Methoden voor de beoordeling van epitheliale cel migratie tijdens het In Vitro wondgenezing op basis van microscopie
January 2nd, 2018
Dit manuscript beschrijft hoe incisie-achtige letsels gemaakt op gekweekte epitheliale cel monolayers gunstig model wond genezing in vitro, waardoor voor beeldvorming door confocal of laser scanning microscopie, en die kan voorzien van kwalitatief hoogwaardige kwantitatieve en kwalitatieve gegevens voor het bestuderen van zowel cel gedrag en de mechanismen die betrokken zijn bij migratie.
Het algemene doel van deze procedures voor het kunstmatig verwonden van epitheelcelculturen is om celmigratie zowel vanuit een kwantitatief als kwalitatief perspectief te bestuderen, waardoor een beoordeling mogelijk is van de effecten van specifieke behandelingen van belang op wondgenezing. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het veld van wondgenezing te beantwoorden, omdat ze de nauwkeurige karakterisering van de rollen van specifieke migratieprocessen tijdens epitheelbeschadiging mogelijk maken. Het grote voordeel van deze benadering is dat het de correlatie mogelijk maakt tussen celmigratiemetingen en veranderingen in het gedrag van relevante moleculaire markeringen.
De implicaties van deze technieken reiken tot een therapie voor klinische wonden, omdat het een handige setup biedt voor vroegtijdige medicijntesten en voor wondsluiting. Over het algemeen zal deze methode worden gestart vanwege moeilijkheden bij het verkrijgen van consistente reproduceerbaarheid in de wonden met een generatie. Voor een kunstmatige wondkrastest, begint u door elk putje van een kweekplaat te zaaien met twee milliliter epitheelcellen van belang in compleet medium.
Kweek de cellen gedurende twee tot drie dagen op 37 graden Celsius en vijf procent kooldioxide tot 100% confluency. Wanneer de cellen klaar zijn, was de cellen twee keer met vers serumvrij medium gevolgd door 24 uur cultuur in vers serumvrij medium. De volgende dag plaatst u de plaat in een steriele werkruimte en sleept u het smalle uiteinde van een steriele micropipettip twee keer over de bodem van elk putje om een kruisvormige wond te maken.
Een consistente wondspleet wordt bereikt door constante, stevige druk uit te oefenen terwijl de tip soepel langs het epitheeloppervlak wordt bewogen. Overmatige druk zal de tip vervormen, wat een onregelmatige wondradius veroorzaakt. Verwijder voorzichtig het supernatant om de losgekoppelde cellen te verwijderen en voeg voorzichtig vers serumvrij medium toe aan de putjes.
Gebruik een omgekeerd fasecontrastmicroscoop verbonden met een camera met beeldopnameapparaat, lijn de rand van het microscoopveld uit met de aangrenzende kruising van de krassen om maximaal vier pre-behandelingsreferentieafbeeldingen van de krasspleet in elk putje te verkrijgen. Wanneer alle afbeeldingen zijn verkregen, vervangt u het medium in de aangewezen behandelputjes met vers medium, aangevuld met geselecteerde behandelingen van belang, en brengt u de platen terug naar de celkweekincubator. Wanneer ten minste één conditie ongeveer 90% krassluiting bereikt, vervangt u voorzichtig het supernatant met één milliliter vier procent formaline in PBS voor een incubatie van 15 minuten bij kamertemperatuur.
Was vervolgens de cellen voorzichtig met PBS minstens drie keer om eventueel overtollig formaline te verwijderen en beeld de putjes af zoals zojuist is gedemonstreerd, met behulp van dezelfde beeldparameters in de oorspronkelijke referentiegebieden die na het krabben zijn vastgelegd. Om de afbeeldingen te analyseren met de juiste beeldverwerkingssoftware, opent u de opgenomen, pre-behandelingsafbeelding van belang en stelt u onder het menu Afbeelding de afbeeldingstype in op 8-bits. Onder het menu Proces selecteert u het submenu Filters en past u Variatiefiltering toe.
Onder het menu Afbeelding opent u het submenu Aanpassen en stelt u de Drempel in op zwart-wit. In het menu Proces selecteert u het submenu Binair en past u Vul gaten toe. Onder het menu Analyseer selecteert u Metingen instellen en activeert u Gebied.
Teken vervolgens het meetbare gebied, volg de contuur van de migrerende rand om de spleet af te bakenen. Selecteer onder het menu Analyseer Analyseer deeltjes en noteer de totale gebiedswaarden voor het getekende gebiedoppervlak. Om de absolute migratie voor elke set individuele monsters te kwantificeren als het verschil tussen de spleetoppervlaktemetingen, exporteert u de totale spleetoppervlaktewaarden voor en na de behandeling naar een spreadsheet en plot de kwantificeringsuitvoer.
Voor een kunstmatige migratiefronttest, voegt u onder steriele omstandigheden een laag van maximaal 33 gesteriliseerde ronde deksels toe aan lege 10 centimeter kweekplaten. Wanneer het plaatoppervlak volledig is bedekt, zaait u de epitheelcellen van belang voorzichtig in met een concentratie die 100% confluency mogelijk maakt na twee of drie dagen kweek. Indien nodig, drukt u de deksels voorzichtig in met een steriele micropipettip om zweven te voorkomen.
Wanneer de cellen confluency bereiken, vervangt u het supernatant door serumvrij medium voor nog eens 24 uur kweek. Gebruik vervolgens steriele pincetten om voorzichtig een deksel over te brengen naar een nieuwe 10 centimeter plaat met vers serumvrij medium, waarbij u voorzichtig de deksel langs de rand vasthoudt. Om de kunstmatige wonden te creëren, sleept u een gesteriliseerde scheermes terug en vooruit over elk deksel om een drie tot vier millimeter brede dwarslijn over het midden van elk celkweekcentrum te maken om de centrale monolaagstrook volledig te verwijderen.
Zorg ervoor dat u de rand van het scheermes zwaar over het oppervlak van het deksel legt bij het maken van de wond om te beschermen tegen een onregelmatige randvorm en de generatie van flappende epitheelgedeelten. Breng maximaal vier wonddeksels, cellijdzijde omhoog, over in afzonderlijke putjes van een zesputjesplaat, die minimaal twee milliliter serumvrij medium bevatten, en was elk putje twee keer voorzichtig met vers serumvrij medium om eventuele losgekoppelde cellen te verwijderen. Wanneer alle losgekoppelde cellen zijn weggegooid, vervangt u voorzichtig het wasmedium door vers medium dat is aangevuld met de behandelingen van belang, en plaatst u de plaat in de celkweekincubator.
Aan het einde van de geschikte experimentele periode fixeert u de cellen met vier procent formaline in PBS zoals zojuist is gedemonstreerd, en kleur de cellen met de juiste fluorescentie geconjugeerde antilichamen van belang. Beeld vervolgens de structurele veranderingen die optreden bij de migrerende frontrand af door middel van fluorescentiemicroscopie volgens de experimentele parameters van belang. In dit experiment werden de wondspleten gemeten vóór en na behandeling met epidermale groei
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit manuscript beschrijft een methode voor het modelleren van wondgenezing in vitro met behulp van incisie-achtige laesies op gekweekte monolagen van epitheelcellen. Deze benadering maakt beeldvorming mogelijk en levert hoogwaardige gegevens voor het bestuderen van celgedrag en migratiemechanismen.
Belangrijkste onderdeel van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Celbiologie
- Wondgenezing
- Celmigratie
Achtergrond
- Wondgenezing is een cruciaal biologisch proces.
- Het begrijpen van celmigratie is essentieel voor het ontwikkelen van therapieën.
- Kunstmatige wondtechnieken kunnen inzicht geven in genezingsmechanismen.
- Consistente reproduceerbaarheid in wondmodellen is vaak uitdagend.
Doel van het onderzoek
- Om celmigratie zowel kwantitatief als kwalitatief te bestuderen.
- Om de effecten van specifieke behandelingen op wondgenezing te beoordelen.
- Om de rollen van migratieprocessen tijdens epitheelonderbreking te karakteriseren.
Gebruikte methoden
- Incisie-achtige laesies gemaakt op monolagen van epitheelcellen.
- Beeldvorming uitgevoerd met behulp van confocale of laserscanningmicroscopie.
- Correlatie van celmigratiemetingen met moleculair markergedrag.
- Setup maakt vroege medicijntesten en beoordeling van wondsluiting mogelijk.
Belangrijkste resultaten
- Karakterisering van migratieprocessen tijdens wondgenezing.
- Kwantitatieve gegevens over celgedrag in reactie op behandelingen.
- Inzichten in de implicaties voor klinische wondtherapie.
- Demonstratie van de reproduceerbaarheid en betrouwbaarheid van de methode.
Conclusies
- De kunstmatige wondmethode is effectief voor het bestuderen van epitheelcelmigratie.
- Deze aanpak kan het begrip van wondgenezingsmechanismen verbeteren.
- Mogelijke toepassingen in vroege medicijntesten voor wondtherapieën.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Assessing epithelial cell migration in vitro provides a scalable, reproducible platform for early-stage wound healing research, enabling mechanistic de-risking of therapeutic candidates. Quantitative and qualitative readouts from scratch and migration front assays support target validation by linking cellular behavior to molecular marker changes. This approach improves predictive confidence in preclinical models by correlating migration dynamics with treatment effects, informing go/no-go decisions in wound therapy pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by correlating cell migratory measurements with changes in relevant molecular markers.
- Operational Value: Provides quantitative gap closure data and qualitative front-edge imaging to de-risk targets involved in epithelial repair pathways.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, reproducible wound models suitable for high-content screening of compounds affecting cell migration.
- Operational Value: Supports assay scalability through defined protocols for scratch and migration front generation, enabling cross-well and cross-plate consistency.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Bridges discovery and preclinical work by capturing migration dynamics that reflect in vivo wound healing processes.
- Operational Value: Facilitates translational biomarker alignment, such as c-Jun or F-Actin reorganization, to validate mechanism of action in disease-relevant systems.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows, supporting hypothesis testing in target validation and enabling scalable assay development for lead identification in wound healing programs.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by linking migration metrics to molecular marker behavior, reducing mechanistic ambiguity in target selection.
- Screening: Delivers quantitative gap closure measurements and qualitative front-edge imaging, enabling reliable compound evaluation in migration-focused screens.
- Analytics: Provides quantifiable outputs (gap surface area differences) and imaging-based readouts that allow statistical comparison across treatment conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through fluorescence imaging of structural changes at the migrating front, supporting biomarker-aligned advancement decisions.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, standardized platform for assessing epithelial migration across multiple targets and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through correlation of migration dynamics with molecular marker changes, reducing false positives in target validation.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via defined wounding protocols and imaging parameters, minimizing inter-experiment variability.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by providing early, mechanism-linked efficacy data, lowering late-stage biological risk in wound therapy development.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of candidates based on quantitative migration inhibition or stimulation profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture techniques, microscopy (phase contrast and fluorescence), and image analysis software for accurate wound quantification.
- Dependent on sterile tissue culture equipment, microscopes with CCD or fluorescence capabilities, and tools for precise wound generation (micropipette tips, razor blades).
- Necessitates standardization of wounding pressure, timing, and imaging fields across users and labs to ensure data comparability.
- Adaptation considerations include epithelial cell line variability, confluence requirements, and serum-free conditions to avoid confounding proliferation effects.
- Practical limitations include potential wound edge irregularities from excessive pressure or improper tool handling, which can disrupt migration quantification and require manual exclusion.
