Name: Mycobacterium tuberculosis in muizen met verslaggever enzym fluorescentie Imaging (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: Leer optische beeldvorming van muizen geïnfecteerd met Mycobacterium tuberculosis met behulp van reporter enzym fluorescentie. Deze methode maakt gevoelige detectie mogelijk voor onderzoek naar pathogenese en vaccinontwikkeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dierlijke studies werden uitgevoerd overeenkomstig de richtsnoeren en voorschriften uiteengezet door de institutionele Animal Care en gebruik Comité van Texas A & M University. Beoordeling en goedkeuring van een veiligheidsbeambte van biohazard of een Commissie op uw instelling kunnen worden verlangd.
Let op: Alle procedures vereisen BSL3 insluiting. Het personeel zijn verplicht te dragen van persoonlijke beschermingsmiddelen te allen tijde. Alle manipulaties worden uitgevoerd binnen de bioveiligheid kabinet (BSC) en alle slijpsel in sharps containers worden verwijderd. Werken oppervlakken en BSC worden schoongemaakt met gebufferde fenol en 70% ethanol voordat werk en na het werk. Procedures zou normaal moeten gebeuren op bioveiligheidsniveau 3 met Mycobacterium tuberculosis, maar voor illustratie en filmen doeleinden, de auteurs tonen deze procedures op bioveiligheidsniveau 2 met minder virulente bacteriën.
1. de stammen en cultuur voorwaarden
Opmerking: M. tuberculosis -stam CDC1551 wordt gebruikt in deze studie, maar elke M. tuberculosis -stam kan op dezelfde wijze worden gebruikt.
<ol><li>De bacteriën groeien in M-OADC-TW (7H 9 Bouillon aangevuld met 0,5% glycerol, 10% oliezuur dextrose complexe zonder katalase en 0,05% Tween-80) middellange staande bij 37 ° C op een OD600 van 0,5 (~ 0,2 x 107 CFU).</li>
	<li>Verdun de cultuur in de M-OADC-TW (1:10 reeks verdunningen van de bacteriën). Plaat van de verdunningen van de bacteriën (105, 106, 107, 108) in drievoud op selectieve 7 H 11 platen aan het toestaan van de bepaling van de CFU.</li>
	<li>Incubeer de platen gedurende vier weken bij 37 ° C, of totdat de kolonies kunnen nauwkeurig worden geteld.</li>
	<li>Centrifugeer het bacteriële entmateriaal bij 8,534 x g gedurende 5 min te verkrijgen van een pellet. Wassen van de pellet eenmaal met 10 mL zoutoplossing (0,9% NaCl) en resuspendeer de pellet in 15 mL zoutoplossing (0,9% NaCl).</li>
</ol>2. aerosol infectie van muizen met behulp van een kamer van Madison
<ol><li>Kunnen muizen om te acclimatiseren aan de nieuwe omgeving voor een week.</li>
	<li>Weeg de muizen voordat ze worden geladen in de kamer.</li>
	<li>Sluit drie koorden op de stekkerdoos: de belangrijkste kamer macht, de vacuümpomp en de luchtcompressor, in die volgorde.</li>
	<li>Zorgvuldig schroef de glazen pot. Breng van de glazen pot aan het biosafety kabinet en voeg de uitdaging entmateriaal geschorst in 15 mL zoutoplossing (0,9% NaCl) te bereiken ~ 104 - 106 CFU van bacteriën in de longen.</li>
	<li>Sluit het deksel van de glazen pot in het biosafety kabinet. Koppelen van de pot aan de vernevelaar eenheid en aanpassen van de verticale roestvast stalen buis, zodat de onderkant (inname) ongeveer een kwart inch onder het niveau van de vloeistof in de pot is.</li>
	<li>Laden van alle dieren die nodig zijn voor het experiment (de vergaderzaal kan bevatten maximaal 90 muizen) in de kamer en alle sloten op de deur te sluiten.</li>
	<li>Controleer de belangrijkste (kamer) lucht flowmeter. Zorgen dat het midden van de float (bal) ongeveer 50 L/min loopt, gemeten op de schaal aan de linkerkant.</li>
	<li>Druk op startknop op het bedieningspaneel van de kamer. Stelt het tarief van de luchtstroom door de compressor luchtstroommeter (de kleinere meter aan de linkerkant) 4 L/min op de schaal. Controleer visueel om ervoor te zorgen dat de uitdaging entmateriaal is wordt nebulized.</li>
	<li>Na 15 min, als het rode lampje op de voorkant van het Configuratiescherm wordt weergegeven, maar een akoestisch signaal geeft aan het einde van de termijn, drukt u op Reset-knop op de rechter benedenhoek van het deelvenster Beheer om te resetten de timers.</li>
	<li>Houdt u de kleine rode knop op de deur van de kamer vrij te geven van het vacuüm.</li>
	<li>Open de deur van de kamer en verwijderen van de dieren. Plaats de muizen terug in hun kooi.</li>
	<li>Verwijder de vernevelaar glazen pot en plaats in een verzegelde, lekvrije transport container. Plaats de container in de kast van de bioveiligheid en gooi de opschorting van de uitdaging in een aangewezen afval container.</li>
	<li>Plaats de gebruikte vernevelaar pot in de zak van een biohazard en sluit de zak voor transport naar de autoclaaf.</li>
	<li>Aan het einde van de procedure van de infectie, spray de binnenzijde van de kamer met de gebufferde fenol en 70% ethanol en laat de kamer om te zitten voor 10 minuten.</li>
	<li>Vervolgens veeg beneden alle toegankelijke inwendige oppervlakken grondig. Verwijdering van alle besmette papieren handdoeken, enz. in de Prullenbak van biohazard. Autoclaaf de Prullenbak, afvalcontainer en gebruikt de vernevelaar potten.</li>
	<li>Plaats de dieren terug in de kamer van de inperking tot het imaging tijd-punt.</li>
	<li>Op de dag voor imaging, door de dieren in een secundaire container te overbrengen in de beeldvorming kamer.</li>
</ol>3. dierlijke anesthesie
<ol><li>Anesthetize de muizen met Isofluraan met behulp van een aangepaste gas-anesthesie-systeem.</li>
	<li>Wegen elk van de twee houtskool filter busje dat zich bevindt boven de eenheid van de verdoving.</li>
	<li>Vervangen door een nieuwe bus als het gewicht 50 g boven het begingewicht is.</li>
	<li>Controleer de vaporizer-eenheid om te zorgen voor voldoende Isofluraan voor de procedure.</li>
	<li>Plaats de neus houder binnen de imaging kamer. Plaats het aantal kegels van de neus nodig zijn voor de procedure en verzegel de resterende openingen met de neus-blokkers.</li>
	<li>Zet de zuurstofvoorziening van de hoge druk cilinder en stel deze in op 55 psi.</li>
	<li>Zet de pomp van de evacuatie gelegen tegenover de verdoving eenheid en stel deze in op 8 L/min.</li>
	<li>De knevel van de zuurstof gelegen tegenover de verdoving eenheid inschakelen.</li>
	<li>Inschakelen van de gasstroom in de anesthesie inductie zaal tot verrekening de stroom van gas bij 1,5 L/min. beurt de gasstroom.</li>
	<li>Inschakelen van de gasstroom in de beeldvorming zaal tot verrekening de stroom van gas bij 0,25 L/min. beurt de gasstroom.</li>
	<li>Zet de vaporizer Isofluraan en instellen op 2-2,5%. Pas het niveau van de Isofluraan volgens het aantal en het gewicht van de dieren wordt gebruikt voor het experiment door het draaien van het wiel op de Isofluraan vaporisator (2-2,5% voor een muis met een gewicht van ~ 20 g; 4% voor een cavia met een gewicht van 300 g).</li>
	<li>Plaats van de muizen in de anesthesie-zaal en sluit het deksel. Inschakelen van de gasstroom in de anesthesie-inductie-zaal.</li>
	<li>Laat de muizen in de anesthesie inductie kamer voor 5-10 min tot volledig verdoofd.</li>
	<li>Zodra de muizen zijn verdoofd, gelden een optische zalf voor de ogen om hen te beschermen terwijl imaging.</li>
	<li>Plaats de muizen in ventrale of sternale lighouding, zodanig dat hun neus in de neus te vergemakkelijken van verdoving van muizen tijdens de imaging procedure worden geplaatst.</li>
</ol>4. verslaggever enzym fluorescentie (REF) imaging
<ol><li>Injecteer het substraat (20 µM, 2, 5 µL/g van gewicht) door intraperitoneale injectie in de besmette, alsmede de controle muizen. De muizen zijn onder verdoving binnen de imaging kamer voor minder dan 1 min.</li>
	<li>Het imaging systeem gestart.</li>
	<li>Initialiseer het systeem door te klikken op initialiseren. Wacht totdat de temperatuur bar op groen draait. Opmerking: De imaging kamer bestaat uit een verwarmd platform te handhaven van de lichaamstemperatuur van het dier terwijl imaging.</li>
	<li>Voor imaging-overname instelling, selecteer TL | Trans-verlichting voor het hele dier of Epi-verlichting voor weefsels van de longen, structuur en Overlay in het Configuratiescherm van de overname.</li>
	<li>Gezichtsveld naar B voor enkele muis en lamp op hoog niveau instellen.</li>
	<li>Belichtingstijd ingesteld op auto, middellange weggooien, 2-3 voor de f/stop en excitatie filter op 745 nm en emissie filters van 780 nm tot 840 nm.</li>
	<li>Voor de installatie van de reeks, klik op reeks Setup, selecteert u van 9-12 Trans-verlichting punten op het gebied van de longen.</li>
	<li>Klik op Acquire voor Beeldacquisitie.</li>
	<li>Plaats de muis terug in de kooi na beeldvorming.</li>
	<li>Controleer de muizen tot volledig hersteld of offeren voor het kwantificeren van CFU als imaging op een tijd-punt van het experiment. Het uitvoeren van een gemodificeerde Karnofsky-score voor het controleren van het welzijn van muizen post imaging.</li>
</ol>5. analyse van REF imaging
<ol><li>De imaging software niet openen.</li>
	<li>Laden image bestanden door te klikken op het pictogram van de bladeren.</li>
	<li>Spectrale randverwijdering, klik op spectrale Unmixing in het hulpprogramma palet en klik op de spectra die nodig is om te unmix. Klik op start randverwijdering.</li>
	<li>Optische oppervlakte wederopbouw, klikt u op op de topografie van het oppervlak.</li>
	<li>Selecteer oriëntatie aan dorsale, onder voorbehoud van bont muis en klik op Generate oppervlak.</li>
	<li>Afbeelding bijsnijden tekenen en afbeelding van de drempel voor een gebied van belang in te stellen. Klik op gereed.</li>
	<li>Voor orgel registratie, ga naar het tabblad van de registratie in 3D optische Tools dropdown-menu.</li>
	<li>Registreren van organen van belang in een atlas orgel.</li>
	<li>Orgel grootte of locatie aan de gegenereerde oppervlakte topografie met transformatiegereedschap gelegen in-/ uitschakelen op de instrumenten paneel-registratie aanpassen.</li>
	<li>Ga naar fluorescerende tomografie (FLADDEREN) 3D reconstructie, en selecteer analyseren tab. Selecteer de beelden worden opgenomen voor de analyse, image type genormaliseerd transmissie fluorescentie (NTF) efficiëntie, klikt u op Start.</li>
	<li>Controleer op Alles selecteren en reconstrueren in gegevensvoorbeeld tabblad.</li>
	<li>Voor fluorescentie kwantificering, ga naar regio van belang (ROI) hulpmiddelen, ROI kubus toevoegen aan het orgaan van belang en aanpassen van de kubus grootte ter dekking van het orgel van belang. Klik op 3D ROIs meten.</li>
	<li>In de ROI metingen venster, ga naar 3D-metingen van de ROI, selecteer gegevenstype brontoestel voor voxels en metingen tot pmolM-1cm-1.</li>
	<li>Opslaan en/of het resultaat van FLIT 3D reconstructie analyse exporteren naar een figuur of gegevens bestand.</li>
</ol>6. kwantificering van bacteriën door CFU
<ol><li>Euthanaseren de muizen door intraperitoneale injectie van 0,1 mL pentobarbital natrium (390 mg/mL).</li>
	<li>Selectievakje voor pedaal reflex door uitknijpen de stootkussens van de voeten van muizen om ervoor te zorgen er is geen reflex reactie.</li>
	<li>Het longweefsel van de muizen met behulp van steriele Tang en schaar explant. Meng het longweefsel in 1 mL 1 x-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).</li>
	<li>Maak 10-fold seriële verdunningen van het homogenaat longkanker in steriele 1 x PBS.</li>
	<li>Voor de beplating, ter plaatse drie aliquots van 20 µL van de respectieve verdunning op de agarplaat.</li>
	<li>Incubeer de platen in een incubator bij 37 ° C en monitor voor bacteriële groei.</li>
	<li>Graaf de koloniën in elk ter plaatse na de incubatietijd en uitdrukken als CFU / mL door te corrigeren voor volume en verdunning met behulp van de volgende vergelijking: CFU / mL (C/V) = x M Waar C = kolonie tellingen per plek, V = volume van monster geënt op elke plaat (mL), en M = vermenigvuldigingsfactor (reciproke van de verdunning gebruikt). Opmerking: Als 11 kolonies worden geteld op een plek voor een monstervolume van 0,002 mL bij een monsterverdunning 10-4, met behulp van de vergelijking, de Telling kolonies bij berekend als (11/0.02) x 104 = 5.5 x 106 CFU / mL</li>
</ol>

<ol><li>Lewinson, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Official+American+thoracic+society%2Finfectious+diseases+society+of+America%2F+centers+for+disease+control+and+prevention+clinical+practice+guidelines%3A+diagnosis+of+tuberculosis+in+adults+and+children%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Official American thoracic society/infectious diseases society of America/ centers for disease control and prevention clinical practice guidelines: diagnosis of tuberculosis in adults and children.</a> Clin Infect Dis. 64 (2), 1-33 (2017).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensititre+MYCOTB+MIC+plate+for+testing+Mycobacterium+tuberculosis+susceptibility+to+first-+and+second-line+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Ch%22%5BJournal%5D)">Sensititre MYCOTB MIC plate for testing Mycobacterium tuberculosis susceptibility to first- and second-line drugs.</a> Antimicrob Agents Ch. 58 (1), 11-18 (2014).</li>
<li>Dheda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epidemiology%2C+pathogenesis%2C+transmission%2C+diagnosis%2C+and+management+of+multidrug-resistant%2C+extensively+drug-resistant%2C+and+incurable+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Resp+Med%22%5BJournal%5D)">The epidemiology, pathogenesis, transmission, diagnosis, and management of multidrug-resistant, extensively drug-resistant, and incurable tuberculosis.</a> Lancet Resp Med. 5 (4), 291-360 (2017).</li>
<li>Behr, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+of+Mycobacterium+tuberculosis+from+patients+smear-negative+for+acid-fast+bacilli%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Transmission of Mycobacterium tuberculosis from patients smear-negative for acid-fast bacilli.</a> Lancet. 353 (9151), 444-449 (1999).</li>
<li>Cruz, A. T., Revell, P. A., Starke, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastric+aspirate+yield+for+children+with+suspected+pulmonary+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pediatric+Infect+Dis+Soc%22%5BJournal%5D)">Gastric aspirate yield for children with suspected pulmonary tuberculosis.</a> J Pediatric Infect Dis Soc. 2 (2), 171-174 (2013).</li>
<li>Monkongdee, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yield+of+acid-fast+smear+and+mycobacterial+culture+for+tuberculosis+diagnosis+in+people+with+human+immunodeficiency+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Resp+Crit+Care%22%5BJournal%5D)">Yield of acid-fast smear and mycobacterial culture for tuberculosis diagnosis in people with human immunodeficiency virus.</a> Am J Resp Crit Care. 180, 903-908 (2009).</li>
<li>Karstaedt, A. S., Jones, N., Crewe-Brown, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bacteriology+of+pulmonary+tuberculosis+in+a+population+with+high+human+immunodeficiency+virus+seroprevalence%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Tuberc+Lung+D%22%5BJournal%5D)">The bacteriology of pulmonary tuberculosis in a population with high human immunodeficiency virus seroprevalence.</a> Int J Tuberc Lung D. 2 (4), 312-316 (1998).</li>
<li>Yang, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+Mycobacterium+tuberculosis%2C+using+a+novel+near-infrared+fluorescent+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of Mycobacterium tuberculosis, using a novel near-infrared fluorescent substrate.</a> J Infect Dis. 215 (3), 405-414 (2017).</li>
<li>Nooshabadi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+excitation+increases+detection+sensivity+for+pulmonary+tuberculosis+by+whole-body+imaging+with+%CE%B2-lactamase+reporter+enzyme+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Intravital excitation increases detection sensivity for pulmonary tuberculosis by whole-body imaging with β-lactamase reporter enzyme fluorescence.</a> J Biophotonics. , (2016).</li>
<li>Chang, M. H., Cirillo, S. L. G., Cirillo, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+luciferase+to+image+bacterial+infections+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Using luciferase to image bacterial infections in mice.</a> J Vis Exp. (48), (2011).</li>
<li>Kong, Y., Subbian, S., Cirillo, S. L. G., Cirillo, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+optical+imaging+to+study+of+extrapulmonary+spread+by+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Tuberculosis%22%5BJournal%5D)">Application of optical imaging to study of extrapulmonary spread by tuberculosis.</a> Tuberculosis. 89 (1), 15-17 (2009).</li>
<li>Andreu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+in+vivo+assessment+of+drug+efficacy+against+Mycobacterium+tuberculosis+using+an+improved+firefly+luciferase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemoth%22%5BJournal%5D)">Rapid in vivo assessment of drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis using an improved firefly luciferase.</a> J Antimicrob Chemoth. 68 (9), 2118-2127 (2013).</li>
<li>Andreu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimisation+of+bioluminescent+reporters+for+use+with+Mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Optimisation of bioluminescent reporters for use with Mycobacteria.</a> PLoS ONE. 5 (5), 10777(2010).</li>
<li>Nooshabadi, F., Yang, H. Y., Bixler, J. N., Kong, Y., Cirillo, J. D., Maitland, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+fluorescence+excitation+in+whole-animal+optical+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Intravital fluorescence excitation in whole-animal optical imaging.</a> PLoS ONE. 11 (2), 0149932(2016).</li>
<li>Bixler, J. N., Kong, Y., Cirillo, J. D., Matiland, K. C. <a target="_blank" href="https://www.spiedigitallibrary.org/conference-proceedings-of-spie/8565/1/Multi-scale-fluorescence-imaging-of-bacterial-infections-in-animal-models/10.1117/12.2004690.short">Multi-scale fluorescence imaging of bacterial infections in animal models.</a> Proc. SPIE 8565, Photonic Therapeut Diagnos IX. , 856537(2013).</li>
<li>Mufti, N., Kong, Y., Cirillo, J. D., Maitland, K. C. <a target="_blank" href="http://spie.org/Publications/Proceedings/Paper/10.1117/12.896553">Detection of bacterial infection with a fiber optic microendoscope.</a> Proc. SPIE 8092, Med Laser Appl Laser-tissue Interac V. , 80920A(2011).</li>
<li>Zelmer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+in+vivo+model+to+test+anti-tuberculosis+drugs+using+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemoth%22%5BJournal%5D)">A new in vivo model to test anti-tuberculosis drugs using fluorescence imaging.</a> J Antimicrob Chemoth. 67 (8), 1948-1960 (2012).</li>
<li>Yang, D., Ding, F., Mitachi, K., Kurosu, M., Lee, R. E., Kong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescent+probe+for+detecting+Mycobacterium+tuberculosis+and+identifying+genes+critical+for+cell+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A fluorescent probe for detecting Mycobacterium tuberculosis and identifying genes critical for cell entry.</a> Front. Microbiol. 7, (2016).</li>
<li>Ordonez, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Model+of+pulmonary+cavitary+tuberculosis+and+expression+of+matrix+metalloproteinase-9%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Mouse Model of pulmonary cavitary tuberculosis and expression of matrix metalloproteinase-9.</a> Dis Model Mech. 9, 778-779 (2016).</li>
<li>Mills, B., Bradley, M., Dhaliwal, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+bacterial+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Transl+Imaging%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of bacterial infections.</a> Clin Transl Imaging. 4, 163-174 (2016).</li>
<li>Calderon, V., Valbuena, G., Goez, Y., Endlsey, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+humanized+mouse+model+of+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A humanized mouse model of tuberculosis.</a> PLoS ONE. 8 (5), 63331(2013).</li>
<li>Vergne, I., Chua, J., Lee, H. H., Lucas, M., Belisle, J., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+phagolysosome+biogenesis+block+by+viable+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+Usa%22%5BJournal%5D)">Mechanism of phagolysosome biogenesis block by viable Mycobacterium tuberculosis.</a> P Natl Acad Sci Usa. 102 (11), 4033-4038 (2004).</li>
<li>Kong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+tuberculosis+with+endogenous+%CE%B2-+lactamase+reporter+enzyme+fluorescent+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+Usa%22%5BJournal%5D)">Imaging tuberculosis with endogenous β- lactamase reporter enzyme fluorescent in live mice.</a> P Natl Acad Sci Usa. 107 (27), 12239-12244 (2010).</li>
<li>Kong, Y., Cirillo, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reporter+enzyme+fluorescence+%28REF%29+imaging+and+quantification+of+tuberculosis+in+live+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">Reporter enzyme fluorescence (REF) imaging and quantification of tuberculosis in live animals.</a> Virulence. 1 (6), 558-622 (2010).</li>
<li>Skoura, E., ZumLa, A., Bomanji, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+in+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Imaging in tuberculosis.</a> Int J Infect Dis. 32, 87-93 (2015).</li>
<li>Lee, K. S., Im, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CT+in+adults+with+tuberculosis+of+the+chest%3A+characteristic+findings+and+role+in+management%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Roentgenol%22%5BJournal%5D)">CT in adults with tuberculosis of the chest: characteristic findings and role in management.</a> Am J Roentgenol. 164, 1361-1367 (1995).</li>
<li>Hoffman, E. B., Crosier, J. H., Cremin, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+in+children+with+spinal+tuberculosis.+A+comparison+of+radiography%2C+computed+tomography+and+magnetic+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Joint+Surg+Br%22%5BJournal%5D)">Imaging in children with spinal tuberculosis. A comparison of radiography, computed tomography and magnetic resonance imaging.</a> J Bone Joint Surg Br. 75 (2), 233-239 (1993).</li>
<li>Soussan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+pulmonary+tuberculosis+on+FDG-PET%2FCT%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Radiol%22%5BJournal%5D)">Patterns of pulmonary tuberculosis on FDG-PET/CT.</a> Eur J Radiol. 81 (10), 2872-2876 (2012).</li>
<li>Sule, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+directions+using+reporter+enzyme+fluorescence+%28REF%29+as+a+tuberculosis+diagnostic+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Tuberculosis%22%5BJournal%5D)">New directions using reporter enzyme fluorescence (REF) as a tuberculosis diagnostic platform.</a> Tuberculosis. 101, 78-82 (2016).</li>
<li>Heuts, F., Carow, B., Wigzell, H., Rottenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+non-invasive+bioluminescent+imaging+to+assess+mycobacterial+dissemination+in+mice%2C+treatment+with+bactericidal+drugs+and+protective+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">Use of non-invasive bioluminescent imaging to assess mycobacterial dissemination in mice, treatment with bactericidal drugs and protective immunity.</a> Microbes Infect. 11 (14-15), 1114-1121 (2009).</li>
<li>Kong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+fluorescent+protein+expressing+strains+to+evaluation+of+anti-tuberculosis+therapeutic+efficacy+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Application of fluorescent protein expressing strains to evaluation of anti-tuberculosis therapeutic efficacy in vitro and in vivo.</a> PLoS ONE. 11 (3), 0149972(2016).</li>
<li>Xie, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+point-of-care+detection+of+the+tuberculosis+pathogen+using+a+BlaC-specific+fluorogenic+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chem%22%5BJournal%5D)">Rapid point-of-care detection of the tuberculosis pathogen using a BlaC-specific fluorogenic probe.</a> Nature Chem. 4, 802-809 (2012).</li>
<li>Nooshabadi, F., et al. <a target="_blank" href="https://www.spiedigitallibrary.org/conference-proceedings-of-spie/9715/1/Whole-animal-imaging-of-bacterial-infection-using-endoscopic-excitation-of/10.1117/12.2213820.short">Whole-animal imaging of bacterial infection using endoscopic excitation of β-lactamase (BlaC)- specific fluorogenic probe.</a> Proc SPIE. 9715, 97150(2016).</li>
<li>Ghiasi, M., Pande, T., Pai, M. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s40475-015-0043-1">Advances in tuberculosis diagnostics.</a> Curr Trop Med Rep. 2 (2), 54-61 (2015).</li>
<li>Rao, J., Andrasi, A. D., Yao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+imaging+in+vivo%3A+recent+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotech%22%5BJournal%5D)">Fluorescence imaging in vivo: recent advances.</a> Curr Opin Biotech. 18 (1), 17-25 (2007).</li>
<li>Marshall, M. V., Draney, D., Sevick-Muraca, E. M., Olive, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-dose+intravenous+toxicity+study+of+IRDye+800CW+in+Sprague-Dawley+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Imaging+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-dose intravenous toxicity study of IRDye 800CW in Sprague-Dawley rats.</a> Mol Imaging Biol. 12 (6), 583-594 (2010).</li>
<li>Zhan, L., Tang, J., Sun, M., Qin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+for+tuberculosis+in+translational+and+precision+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Animal models for tuberculosis in translational and precision medicine.</a> Front Microbiol. 8, 717(2017).</li>
<li>2,7-disubstituted cephalosporin derivatives as beta-lactamase substrates and methods for their use for the diagnosis of tuberculosis. US patent. , 20150219653 A1 (2015).</li>
<li>Shao, Q., Zheng, Y., Dong, X., Tang, K., Yan, X., Xing, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Covalent+Reporter+of+%CE%B2-Lactamase+Activity+for+Fluorescent+Imaging+and+Rapid+Screening+of+Antibiotic-Resistant+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Eur+J%22%5BJournal%5D)">A Covalent Reporter of β-Lactamase Activity for Fluorescent Imaging and Rapid Screening of Antibiotic-Resistant Bacteria.</a> Chem Eur J. 19 (33), 10903-10910 (2013).</li>
<li>Li, L., Li, Z., Shi, W., Li, X., Ma, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+and+Selective+Near-Infrared+Fluorescent+Off-On+Probe+and+Its+Application+to+Imaging+Different+Levels+of+%CE%B2-Lactamase+in+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Sensitive and Selective Near-Infrared Fluorescent Off-On Probe and Its Application to Imaging Different Levels of β-Lactamase in Staphylococcus aureus.</a> Anal Chem. 86 (12), 6115-6120 (2014).</li>
<li>Ashizawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coexistence+of+lung+cancer+and+tuberculoma+in+the+same+lesion%3A+demonstration+by+high+resolution+and+contrast-enhanced+dynamic+CT%5BTitle%5D)+AND+%22BRIT+J+RADIOL%22%5BJournal%5D)">Coexistence of lung cancer and tuberculoma in the same lesion: demonstration by high resolution and contrast-enhanced dynamic CT.</a> BRIT J RADIOL. 77 (923), 959-962 (2004).</li>
<li>Figueroa, C. J., Riedel, E., Glickman, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+radiographic+differentiation+of+lung+nodules+caused+by+mycobacteria+and+lung+cancer%3A+a+case-control+study%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Clinical and radiographic differentiation of lung nodules caused by mycobacteria and lung cancer: a case-control study.</a> BMC Infect Dis. 15 (482), (2015).</li>
</ol>

Bij het gebruik van beeldvormende technieken, zoals REF, zijn er belangrijke strategieën waarmee generatie van robuuste en consistente gegevens. Optische beeldvorming produceert verstrooide licht in weefsels die invloed op de diepte van penetratie, hebben kan omdat het moeilijk is om vast te leggen in alle richtingen uitgestraalde licht. Gebruik van een in de omgeving van fluorophore voor infra-rood (NIR) substraat voor REF imaging met een golflengte van excitatie en emissie in de Querange van 700-900 nm vergemakkelijkt minimale absorptie van het fluorescerende signaal door zoogdieren weefsels. Het aangepaste ontworpen substraat werd gebouwd door een NIR fluorophore, IRDye 800Cw te koppelen aan een quencher, IRDye QC-1, door een lactam ring waardoor fluorescentie resonantie energie overdracht gebaseerde blussen. IRDye heeft uitstekende weefsel penetratie en licht verstrooiing kenmerken en hoeft niet elke duidelijk schadelijk effect hebben op zoogdieren36, geruimd uit het bloed en de organen door 24 h. fluorescentie signaal aanzienlijk verhoogt 4 uur na het begin substraat-beheer, niveau bereiken van maximaal 6 uur na toediening.
De bacteriële infectieuze dosis, wijze van toediening van de infectieuze dosis en het substraat evenals tijd-punten van post-infectie door uit te voeren pilotstudies imaging moet worden gestandaardiseerd alvorens op grote, complexe, experimenten. Pilotstudies kunnen de tijd en kosten sterk te verminderen wanneer een groot aantal dieren imaging omdat een standaardprocedure voorafgaand aan bezig met de belangrijkste experiment kan worden geoptimaliseerd. Bacteriële belasting moeten worden bepaald in de organen/weefsels van belang na hele lichaam geschikt zijn met behulp van trans-verlichting en ex vivo Long geschikt zijn met behulp van epi-verlichting om te valideren van de bron van het signaal en bepalen de kwaliteit van de correlatie met bacteriële aantallen aanwezig8. Pilotstudies geven inzicht in de drempel van detectie, dynamisch bereik van de techniek alsmede de bepaling van de optimale proefomstandigheden voor imaging.
De belangrijkste voordelen van het gebruik van REF imaging als vergeleken met andere TL en bioluminescente strategieën zijn de hoge gevoeligheid en het vermogen om het imago van natuurlijke M. tuberculosis stammen. REF imaging maakt gebruik van het catalytically robuuste enzym zwart die is bewaard in alle klinische M. tuberculosis -isolaten en tuberculose-complex stammen. De grote gevoeligheid van REF imaging is te wijten aan het snelle katalytische tempo van zwart in combinatie met behoud van het gekloofd fluorescerende product door de gastheercel. Signaal voortdurend toeneemt zolang het substraat is beschikbaar waardoor vrijwel onbeperkt opbouw van het signaal binnen de geïnfecteerde cellen en weefsels. Deze verhoogde gevoeligheid voor REF imaging in vergelijking met alternatieve benaderingen voor imaging kunt specifieke detectie van M. tuberculosis beide in vitro en in vivo8,23,24, 29.
REF imaging kan worden gebruikt voor de detectie van bacteriële zonder genetische modificaties waardoor haar directe toepassing op elke infectie model, ofwel laboratorium dieren8,37 of menselijke klinische materialen29,38 . REF kan worden gebruikt voor het opsporen en het beeld van een breed scala aan pathogenen39,40, aangezien fluorogenic substraten kunnen worden ontwikkeld voor talrijke enzymatische doelen dan zwart zoals proteasen, kinases, ureases en β-galactosidases. Echter zorgvuldig moet worden nagedacht over de doelstelling om ervoor te zorgen het toont optimale kenmerken voor imaging. Zwart vertegenwoordigt een goed model enzym voor kenmerken die voor succesvolle toepassing van deze strategie zorgt. REF imaging biedt een directe uitlezing op bacteriële verontreiniging aanwezig zijn in de longen tijdens infecties, waardoor aanzienlijk sneller vooruitgang in onderzoek naar tuberculose pathogenese, aangezien de vaststelling van bacteriële aantallen vereist gewoonlijk drie tot zes weken, maar zelfs in meer snel groeiende organismen deze aanpak veel bespaart tijd. REF kan ook worden gebruikt om te discrimineren carcinomen van tuberculose, een kernprobleem in diagnose van nodulair laesies in patiënten41,42. REF fungeert als een nieuwe tool om te versnellen translationeel tuberculose imaging en kan zelfs worden toegepast voor de mens, potentieel waardoor snelle voorspelling van therapeutische resultaten.

De trage groei van M. tuberculosis is een grote wegversperring in snelle diagnose voor tuberculose1,2,3. Terwijl cultuur gebaseerd diagnose duurt weken tot resultaten leidt, heeft de zuurvaste uitstrijkje diagnostische beperkingen4 in kinderen5 en co met76,humaan immunodeficiëntie virus besmette patiënten. Optische beeldtechnologieën zijn onlangs bekroond als alternatief voor traditionele diagnosemethoden voor tuberculose8,9. Fluorescentie en bioluminescentie kunnen worden gebruikt om het beeld optisch M. tuberculosis in levende dieren in real-time10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19. Optische beeldvorming heeft het voordeel van een snelle en specifieke beoordeling van een infectie met M. tuberculosis20,21,22.
We schetsen details voor optische beeldvorming van M. tuberculosis in levende muizen met behulp van REF. Deze methode is zeer specifieke en gevoelige23,24 en vergelijkbaar met andere optische methoden, minder duur dan andere methoden van tuberculose (TB)25, met inbegrip van computertomografie (CT)26, magnetische imaging resonantie imaging (MRI)27, en F-fluorodeoxyglucose positron emissie tomografie/CT (F-FDG PET/CT)28. REF maakt gebruik van aangepaste TL of bioluminescente substraten die op decolleté door een bacteriële enzym, produceren een fluorescerende product8,29. Vandaar, het heeft het voordeel van niet vereist een recombinant mycobacteriële verslaggever stam30,31. Het substraat van de FRET beschreven bestaat uit een fluorescerende en een quencher verbonden door een β-lactam-ring die wordt gehydrolyseerd door zwart (β-lactamase), natuurlijk constitutively uitgedrukt door tuberculose-complexe Mycobacterium8, 32. de bacteriën direct genereren signaal als gevolg van REF katalytische activiteit waarmee versterking door vele ordes van grootte en gevoelige detectie van M. tuberculosis.
De REF substraat gebruikt in deze studie heeft uitstekende weefsel penetratie in levende dieren en verminderde achtergrond als gevolg van zijn lange golflengte. Met dit lang-golflengte substraat is het mogelijk om een drempel van detectie van M. tuberculosis van bijna 100 kolonievormende eenheden (kve) in vitro en < 1000 kve in de longen van muizen in vivo (hele dieren)8, 33. REF kan worden gebruikt als een diagnostisch hulpprogramma voor sputum, klinische materialen en zelfs direct bij patiënten met micro Endoscopische systemen16,32,33,34 vanwege haar hoge gevoeligheid en specificiteit. REF kan worden toegepast op elke klinische tuberculose-stam, omdat het gebruik maakt van een natuurlijk geproduceerd bacteriële enzym, zwart, voor de detectie in alle stammen aanwezig. Deze kenmerken maken REF imaging een waardevol instrument in de pre-klinische tuberculose-onderzoek in het algemeen om therapeutische, evenals vaccin evaluatie en analyse van pathogenese, maar uiteindelijk ook kunnen worden toegepast op diagnose in tuberculose patiënten.

<table><tbody><tr><td>Isofluraan</td><td>VETONE</td><td>501027</td><td></td></tr><tr><td>CNIR800</td><td>Op maat gemaakt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fatal Plus oplossing</td><td>Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>7H9 Middlebrook bouillon</td><td>BD</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>OADC Middlebrook verrijking</td><td>BD</td><td>212351</td><td></td></tr><tr><td>Sporcidin</td><td></td><td>RE-1284F</td><td></td></tr><tr><td>7H11 Middlebrook Agar</td><td>BD</td><td>212203</td><td></td></tr><tr><td>Madison Chamber</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IVIS Spectrum</td><td>Perkin Elmer</td><td>124262</td><td></td></tr><tr><td>XGI-8-gasanesthesiesysteem</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Living Imaging software</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transparante neuskokers</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>M. tuberculosis stam CDC1551</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vrouwelijke BALB/C muizen, 5-7 weken</td><td>Jackson Laboratory</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mycobacterium tuberculosis in muizen met verslaggever enzym fluorescentie imaging

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Verslaggever enzym fluorescentie (REF) maakt gebruik van substraten die specifiek voor enzymen aanwezig in de doelsoort behorende organismen van belang voor de beeldvorming of detectie door fluorescentie- of bioluminescentie zijn. We gebruik maken van zwart, een enzym constitutively uitgedrukt door alle M. tuberculosis stammen. REF kunt snelle kwantificering van bacteriën in de longen van geïnfecteerde muizen. Dezelfde groep van muizen kan op vele punten van de tijd, sterk verminderen van kosten, opsommen van bacteriën sneller, waardoor nieuwe opmerkingen in gastheer-pathogeen interacties en de intensivering statistisch onderscheidingsvermogen, aangezien meer dieren per groep worden gemakkelijk onderhouden worden beeld . REF is uiterst gevoelig het katalytische karakter van de enzymatische verslaggever van zwart en specifieke als gevolg van de aangepaste flourescence resonantie energieoverdracht (FRET) of fluorogenic substraten gebruikt. REF vereist geen recombinante stammen, waarborgen van de normale gastheer-pathogeen interacties. We beschrijven de beeldvorming van M. tuberculose -infectie met behulp van een FRET substraat met maximale emissie bij 800 nm. De golflengte van het substraat kan gevoelige diepe weefsel imaging in zoogdieren. We zal aërosol infectie van muizen met M. tuberculosis, verdoving van muizen, beheer van de REF substraat en optische beeldvorming schetsen. Deze methode is met succes toegepast bij de evaluatie van de gastheer-pathogeen interacties en de werkzaamheid van antibiotica targeting van M. tuberculosis.

REF beeldvorming van muizen geïnfecteerd met M. tuberculosis samen met niet-geïnfecteerde controle muis worden weergegeven in Figuur 1A. De besmette muizen geproduceerd een significant (P = 0.0057) hogere fluorescentie signaal uit de longen op 6 weken na infectie in vergelijking met controle op substraat administratie. Een typische tijdsverloop te bestuderen van de therapeutische werkzaamheid tegen M. tuberculosis met behulp van REF kon worden denkbaar ter week 1, 2, 4, 6, 15, 24 na infectie. Intensiteit van de fluorescentie is gekwantificeerd aan de hand van epi-verlichting voor weefsels van de longen (Figuur 1B). Het voortdurend toenemende signaal van week 2 week 6 in longen van geïnfecteerde muizen suggereert dat REF met succes kundig voor speurder van M. tuberculosis in vivo. Een daling van het signaal van de achtergrond van het besturingselement muizen op een later tijdstip (Figuur 1B) kan worden toegeschreven aan de stijging van het lichaam massa en volume van muizen gedurende een periode van 6 weken en vermindert aldus de excitatie golflengte penetratie. 3D FLIT reconstructie van fluorescentie bronnen in muizen die geïnfecteerd met M. tuberculosis wordt weergegeven in Figuur 2. De afbeeldingsreeksen zijn verworven op meerdere punten van de trans-verlichting in muis met dezelfde excitatie en aantal emissie filters. Deze afbeeldingsreeksen worden vervolgens gebruikt voor 3D FLIT wederopbouw voor fluorescerende bron distributie binnen de dierlijke onderwerp. Figuur 2 A-D toont de verschillende richtingen (coronale, Sagittaal en transaxial) van muis tomografie met longkanker orgel registratie. NTF efficiëntie kaarten voor de controle op de kwaliteit van de wederopbouw in Figuur 2Ezijn vertegenwoordigd. NTF kunt aftrekken van de achtergrond lichte lekkage van trans-verlichting beelden door een extra beeld gevangen met filter met neutrale dichtheid. De foto genomen met de specifieke excitatie-filter (Figuur 2E-gemeten) is genormaliseerd naar het beeld van de transmissie gemeten met de dezelfde emissie-filter en een open excitatie-filter (Figuur 2E - gesimuleerd) te geven het signaal dat geproduceerd door het substraat alleen. De vergelijkbare gemeten en gesimuleerd NTF efficiëntie profiel in zowel de horizontale (Figuur 2F) en verticale (Figuur 2G) profielen met bijna 0% percentage fout (Figuur 2E-% fout) levert het bewijs van een goede kwaliteit 3D reconstructie met verminderde artefacten en verbeterde signaal lokalisatie en gevoeligheid.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56801/56801fig1.jpg"> Figuur 1 . Imaging van M. tuberculosis met REF. (A) in vivo imaging van muizen niet-geïnfecteerde en besmet met M. tuberculosis op 2, 4 en 6 weken na infectie. De kleurenbalk vertegenwoordigt de intensiteit van het fluorescerende signaal in fotonen per seconde per cm2 van laag (geel) op hoog (rood). (B) de kwantificering van de intensiteit van de fluorescentie van muizen geïnfecteerd met M. tuberculosis. Fluorescentie waarden voor zowel controle (zwart) en besmette (rood) zijn vertegenwoordigd, samen met de standaardfout voor elk punt van de tijd. De betekenis van de resultaten werd bepaald door studenten, t-testen, p -waarden van < 0,05 significant werden beschouwd. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56801/56801fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56801/56801fig2.jpg"> Figuur 2 . 3D reconstructie van het FLIT voor fluorescentie sources in muizen die geïnfecteerd met M. tuberculosis. Muis tomografie vertegenwoordigd in verschillende richtingen; A) coronale, B) Sagittaal, en C) transaxial met D) Long orgel registratie. De 3D regio van belang (ROI) wordt weergegeven als een rode kubus in de longen voor metingen van de bron. (E) NTF efficiëntie kaarten van de gemeten en gesimuleerde voor kwaliteitscontrole van de wederopbouw. Het gemeten en gesimuleerde NTF efficiëntie profiel werd vergeleken, bieden goede kwaliteit van 3D reconstructie (soortgelijke gemeten en gesimuleerde NTF efficiëntie). Horizontale F) en G) verticale signaal profielen vertegenwoordigen gemeten (blauw) en gesimuleerde (rode) NTF efficiëntie curve. De horizontale en verticale rode balken geven de positie van de bron. De kleurenbalk vertegenwoordigt de intensiteit van het fluorescerende signaal in fotonen per seconde per cm2 van lage (blauw) tot hoog (rood). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56801/56801fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

We beschrijven de optische beeldvorming van muizen besmet met Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) met behulp van verslaggever enzym fluorescentie (REF). Dit protocol vergemakkelijkt de gevoelige en specifieke detectie van M. tuberculosis in pre-klinische diermodellen voor pathogenese, therapeutics en vaccin onderzoek.

Mycobacterium tuberculosis in muizen met verslaggever enzym fluorescentie Imaging

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...

Het algemene doel van deze reporter enzym fluoresceringsbeeldvormingsprocedure is om de gevoelige en specifieke detectie van mycobacterium tuberculosis in pre-klinische diermodellen te vergemakkelijken voor pathogenese, therapeutische en vaccinonderzoek. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het tuberculoseveld te beantwoorden, inclusief virulentiemechanismen van bacteriesoorten, evenals het creëren van therapeutische middelen en het begrijpen van vaccins. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het mogelijk is om dezelfde groep dieren op meerdere tijdstippen te beeldvormen.Dit vermindert de kosten aanzienlijk, stelt ons in staat om de interacties tussen gastheer en pathogeen te bestuderen en verhoogt ook de statistische kracht omdat meer aantal dieren gemakkelijk tegelijkertijd kan worden onderhouden. Om te beginnen, kweek M.tuberculosis bacteriën in MOADCTW medium bij 37 graden Celsius tot een optische dichtheid van 0,5 gemeten bij 600 nanometer. Alle procedures die betrekking hebben op de manipulatie van besmettelijke materialen moeten worden uitgevoerd in bioveiligheidskastjes of andere goedgekeurde fysieke beveiligingsapparaten.Wanneer u klaar bent, maak een reeks van één tot 10 verdunningen van de kweek in hetzelfde medium. Plateer vervolgens de verdunning in drievoud op selectieve 7H11 platen om een nauwkeurige bepaling van de CFU te maken. Incubeer de platen gedurende vier weken bij 37 graden Celsius of totdat de kolonies nauwkeurig kunnen worden geteld om de CFU te bepalen.Voor het instellen van een inoculatie, zorg er altijd voor dat de bioveiligheidskast lucht laat stromen met 50 liter per minuut. Om een inoculum voor te bereiden dat tot 90 muizen kan infecteren, meet u de gewenste CFU in een 15-milliliter falcon buis. Tussen 10.000 en 1 miljoen CFU worden doorgaans gebruikt.Bezink vervolgens de bacteriën. Was vervolgens de bacteriën eenmaal met 10 milliliter zoutoplossing. Plaats ze vervolgens in 15 milliliter zoutoplossing.Vervolgens laadt u het inoculum in een bioveiligheidskast in een glazen pot die aan een vernevelaar kan worden bevestigd. Verbind vervolgens de vernevelaareenheid en pas de verticale roestvrijstalen buis aan zodat het onderste uiteinde ongeveer een kwart inch onder het meniscus van de suspensie is. Breng nu de assemblage over naar de inoculatiekamer in een lekbestendige transportcontainer.Om verder te gaan, laadt u dieren van bekend gewicht in de ingeschakelde inoculatiekamer. De kamer kan maximaal 90 muizen bevatten. Sluit vervolgens alle vergrendelingen op de deur.Verbind vervolgens de vernevelaar met een stalen klem. Druk vervolgens op de startknop op de kamer. En stel de luchtstroomsnelheid in op tussen drie en vijf liter per minuut.De perslucht zal stromen met ongeveer 22 tot 26 pond per vierkante inch en het is belangrijk dat u de mist van inoculum in de kamer kunt zien. Na 15 minuten zal er een rode licht op het voorpaneel verschijnen en zal een hoorbaar signaal het einde van de run aangeven. Druk vervolgens op de resetknop om de timers te resetten.Om de vacuüm vrij te geven, drukt u op de kleine rode knop op de deur van de kamer. Open vervolgens de deur van de kamer en breng de muizen terug naar hun thuiskooien. Houd de dieren in de beveiligingskamer.Breng vervolgens de pot en de transportcontainer terug naar de bioveiligheidskast. Gooi daar de resterende bacteriesuspensie in een aangewezen afvalcontainer. Plaats vervolgens de gebruikte vernevelaarpot in een biohazard zak en verzegel de zak voor transport naar de autoclaaf.Om de kamer te reinigen, besproeit u de binnenoppervlakken met gebufferde fenol en 70% ethanol. Laat deze oplossingen 10 minuten op deze oppervlakken reageren. Veeg ze vervolgens grondig af.Verwijder alle doekjes in de biohazard vuilnisbak. Autoclaveer vervolgens het afval, afvalcontainer en gebruikte vernevelaarpotten. Breng de dieren over naar de beeldvormingskamer.Anesthetiseer daar een dier volgens het tekstprotocol en injecteer het met contrast substraat door intraperitoneale injectie. Initialiseer in de software van de beeldvormingssystemen het systeem en ga verder wanneer de temperatuurbalk groen wordt. Na het initialiseren van het systeem, plaats de muis in de beeldvormingskamer.Zorg ervoor dat de neusgaten zich binnen de neuskoker bevinden, zodat het tijdens de beeldvorming anesthesie ontvangt. Keer nu terug naar de computer. Selecteer in het verwervingsbesturingspaneel fluorescentie, transilluminatie voor gehele-diervisualisatie, of epi-illuminatie om longweefsels te bekijken.Voor een enkele muis, stel het gezichtsveld in op B en het lampniveau op hoog. Voor de blootstelling, gebruik automatische tijd, medium binning en twee of drie voor de F/Stop. Stel vervolgens de excitatiefilter in op 745 nanometer en emissiefilters van 780 tot 840 nanometer.Ga vervolgens naar de sequentie-instelling en selecteer negen tot 12 transilluminatiepunten in het gebied van belang. Druk nu op de verwervingsknop om beelden te verzamelen. Beeldanalyse wordt behandeld in het tekstprotocol.Om de mate van infectie te analyseren, euthanaseerd de muis met natriumpentobarbital. Zorg ervoor dat u controleert op een peesreflex om ervoor te zorgen dat het dier is geeuthaniseerd. En vervolgens verwijder de longen met een standaard dissectie.Homogeniseer vervolgens het longweefsel in één milliliter PBS. Maak vervolgens een tienvoudige seriële verdunning van het homogeen met PBS. Plateer de verdunde homogeen in drievoud en incubeer de plaat bij 37 graden Celsius totdat kolonies kunnen worden geteld.Gebruik vervolgens de CFU-score om de ernst van de infectie te meten. Muizen werden behandeld zoals beschreven. Een REF-substraat werd gebruikt om de progressie van M.tuberculosis te bekijken.Fluorescencie werd gekwantificeerd met behulp van transilluminatie. En het nam toe van week twee tot week zes in de geïnfecteerde muizen. De lichte daling in signaal bij de controlemuisjes kon worden toegeschreven aan de toename

imaging-mycobacterium-tuberculosis-mice-with-reporter-enzyme

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Methoden voor bioluminescentie beeldvorming van bacteriële infecties bij levende dieren beschreven. Ziekteverwekkers worden aangepast om luciferase te drukken waardoor optisch het gehele lichaam van infecties in levende dieren. Diermodellen kunnen besmet zijn met luciferase uitdrukken pathogenen en de daaruit voortvloeiende beloop van de ziekte gevisualiseerd in real-time door bioluminescentie imaging.

Met behulp van Luciferase naar Afbeelding bacteriële infecties in Muizen

Source: de Vries, C. R., et al., A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection. J. Vis. Exp. (2020).This video demonstrates a bioluminescent imaging technique to monitor bacterial infection progression in a live mouse model. Pathogenic bacteria engineered with the luxABCDE reporter system emit light at the infection site, allowing visualization of metabolically active bacteria. By imaging the mouse over time, researchers can non-invasively track infection...

Bioluminescence Imaging of Bacterial Infections in Mice

Source: Valentine, M. E., et al., Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the use of a bioluminescence-based imaging approach to monitor bacterial infection in a live mouse model. Sequential bioluminescent and X-ray imaging enables real-time visualization and anatomical localization of infection spread throughout the host.

Real-Time Imaging of Bacterial Infection in a Mouse Model Using Bioluminescence

Source: Behera, R. K., et al. A Fluorescence-based Method to Study Bacterial Gene Regulation in Infected Tissues. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates a method for preparing infected mouse kidney tissue, staining DNA, and detecting bacterial gene expression using dual fluorescent reporters. Red marks all bacteria, and green highlights infection-responsive cells.

Fluorescence Imaging of Bacterial Colonization in Mouse Kidney Tissue

This video demonstrates the reporter enzyme fluorescence (REF) imaging for in vivo detection of Mycobacterium tuberculosis infection. The infected mice are intraperitoneally injected with a substrate for REF imaging. Upon being hydrolyzed by bacterial β-lactamase enzyme, the substrate emits fluorescence, the detection of which aids evaluation of infection.

Reporter Enzyme Fluorescence Imaging for In Vivo Tracking of Bacterial Infection

This video demonstrates a method to track viral infections in mouse models using a recombinant luciferase and fluorescence protein-expressing bi-reporter Influenza A virus. This method enables both in vivo and ex vivo studies, enabling researchers to gain insights into viral dynamics and the effects of interventions.

A Luciferase-Fluorescent Reporter Influenza Virus to Track Viral Infections

Multi-modaliteit beeldvorming is een waardevolle benadering voor het bestuderen van bacteriële kolonisatie in kleine proefdiermodellen. Dit protocol beschrijft infectie van muizen met...

4D multimodale beeldvorming van<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Infecties in Muizen

Gecombineerde optische en μCT beeldvorming in een muismodel van orthopedische implantaten infectie, gebruik van een bioluminescent gemanipuleerde stam van Staphylococcus aureus, die het vermogen om de dynamiek van de bacteriële infectie, evenals de overeenkomstige ontstekingsreactie en anatomische veranderingen in de noninvasively longitudinaal bewaken bone.

Gecombineerd<em&gt; In vivo</em&gt; Optisch en μCT Imaging aan Infectie, Ontsteking, en Bone Anatomie Monitor in een orthopedisch implantaat Infectie in Muizen

Hier wordt beschreven, is een methode voor het analyseren van bacteriële genexpressie in dierlijke weefsels op een cellulair niveau. Deze methode biedt een bron voor de studie van de fenotypische verscheidenheid die zich voordoen binnen een bacteriële bevolking in antwoord op het milieu weefsel tijdens een infectie.

Een fluorescentie gebaseerde methode om te studeren van bacteriële genregulatie in geïnfecteerde weefsels

Influenza A virussen (IAVs) zijn besmettelijke respiratoire pathogenen die jaarlijkse epidemieën en occasionele pandemie veroorzaken. Hier beschrijven we een protocol voor het opsporen van virale infecties in vivo met behulp van een roman recombinant plaats en fluorescentie-uitdrukken van bi-reporter iav (birflu). Deze aanpak biedt onderzoekers een uitstekend hulpmiddel om IAV in vivo te bestuderen.

Een Luciferase-fluorescerende reporter influenza virus voor Live beeldvorming en kwantificering van virale infectie

Hier presenteren we een protocol voor intravitale beeldvorming van een verzwakte, door BSL-2 goedgekeurde Mycobacterium tuberculosis. Spanning in de muislong met behulp van een permanent longvenster. Deze benadering maakt longitudinale, enkelcelresolutie-analyse mogelijk van vroege interacties tussen gastheer en pathogeen, waaronder bacillaire lokalisatie, vasculaire dynamiek en opname van macrofagen binnen dezelfde longmicroomgeving.

Intravitale beeldvorming van verzwakte auxotrofe mycobacterium tuberculosis in muislong tijdens vroege intravasculaire infectie

Leer optische beeldvorming van muizen geïnfecteerd met Mycobacterium tuberculosis met behulp van reporter enzym fluorescentie. Deze methode maakt gevoelige detectie mogelijk voor onderzoek naar pathogenese en vaccinontwikkeling.

Mycobacterium tuberculosis in muizen met verslaggever enzym fluorescentie Imaging

Meer video's verkennen