Methoden voor de beoordeling van epitheliale cel migratie tijdens het In Vitro wondgenezing op basis van microscopie

Het algemene doel van deze procedures voor het kunstmatig verwonden van epitheelcelculturen is om celmigratie zowel vanuit een kwantitatief als kwalitatief perspectief te bestuderen, waardoor een beoordeling mogelijk is van de effecten van specifieke behandelingen van belang op wondgenezing. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het veld van wondgenezing te beantwoorden, omdat ze de nauwkeurige karakterisering van de rollen van specifieke migratieprocessen tijdens epitheelbeschadiging mogelijk maken. Het grote voordeel van deze benadering is dat het de correlatie mogelijk maakt tussen celmigratiemetingen en veranderingen in het gedrag van relevante moleculaire markeringen.

De implicaties van deze technieken reiken tot een therapie voor klinische wonden, omdat het een handige setup biedt voor vroegtijdige medicijntesten en voor wondsluiting. Over het algemeen zal deze methode worden gestart vanwege moeilijkheden bij het verkrijgen van consistente reproduceerbaarheid in de wonden met een generatie. Voor een kunstmatige wondkrastest, begint u door elk putje van een kweekplaat te zaaien met twee milliliter epitheelcellen van belang in compleet medium.

Kweek de cellen gedurende twee tot drie dagen op 37 graden Celsius en vijf procent kooldioxide tot 100% confluency. Wanneer de cellen klaar zijn, was de cellen twee keer met vers serumvrij medium gevolgd door 24 uur cultuur in vers serumvrij medium. De volgende dag plaatst u de plaat in een steriele werkruimte en sleept u het smalle uiteinde van een steriele micropipettip twee keer over de bodem van elk putje om een kruisvormige wond te maken.

Een consistente wondspleet wordt bereikt door constante, stevige druk uit te oefenen terwijl de tip soepel langs het epitheeloppervlak wordt bewogen. Overmatige druk zal de tip vervormen, wat een onregelmatige wondradius veroorzaakt. Verwijder voorzichtig het supernatant om de losgekoppelde cellen te verwijderen en voeg voorzichtig vers serumvrij medium toe aan de putjes.

Gebruik een omgekeerd fasecontrastmicroscoop verbonden met een camera met beeldopnameapparaat, lijn de rand van het microscoopveld uit met de aangrenzende kruising van de krassen om maximaal vier pre-behandelingsreferentieafbeeldingen van de krasspleet in elk putje te verkrijgen. Wanneer alle afbeeldingen zijn verkregen, vervangt u het medium in de aangewezen behandelputjes met vers medium, aangevuld met geselecteerde behandelingen van belang, en brengt u de platen terug naar de celkweekincubator. Wanneer ten minste één conditie ongeveer 90% krassluiting bereikt, vervangt u voorzichtig het supernatant met één milliliter vier procent formaline in PBS voor een incubatie van 15 minuten bij kamertemperatuur.

Was vervolgens de cellen voorzichtig met PBS minstens drie keer om eventueel overtollig formaline te verwijderen en beeld de putjes af zoals zojuist is gedemonstreerd, met behulp van dezelfde beeldparameters in de oorspronkelijke referentiegebieden die na het krabben zijn vastgelegd. Om de afbeeldingen te analyseren met de juiste beeldverwerkingssoftware, opent u de opgenomen, pre-behandelingsafbeelding van belang en stelt u onder het menu Afbeelding de afbeeldingstype in op 8-bits. Onder het menu Proces selecteert u het submenu Filters en past u Variatiefiltering toe.

Onder het menu Afbeelding opent u het submenu Aanpassen en stelt u de Drempel in op zwart-wit. In het menu Proces selecteert u het submenu Binair en past u Vul gaten toe. Onder het menu Analyseer selecteert u Metingen instellen en activeert u Gebied.

Teken vervolgens het meetbare gebied, volg de contuur van de migrerende rand om de spleet af te bakenen. Selecteer onder het menu Analyseer Analyseer deeltjes en noteer de totale gebiedswaarden voor het getekende gebiedoppervlak. Om de absolute migratie voor elke set individuele monsters te kwantificeren als het verschil tussen de spleetoppervlaktemetingen, exporteert u de totale spleetoppervlaktewaarden voor en na de behandeling naar een spreadsheet en plot de kwantificeringsuitvoer.

Voor een kunstmatige migratiefronttest, voegt u onder steriele omstandigheden een laag van maximaal 33 gesteriliseerde ronde deksels toe aan lege 10 centimeter kweekplaten. Wanneer het plaatoppervlak volledig is bedekt, zaait u de epitheelcellen van belang voorzichtig in met een concentratie die 100% confluency mogelijk maakt na twee of drie dagen kweek. Indien nodig, drukt u de deksels voorzichtig in met een steriele micropipettip om zweven te voorkomen.

Wanneer de cellen confluency bereiken, vervangt u het supernatant door serumvrij medium voor nog eens 24 uur kweek. Gebruik vervolgens steriele pincetten om voorzichtig een deksel over te brengen naar een nieuwe 10 centimeter plaat met vers serumvrij medium, waarbij u voorzichtig de deksel langs de rand vasthoudt. Om de kunstmatige wonden te creëren, sleept u een gesteriliseerde scheermes terug en vooruit over elk deksel om een drie tot vier millimeter brede dwarslijn over het midden van elk celkweekcentrum te maken om de centrale monolaagstrook volledig te verwijderen.

Zorg ervoor dat u de rand van het scheermes zwaar over het oppervlak van het deksel legt bij het maken van de wond om te beschermen tegen een onregelmatige randvorm en de generatie van flappende epitheelgedeelten. Breng maximaal vier wonddeksels, cellijdzijde omhoog, over in afzonderlijke putjes van een zesputjesplaat, die minimaal twee milliliter serumvrij medium bevatten, en was elk putje twee keer voorzichtig met vers serumvrij medium om eventuele losgekoppelde cellen te verwijderen. Wanneer alle losgekoppelde cellen zijn weggegooid, vervangt u voorzichtig het wasmedium door vers medium dat is aangevuld met de behandelingen van belang, en plaatst u de plaat in de celkweekincubator.

Aan het einde van de geschikte experimentele periode fixeert u de cellen met vier procent formaline in PBS zoals zojuist is gedemonstreerd, en kleur de cellen met de juiste fluorescentie geconjugeerde antilichamen van belang. Beeld vervolgens de structurele veranderingen die optreden bij de migrerende frontrand af door middel van fluorescentiemicroscopie volgens de experimentele parameters van belang. In dit experiment werden de wondspleten gemeten vóór en na behandeling met epidermale groei