label acht microcentrifugebuizen zoals aangegeven. Gebruik vervolgens een 0,2 tot 20 microliter pipet om de juiste hoeveelheid cultuur toe te voegen aan elke buis. Voeg vervolgens de juiste hoeveelheid voorraad RBC's toe aan elke buis om de gewenste verdunning van parasitemia te verkrijgen.Centrifugeren het verse donorbloed dat in antistollingsbuizen wordt verzameld bij 1, 200 keer g en standaard laboratoriumomstandigheden gedurende 10 minuten. Verwijder het plasma door het op te stellen met een pipet en gooi het in een 10%bleekmiddel oplossing. Voeg 900 microliter geïsoleerde donor rbc's in elke microcentrifuge buis en meng grondig door het omkeren van 10 keer.Een eenvoudige benchtop Verzwakt Total Reflection Fourier Transform Infrarood, of ATR-FTIR spectrometer zal worden gebruikt om het spectrum te verwerven. Bereid en reinig het kristal met behulp van pluisvrije doekjes gedempt met ultrazuiver water om het kristal voorzichtig te schrobben in een cirkelvormige beweging. Gebruik vervolgens nog een pluisvrij doekje om het kristal grondig te drogen.Neem een achtergrondmeting van de lucht door op Achtergrondmeting te klikken. Maak elke 20 minuten het kristal schoon en herhaal deze meting. Open de live weergave door op Voorbeeld te klikken.Observeer een vlakke, horizontale basislijn die aangeeft dat het kristal schoon is. Pipette 10 microliter gedeïsized water direct op het midden van het kristal en klik op Monster meten. Droog het kristal met een pluisvrij doekje en een zachte cirkelvormige beweging.Pipette 10 microliter monster op het midden van het kristal en klik op Monster meten. Maak het kristal tussen de monsters schoon. In deze demonstratie wordt multivariate data-analyse uitgevoerd met MATLAB.Als u wilt beginnen met de gegevensbehandeling, voert u een invoeranalyse in het opdrachtvenster in om de grafische gebruikersinterface te openen. Klik met de rechtermuisknop op het vak X om Importgegevens te zoeken. Selecteer het type bestand voor analyse.Importeer voorbeeld-, water- en basislijnspectra als gegevenssets naar de werkplek door alle spectra in elke set afzonderlijk te selecteren, op Openen te klikken en elke set een korte naam te geven. Klik op Nieuwe variabele in het opdrachtvenster en geef de vector de naam Parasitemia. Voer de Parasitemia van elk monster in.Klik met de rechtermuisknop op het vak X om Plotgegevens te zoeken. Klik op het pictogram Gegevens plot om de gegevens in kaart te brengen. Inspecteer de spectra op waterdampeffecten door te klikken op Zoom en in te zoomen op 1, 800 tot 1, 400 per centimeter, het duidelijkst waargenomen als korte, scherpe, smalle pieken langs de hellingen van de Amide I en Amide II banden.Open in geval van extreme waterdamp het tabblad Voorbewerkingsgegevens bewerken en selecteer Vloeiend maken. Verminder het geluid en/of de sterke waterdampbijdragen door het monster en de waterspectra glad te strijken. Nadat u verder gegevens hebt behandeld zoals beschreven in het tekstprotocol, opent u het tabblad Gegevens bewerken en selecteert u in kolomvariabelen 2980 tot 2800 per centimeter en 1750 tot 850 per centimeter door ervoor te zorgen dat alleen de vakjes worden aangevinkt.De gegevens zijn nu klaar voor analyse. Als u hoofdcomponentanalyse of PCA wilt uitvoeren, klikt u op Analysedecompositie en selecteert u PCA. Klik op Model bouwen.Let op de 95%-betrouwbaarheidslimiet, de gestippelde ring, op het scoresplot tussen PC 1 en PC 2. Gebruik het gereedschap Spectra selecteren om de voorbeeldspectra te markeren met scores die buiten de limiet optreden als potentiële uitschieters. Als u gedeeltelijke minst vierkanten regressie of PLSR wilt uitvoeren, klikt u op Analyseregressie en selecteert u PLSR.Klik met de rechtermuisknop op het Y-blok en selecteer het vectorparasitairemia-buildmodel. Analyseer het regressiemodel en de regressievector en identificeer de biologische banden. Een gedeeltelijke minst vierkanten regressie plot van RBCs spiked tussen nul tot een procent Parasitemia gegenereerd een R-kwadraat waarde van 0,87 en een wortel gemiddelde vierkante cross validatie fout van 0,13%Parasitemia.Dit toont het vermogen van het model om de Parasitemia in elk monster te voorspellen met de bekende Parasitemia op de x-as en de voorspelde Parasitemia op de y-as. De bijbehorende regressiecoëfficiënt beschrijft de bijdrage van elke band aan de voorspellende capaciteit van het model. Hoe intenser de band, hoe meer het bijdraagt aan het model, en dus hoe de parasiet de chemische samenstelling van het bloed verandert.De resultaten tonen aan dat het signaal van parasieten onderscheidend genoeg is van de RBC's dat ze kunnen worden gebruikt om een lineair regressiemodel te vormen voor de voorspelling van parasieten in toekomstige datasets. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek minder dan drie minuten per monster duren als deze goed wordt uitgevoerd. Tijdens een poging tot deze procedure is het belangrijk om te onthouden om de ATR-kristallen van alle resten schoon te maken.Na deze procedure kunnen andere malariasoorten zoals P vivax en P malaria worden gemodelleerd om dergelijke vragen te beantwoorden, zoals, Is ATR-FTIR spectroscopie gevoelig genoeg om onderscheid te maken tussen soorten? Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van biospectroscopie om de detectie en kwantificering van andere door bloed overgedragen ziekteverwekkers te onderzoeken en zelfs in het bloed te analyseren, zoals glucose en ureum. Na het bekijken van deze video, moet u een goed begrip van ATR-FTIR spectroscopie en NVDA analyse om een regressie model te bouwen.Vergeet niet dat het werken met bloed van patiënten en malaria monsters gevaarlijk kan zijn, en passende bioveiligheid niveau opleiding en insluiting moet altijd worden gedaan bij een poging deze procedure.

detection-quantification-plasmodium-falciparum-aqueous-red-blood

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

Zodra een gen is geïdentificeerd als potentieel vuurvaste voor malaria, dient te worden geëvalueerd voor zijn rol in het voorkomen van Plasmodium besmettingen binnen de mug. Dit protocol illustreert hoe de mate van plasmodium infecties van muggen kunnen worden getest. De technieken voor de voorbereiding van de gametocyt cultuur, membraan voeden muggen menselijk bloed, en het testen van virale titers in de mug middendarm worden gedemonstreerd.

Protocol voor Plasmodium falciparum Infecties in Muggen en Infection Fenotype Bepaling

Analyse van de Single-cell gentranscriptie door RNA TL<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie (FISH)

This video demonstrates a flow cytometry-based phagocytosis assay involving labeled and opsonized Plasmodium falciparum-infected erythrocytes by monocytes. Flow cytometry identifies fluorescence in monocytes, confirming the successful identification of opsonized erythrocytes through phagocytosis.

An Assay for Quantifying Antibody-Mediated Phagocytosis of Parasite-Infected Erythrocytes

De paramagnetische eigenschappen van hemozoin gebruikt in latere stadia van...

Scheiding van<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Late Stage-geïnfecteerde erythrocyten met magnetische middelen

Het meten van antilichaam-functie is de sleutel tot het begrijpen van immuniteit tegen Plasmodium falciparum malaria. Deze methode beschrijft de zuivering van levensvatbare merozoïeten en meting van opsonisatie-afhankelijke fagocytose door flowcytometrie.

High Yield Zuivering van<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Merozoïeten Voor gebruik in opsoniserende antilichaamassays

De malariaparasiet binnenvalt en herhalingen binnen de rode bloedcellen. Nauwkeurige vaststelling van de merozoïet invasie en parasitemia is daarom van cruciaal belang bij de beoordeling van het verloop van de malaria-infectie. Hier beschrijven we een flowcytometrie gebaseerd protocol voor het meten van deze parameters in een muismodel van malaria.

In vivo evaluatie van het knaagdier Plasmodium parasitemia en merozoïet Invasion van flowcytometrie

Menselijk microRNA transloceert van gastheer erytrocyten naar Plasmodium falciparum parasieten. Hier worden de technieken beschreven die worden gebruikt om synthetische microRNA's in gastheer erytrocyten te transfecteren en alle RNA's uit P. falciparum te isoleren. Daarnaast zal dit artikel een methode voor polysoomisolatie in P. falciparum beschrijven om de ribosomale bezetting en translationele potentieel van parasiet transcripten te bepalen.

Methoden om de regulerende rol van kleine RNA&#39;s en Ribosomaal bezetting van Onderzoek<em&gt; Plasmodium falciparum</em

Het algemene doel van dit protocol is om instructies te geven over het meten van de capaciteit van antilichamen aanwezig in sera of plasma van individuen, van nature blootgesteld aan Plasmodium falciparum infectie, om fagocytose van de parasiet-geïnfecteerde erytrocyten (IEs) te opsoniseren en induceren.

Het meten van natuurlijk verworven phagocytose-inducerende antilichamen tegen Plasmodium falciparum parasieten door een Flow Cytometrie-Gebaseerde Test

Dit protocol beschrijft een sandwich-enzymgekoppelde immunosorbenttest om speekselkliersporozoïeten bij muggen te detecteren. Met behulp van gemakkelijk verkrijgbare monoklonale antilichamen maakt de methode kosteneffectieve detectie met hoge doorvoer mogelijk van muggen die Plasmodium falciparum of Plasmodium vivax dragen. De methode is geschikt voor onderzoek naar de overdracht van malaria, inclusief vectoronderzoeken.

Detectie van Plasmodium Sporozoïeten bij Anopheles-muggen met behulp van een enzymgekoppelde immunosorbenttest

De standaard membraanvoedingstest (SMFA) wordt beschouwd als de gouden standaard voor de beoordeling en identificatie van potentiële antimalariaverbindingen. Dit kunstmatige voedingssysteem wordt gebruikt om muggen te infecteren om de effecten van dergelijke verbindingen op de intensiteit en prevalentie van de Plasmodium falciparum-parasiet verder te evalueren.

Standaard membraanvoedingstest voor de detectie van Plasmodium falciparum-infectie in Anopheles Mosquito Vectors

Hier beschrijven we een nieuwe methode om de mechanismen van cellulaire immuniteit tegen Plasmodium tijdens het bloedstadium van infectie op te helderen. Dit is een in vitro test die geïnfecteerde rode bloedcellen dodental door cytotoxische lymfocyten meet.

In vitro Bepaling van plasmodium-geïnfecteerde rode bloedceldoding door cytotoxische lymfocyten

Leer ATR-FTIR spectroscopie met multivariate data-analyse voor detectie en kwantificering van Plasmodium falciparum in rode bloedcellen. Deze draagbare, kosteneffectieve methode versnelt malariadiagnostiek op het punt van zorg.

Detectie en kwantificering van Plasmodium falciparum in waterige rode bloedcellen door verzwakt totale reflectie infraroodspectroscopie en Multivariate Data-analyse (Video) | JoVE Journal

Detectie en kwantificering van Plasmodium falciparum in waterige rode bloedcellen door verzwakt totale reflectie infraroodspectroscopie en Multivariate Data-analyse

Meer video's verkennen