Name: Met behulp van fluorescentie In Situ hybridisatie (FISH) te controleren van de toestand van Arm cohesie in Prometaphase en metafase ik Drosophila eicellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 46 s
Description: Leer FISH-probes genereren en meiotische armcohesie visualiseren in Drosophila oöcyten tijdens prometafase en metafase. Deze methode helpt onderzoekers cohesiestoornissen identificeren en inzicht geven in chromosoomsegregatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door de NIH Grant GM59354 toegekend aan Sharon E. Bickel. Wij danken Huy Q. Nguyen voor hulp bij de ontwikkeling van het protocol voor het genereren van fluorescerende arm sondes, Ann Lavanway voor hulp bij confocale microscopie, en J. Emiliano Reed voor technische bijstand. Wij danken ook talrijke collega's in de Gemeenschap van de Drosophila voor nuttige discussies en advies.

<ol><li>Peters, J. M., Nishiyama, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3536341/">Sister chromatid cohesion.</a> CSH Perspect Biol. 4 (11), (2012).</li>
<li>McNicoll, F., Stevense, M., Jessberger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cohesin+in+gametogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Cohesin in gametogenesis.</a> Curr Top Dev Biol. 102, 1-34 (2013).</li>
<li>Buonomo, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disjunction+of+homologous+chromosomes+in+meiosis+I+depends+on+proteolytic+cleavage+of+the+meiotic+cohesin+Rec8+by+separin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Disjunction of homologous chromosomes in meiosis I depends on proteolytic cleavage of the meiotic cohesin Rec8 by separin.</a> Cell. 103 (3), 387-398 (2000).</li>
<li>Bickel, S. E., Orr-Weaver, T., Balicky, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sister-chromatid+cohesion+protein+ORD+is+required+for+chiasma+maintenance+in+Drosophila+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">The sister-chromatid cohesion protein ORD is required for chiasma maintenance in Drosophila oocytes.</a> Curr. Biol. 12 (11), 925-929 (2002).</li>
<li>Hodges, C. A., Revenkova, E., Jessberger, R., Hassold, T. J., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SMC1beta-deficient+female+mice+provide+evidence+that+cohesins+are+a+missing+link+in+age-related+nondisjunction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">SMC1beta-deficient female mice provide evidence that cohesins are a missing link in age-related nondisjunction.</a> Nat Genet. 37 (12), 1351-1355 (2005).</li>
<li>Freeman, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+National+Down+Syndrome+Project%3A+design+and+implementation%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Health+Rep%22%5BJournal%5D)">The National Down Syndrome Project: design and implementation.</a> Public Health Rep. 122 (1), 62-72 (2007).</li>
<li>Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+aneuploidy%3A+mechanisms+and+new+insights+into+an+age-old+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem.</a> Nat Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).</li>
<li>Angell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First-meiotic-division+nondisjunction+in+human+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">First-meiotic-division nondisjunction in human oocytes.</a> Am. J. Hum. Genet. 61, 23-32 (1997).</li>
<li>Tsutsumi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+decrease+of+meiotic+cohesins+in+human+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Age-related decrease of meiotic cohesins in human oocytes.</a> PLoS One. 9 (5), e96710(2014).</li>
<li>Liu, L., Keefe, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+cohesin+is+associated+with+age-dependent+misaligned+chromosomes+in+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Biomed+Online%22%5BJournal%5D)">Defective cohesin is associated with age-dependent misaligned chromosomes in oocytes.</a> Reprod Biomed Online. 16 (1), 103-112 (2008).</li>
<li>Subramanian, V. V., Bickel, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+predisposes+oocytes+to+meiotic+nondisjunction+when+the+cohesin+subunit+SMC1+is+reduced%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Aging predisposes oocytes to meiotic nondisjunction when the cohesin subunit SMC1 is reduced.</a> PLoS Genet. 4 (11), e1000263(2008).</li>
<li>Chiang, T., Duncan, F. E., Schindler, K., Schultz, R. M., Lampson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+weakened+centromere+cohesion+is+a+leading+cause+of+age-related+aneuploidy+in+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Evidence that weakened centromere cohesion is a leading cause of age-related aneuploidy in oocytes.</a> Curr. Biol. 20 (17), 1522-1528 (2010).</li>
<li>Lister, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+meiotic+segregation+errors+in+mammalian+oocytes+are+preceded+by+depletion+of+cohesin+and+Sgo2%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Age-related meiotic segregation errors in mammalian oocytes are preceded by depletion of cohesin and Sgo2.</a> Curr. Biol. 20 (17), 1511-1521 (2010).</li>
<li>Duncan, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+cohesion+decreases+in+human+eggs+with+advanced+maternal+age%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Chromosome cohesion decreases in human eggs with advanced maternal age.</a> Aging Cell. 11 (6), 1121-1124 (2012).</li>
<li>Yun, Y., Lane, S. I., Jones, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Premature+dyad+separation+in+meiosis+II+is+the+major+segregation+error+with+maternal+age+in+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Premature dyad separation in meiosis II is the major segregation error with maternal age in mouse oocytes.</a> Development. 141 (1), 199-208 (2014).</li>
<li>Subramanian, V. V., Bickel, S. E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2666492/">Heterochromatin-mediated association of achiasmate homologues declines with age when cohesion is compromised.</a> Genetics. 181, 1207-1218 (2009).</li>
<li>Jeffreys, C. A., Burrage, P. S., Bickel, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+system+for+increased+meiotic+nondisjunction+in+older+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">A model system for increased meiotic nondisjunction in older oocytes.</a> Curr. Biol. 13 (6), 498-503 (2003).</li>
<li>Weng, K. A., Jeffreys, C. A., Bickel, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rejuvenation+of+Meiotic+Cohesion+in+Oocytes+during+Prophase+I+Is+Required+for+Chiasma+Maintenance+and+Accurate+Chromosome+Segregation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Rejuvenation of Meiotic Cohesion in Oocytes during Prophase I Is Required for Chiasma Maintenance and Accurate Chromosome Segregation.</a> PLoS Genetics. 10 (9), e1004607(2014).</li>
<li>Perkins, A. T., Das, T. M., Panzera, L. C., Bickel, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+in+oocytes+during+midprophase+induces+premature+loss+of+cohesion+and+chromosome+segregation+errors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress in oocytes during midprophase induces premature loss of cohesion and chromosome segregation errors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (44), E6823-E6830 (2016).</li>
<li>Dernburg, A. F., Sedat, J. W., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+of+a+role+for+heterochromatin+in+meiotic+chromosome+segregation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Direct evidence of a role for heterochromatin in meiotic chromosome segregation.</a> Cell. 86, 135-146 (1996).</li>
<li>Dernburg, A. F., Sedat, J. W. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0091679X08608808">Method Cell Biol</a>. 53, Academic Press. 187-233 (1998).</li>
<li>Guo, Z., Batiha, O., Bourouh, M., Fifield, E., Swan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Securin%2C+Separase+and+Cohesins+in+female+meiosis+and+polar+body+formation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Role of Securin, Separase and Cohesins in female meiosis and polar body formation in Drosophila.</a> J Cell Sci. 129 (3), 531-542 (2016).</li>
<li>Giauque, C. C., Bickel, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterochromatin-Associated+Proteins+HP1a+and+Piwi+Collaborate+to+Maintain+the+Association+of+Achiasmate+Homologs+in+Drosophila+Oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Heterochromatin-Associated Proteins HP1a and Piwi Collaborate to Maintain the Association of Achiasmate Homologs in Drosophila Oocytes.</a> Genetics. 203 (1), 173-189 (2016).</li>
<li>Joyce, E. F., Apostolopoulos, N., Beliveau, B. J., Wu, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+progenitors+escape+the+widespread+phenomenon+of+homolog+pairing+during+Drosophila+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Germline progenitors escape the widespread phenomenon of homolog pairing during Drosophila development.</a> PLoS Genet. 9 (12), e1004013(2013).</li>
<li>Gilliland, W. D., Hughes, S. F., Vietti, D. R., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Congression+of+achiasmate+chromosomes+to+the+metaphase+plate+in+Drosophila+melanogaster+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Congression of achiasmate chromosomes to the metaphase plate in Drosophila melanogaster oocytes.</a> Dev Biol. 325 (1), 122-128 (2009).</li>
<li>Gyuricza, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+and+Stable+Cohesins+Regulate+Synaptonemal+Complex+Assembly+and+Chromosome+Segregation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic and Stable Cohesins Regulate Synaptonemal Complex Assembly and Chromosome Segregation.</a> Curr Biol. 26 (13), 1688-1698 (2016).</li>
<li>Radford, S. J., McKim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+for+Imaging+Prometaphase+and+Metaphase+of+Meiosis+I+in+Fixed+Drosophila+Oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes.</a> J Vis Exp. (116), (2016).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Het gebruik van vis sondes te beoordelen van de toestand van arm cohesie in prometaphase ik en metafase ik Drosophila eicellen is een aanzienlijke vooruitgang op het gebied van Drosophila meiose. Historisch, zijn Drosophila onderzoekers beperkt tot genetische tests afleiden van voortijdige verlies van samenhang van de arm in de rijpe eicellen11,18,19. Nu, met de methoden die hier gepresenteerd, de toes...

Juiste segregatie van chromosomen tijdens de mitose en meiose vereist dat zuster chromatide cohesie worden vastgesteld, onderhouden en uitgebracht in een gecoördineerde wijze1,2. Cohesie is opgericht tijdens de S-fase en is bemiddeld door het cohesin complex, die vormen van fysieke verbanden die houden van de zuster chromatiden samen. In meiose, cohesie distale naar een crossover ook functies om recombinante homologen bij elkaar te houden en deze fysieke vereniging helpt ervoor te zorgen de juiste stand van het tweewaardig op de metafase ik spindel (Figuur 1)3,4, 5. Release van arm samenhang op anafase ik kunt het homologen te scheiden naar tegenovergestelde Polen van de spindel. Als echter arm cohesie is voortijdig, verloren recombinante homologen zal verliezen hun fysieke verbinding en scheiden willekeurig, hetgeen kan leiden tot aneuploid gameten (Figuur 1).
In menselijke eicellen, fouten in chromosoom segregatie zijn de belangrijkste oorzaak van miskramen en aangeboren afwijkingen, zoals Down syndroom6, en de frequentie ervan exponentieel toeneemt met maternale leeftijd7. Zuster chromatide cohesie is opgericht in de foetale oöcyten en Meiotische recombinatie is voltooid vóór de geboorte. Eicellen dan arresteren in Mid profase ik tot ovulatie en tijdens deze arrestatie, de aanhoudende fysieke vereniging van recombinante homologen afhankelijk van zuster chromatide cohesie. Daarom vereisen nauwkeurige segregatie tijdens meiose en normale zwangerschap resultaten dat cohesie voor maximaal vijf decennia intact blijven.
Voortijdige verlies van samenhang tijdens de langdurige Meiotische arrestatie van menselijke eicellen heeft voorgesteld om bij te dragen aan het effect van de maternale leeftijd en meerdere tekstregels bewijs ondersteunen deze hypothese8,9. Echter, gezien de uitdagingen van het bestuderen van Meiotische cohesie in menselijke eicellen, veel van ons begrip van dit verschijnsel is afhankelijk van het gebruik van model organismen5,10,11,12, 13,14,15.
Drosophila melanogaster eicellen bieden tal van voordelen voor de studie van Meiotische cohesie en chromosoom segregatie. Een eenvoudige genetische bepaling maakt het mogelijk om te herstellen van de nakomelingen van aneuploid gameten en meten van de betrouwbaarheid van X-chromosoom segregatie op een grote schaal11,16,17. Bovendien kan men ook bepalen of chromosoom segregatie fouten ontstaan omdat de recombinante homologen missegregate tijdens de meiose I, een fenotype die strookt met de voortijdige verlies van arm cohesie11,18, 19. Directe observatie van de Braziliaanse deelstaat Meiotische cohesie in Drosophila eicellen is ook mogelijk met behulp van fluorescentie in situ hybridisatie (FISH). Hoewel fluorescerende oligonucleotides die aan repetitieve satelliet sequenties kruisen zijn gebruikt voor meer dan een decennium te controleren pericentromeric cohesie in volwassen Drosophila eicellen4,20, analyse van de arm cohesie is veel uitdagender. Visualisatie van de toestand van arm cohesie vereist een sonde die een groot gebied van één exemplaar beslaat sequenties en is helder genoeg om te resulteren in zichtbare signalen voor individuele zuster chromatiden wanneer arm cohesie afwezig is. Bovendien, moeten de oöcyt fixatie voorwaarden en de grootte van de gelabelde Ani vergemakkelijken penetratie21 in de grote volwassen Drosophila oöcyt (200 µm breed door 500 µm lang). Onlangs, een arm sonde werd met succes gebruikt om te visualiseren van Drosophila oöcyt chromatiden tijdens anafase ik, maar de auteurs verklaard dat zij niet een signaal in prometaphase detecteren kon of metafase ik eicellen22gearresteerd. Hier voorzien wij een gedetailleerd protocol voor de generatie van de X-chromosoom arm vis sondes en oöcyt voorbereiding voorwaarden die hebben ons toegelaten om te assay voor het voortijdige verlies van zuster chromatide cohesie in prometaphase ik en metafase ik eicellen. Deze technieken, waardoor ons te identificeren genproducten die vereist voor het behoud van Meiotische cohesie zijn, zal toestaan dat anderen te assay voor zuster chromatide cohesie gebreken in volwassen Drosophila eicellen van verschillende genotypen.

<table><tbody><tr><td>Kits</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Midi Prep kit</td><td>Qiagen</td><td>12143</td><td>Prep BAC clone DNA</td></tr><tr><td>GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) Kit</td><td>Sigma</td><td>WGA2</td><td>Amplify BAC clone DNA</td></tr><tr><td>ARES Alexa Fluor 647 DNA labeling kit</td><td>Invitrogen</td><td>A21676</td><td>Label BAC clone DNA</td></tr><tr><td>PCR purification kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>Remove non-conjugated dye following labeling of BAC clone DNA</td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Chemie en oplossingen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Opmerking: Alle oplossingen worden bereid met steriele ultrapure water en moeten worden gesteriliseerd door autoclavage of door middel van een filter.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bovien serum albumine (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600-100</td><td>Bereid 10% voorraad Vries aliquots</td></tr><tr><td>Calciumchloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>C75-500</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4', 6-Diamidino-2-fenylindole, dihydrochloride)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>Toxisch: draag geschikte bescherming. Bereid 100&micro;g/ml voorraad in 100% ethanol, bewaar in aliquots op -20 &deg;C. Bereid 1 &micro;g/ml oplossing in 2X SSCT voor gebruik.</td></tr><tr><td>Dextransulfaat</td><td>Sigma</td><td>D-8906</td><td></td></tr><tr><td>Drierite</td><td>Drierite Company</td><td>23001</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Invitrogen</td><td>15508-013</td><td>Bereid 10 mM voorraad</td></tr><tr><td>dTTP (10 &micro;mol, 100 &micro;l)</td><td>Boehringer Mannheim</td><td>1277049</td><td>Bereid 1 mM voorraad</td></tr><tr><td>EDTA (Disodium ethyleendiaminetetraacetaat)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S311-500</td><td>Bereid 250 mM voorraad</td></tr><tr><td>100% ethanol (moleculaire kwaliteit, 200 proof)</td><td>Decon Laboratories</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>Tris (Ultra Pure)</td><td>Invitrogen</td><td>15504-020</td><td></td></tr><tr><td>EGTA (Ethyleenbis(oxyethyleenitrilo)tetraacetaat)</td><td>Sigma</td><td>E-3889</td><td></td></tr><tr><td>16% formaldehyde</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>18505</td><td>Toxisch: draag geschikte bescherming</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Invitrogen</td><td>AM9342</td><td>Toxisch: draag geschikte bescherming</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>Roche</td><td>901393</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Boehringer Mannheim</td><td>737-151</td><td></td></tr><tr><td>Heptaan</td><td>Fisher Scientific</td><td>H350-4</td><td>Toxisch: draag geschikte bescherming.</td></tr><tr><td>Zoutzuur</td><td>Millipore</td><td>HX0603-4</td><td>Toxisch: draag geschikte bescherming.</td></tr><tr><td>Hydroxylamine</td><td>Sigma</td><td>438227</td><td>Bereid 3 M voorraad</td></tr><tr><td>4,9 M Magnesiumchloride</td><td>Sigma</td><td>104-20</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4 &Yuml; 7H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>S373-500</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4 &Yuml; 2H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>S369-500</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine (0,1mg/ml)</td><td>Sigma</td><td>P8920-100</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumacetaat</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP364-500</td><td></td></tr><tr><td>Natriumacetaat</td><td>Fisher Scientific</td><td>S209-500</td><td>Bereid 3M voorraad</td></tr><tr><td>Natriumcacodylate</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>1131</td><td>Toxisch: draag geschikte bescherming. Bereid 400mM voorraad</td></tr><tr><td>Natriumcitraat</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP327-1</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td>Natriumchloride</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-500</td><td></td></tr><tr><td>10% Tween 20</td><td>Thermo Scientific</td><td>28320</td><td>Surfact-Amps</td></tr><tr><td>10% Triton X-100</td><td>Thermo Scientific</td><td>28314</td><td>Surfact-Amps</td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Oplossingen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Opmerking: Alle oplossingen worden bereid met steriele ultrapure water en moeten worden gesteriliseerd door middel van autoclavage of door middel van een filter.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TE-buffer</td><td></td><td></td><td>10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH = 8,0</td></tr><tr><td>20X SSC (Saline Sodium Citraat)</td><td></td><td></td><td>3 M NaCl, 300 mM natriumcitraat</td></tr><tr><td>2X cacodylate fix-oplossing</td><td></td><td></td><td>Toxisch: draag geschikte bescherming. 200 mM natriumcacodylate, 200 mM sucrose, 80 mM natriumacetaat, 20 mM EGTA</td></tr><tr><td>1,1X Hybridisatie-buffer</td><td></td><td></td><td>3,3X SSC, 55% formamide, 11% dextransulfaat</td></tr><tr><td>Fix-oplossing</td><td></td><td></td><td>Toxisch: draag geschikte bescherming. 4% formaldehyde, 1X cacodylate fix-oplossing</td></tr><tr><td>PBSBTx</td><td></td><td></td><td>1X PBS, 0,5% BSA, 0,1% Triton X-100</td></tr><tr><td>PBSTx</td><td></td><td></td><td>1X PBS, 1% Triton X-100</td></tr><tr><td>Extractie-buffer (PBSTx + RNAse)</td><td></td><td></td><td>1X PBS, 1% Triton X-100, 100 &micro;g/mL RNase</td></tr><tr><td>2X SSCT</td><td></td><td></td><td>2X SSC, 0,1% Tween 20</td></tr><tr><td>2X SSCT + 20% formamide</td><td></td><td></td><td>Toxisch: draag geschikte bescherming. 2X SSC, 0,1% Tween 20, 20% formamide</td></tr><tr><td>2X SSCT +

met behulp van fluorescentie in situ hybridisatie (fish) te controleren van de toestand van arm cohesie in prometaphase en metafase ik drosophila eicellen

Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes

Bij de mens zijn chromosoom segregatie fouten in eicellen verantwoordelijk voor de meeste miskramen en aangeboren afwijkingen. Bovendien, als vrouwen ouder, staat hun risico van concipiëren dat een aneuploid foetus stijgt dramatisch en dit verschijnsel bekend als de maternale leeftijd effect. Een van de vereisten voor nauwkeurige chromosoom segregatie tijdens de Meiotische divisies is onderhoud van zuster chromatide cohesie in de uitgebreide profase periode dat eicellen ervaring. Cytologische aanwijzingen bij zowel mensen als modelorganismen dat Meiotische cohesie tijdens het verouderingsproces verslechtert. Daarnaast segregatie fouten in menselijke eicellen zijn meest voorkomende tijdens de meiose I, consistent met de voortijdige verlies van samenhang van de arm. Het gebruik van modelorganismen is essentieel voor het ontrafelen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de leeftijd afhankelijk verlies van samenhang. Drosophila melanogaster biedt verschillende voordelen voor het bestuderen van de verordening van Meiotische samenhang in de eicellen. Echter tot voor kort waren alleen genetische tests beschikbaar voor assay voor het verlies van samenhang van de arm in eicellen van verschillende genotypen of onder verschillende experimentele omstandigheden. Hier is een gedetailleerde protocol is voorwaarde voor het gebruik van fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) direct visualiseren gebreken in arm cohesie in prometaphase ik en metafase ik gearresteerd Drosophila eicellen. Door het genereren van een sonde van de vis die hybridizes op de distale arm van het X -chromosoom en het verzamelen van de confocal Z stapels, een onderzoeker kan visualiseren het aantal individuele vis signalen in drie dimensies en bepalen of zuster chromatide armen zijn gescheiden. De procedure maakt het mogelijk te kwantificeren arm cohesie gebreken in honderden Drosophila eicellen. Deze methode is als zodanig een belangrijk instrument voor het onderzoeken van de mechanismen die bijdragen tot cohesie onderhoud, alsmede de factoren die tot zijn nalating tijdens het verouderingsproces leiden.

Figuur 5 geeft beelden verkregen met een arm-sonde die hybridizes naar cytologische regio 6E-7B op het X -chromosoom. De resultaten van dit onderzoek in een signaal dat samen met die van de DAPI, lokaliseert is gemakkelijk te onderscheiden van de achtergrond, en met succes te kwantificeren arm cohesie defecten in verschillende genotypen19is gebruikt. Kwantificering van cohesie gebreken was beperkt tot prometaphase ik en metafa...

Dit manuscript presenteert een gedetailleerde methode voor het genereren van X-chromosoom arm sondes en presterende fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) te onderzoeken van de Braziliaanse deelstaat zus chromatide cohesie in prometaphase en metafase ik gearresteerd Drosophila eicellen. Dit protocol is geschikt om te bepalen of cohesie Meiotische arm intact of verstoord in verschillende genotypen is.

Met behulp van fluorescentie In Situ hybridisatie (FISH) te controleren van de toestand van Arm cohesie in Prometaphase en metafase ik Drosophila eicellen

In humans, chromosome segregation errors in oocytes are responsible for the majority of miscarriages and birth defects. Moreover, as women age, their risk ...

Het algemene doel van deze procedure is om FISH-sondes te genereren en de toestand van meiotische armcohesie in drosophila-eicellen tijdens prometafase één en metafase één te visualiseren. Het grote voordeel van deze techniek is dat het mogelijk maakt om de toestand van armcohesie in prometafase en metafase één gearresteerde drosophila-eicellen te meten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van drosophila-meiose, zoals welke omstandigheden leiden tot voortijdig verlies van armcohesie?Deze techniek heeft het potentieel om ons begrip van het effect van moederlijke leeftijd bij mensen te vergroten, dat voor een deel optreedt omdat meiotische cohesie verslechtert naarmate eicellen ouder worden. Begin dit protocol met het genereren van de armsonde voor FISH, evenals de dissectie en fixatie van eicellen zoals beschreven in de tekstprotocol. Om de eicellen in laat stadium te scheiden, voegt u eerst een milliliter PBSBTX toe aan een ondiepe dissectiekom.Gebruik vervolgens een P-200 met een BSA-gecoate tip om de gefixeerde eierstokken in de ondiepe kom over te brengen. Pipetteer de eierstokken op en neer met de BSA-gecoate pipettetip om de rijpe

using-fluorescence-situ-hybridization-fish-to-monitor-state-arm

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Hele monteren in situ hybridisatie is een van de meest gebruikte technieken in de ontwikkelingsbiologie. Hier presenteren wij een hoge resolutie dubbele fluorescente in situ hybridisatie protocol voor de analyse van de precieze expressiepatroon van een enkel gen en voor het bepalen van de overlap van de expressie-domeinen van twee genen. We nemen een propidiumjodide nucleair anti-vlek weefsel organisatie te markeren.

Zebravis hele Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridisatie

Drosophila hemocytes verspreiden over het geheel van de zich ontwikkelende embryo. Dit protocol laat zien hoe te monteren en het imago van deze migraties met behulp van embryo's met fluorescent gelabelde hemocytes.

Live-beeldvorming van Drosophila melanogaster Embryonale Hemocyte Migraties

De kinetochoor is waar de SAC initieert het signaal het toezicht op de mitotische segregatie van de zuster chromatiden. Een methode wordt beschreven om de werving en de omzet van een van de kinetochoor eiwitten en de coördinatie te visualiseren met het chromosoom beweging...

Studeren Mitotische Checkpoint door te laten zien Dynamic kinetochoor Protein Gedrag en Chromosoom Motion in Living<em&gt; Drosophila</em&gt; Syncytieel Embryo&#39;s

Hier beschrijven we een geheel gemonteerde...

Hele Mount RNA TL<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie van<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryo&#39;s

Immuunkleuring is een effectieve techniek voor het visualiseren van specifieke celtypen en eiwitten in weefsels. Door het gebruik van sonicatie vermindert het hier beschreven protocol de noodzaak om Drosophila melanogaster weefsels van laat-stadium embryo's en larven te dissekeren voordat immunokleuring wordt uitgevoerd. We bieden een efficiënte methodologie voor de immunokleuring van formaldehyde-gefixeerde hele larven.

-Sonicatie vergemakkelijkt immunofluorescentiekleuring van Late-fase embryonale en larvale<em&gt; Drosophila</em&gt; Weefsels<em&gt; In Situ</em

We presenteren protocollen voor het verzamelen, voorbereiden en beeldvorming van volwassen Drosophila eicellen. Deze methoden maken de visualisatie van chromosoomgedrag en spindelassemblage en -functie tijdens meiose mogelijk.

Technieken voor Imaging prometaphase metafase van de meiose I in Fixed<em&gt; Drosophila</em&gt; Eicellen

Het beschreven RNA in situ hybridisatie protocol staat toe de opsporing van RNA in hele Drosophila embryo's of ontleed weefsels. Met behulp van 96-wells microtiterplaat platen en tyramide signaal versterking, kunnen afschriften worden gedetecteerd op hoge resolutie, gevoeligheid en doorvoer, en tegen een relatief lage prijs.

Hoge resolutie fluorescentie In Situ hybridisatie in Drosophila embryo's en weefsels met behulp van Tyramide signaal versterking

Dit enkel molecuul fluorescentie in situ hybridisatie protocol is geoptimaliseerd voor het kwantificeren van het aantal molecules van RNA in ontluikende gist tijdens de vegetatieve groei en meiose.

Één molecuul fluorescentie In Situ hybridisatie (smFISH) analyse in Budding vegetatieve groei van gist en meiose

Reproducibly het om getallen te tellen van mRNAs in individuele eicellen, enkel molecuul RNA fluorescentie in situ is hybridisatie (RNA-vis) geoptimaliseerd voor niet-aanhanger cellen. Eicellen werden verzameld, gekruist met het transcript specifieke sondes en gekwantificeerd aan de hand van een afbeelding kwantificering software.

Gebruik van één molecuul fluorescentie In Situ hybridisatie (SM-vis) om Quantify en lokaliseer mRNAs in lymfkliertest eicellen

Expansie-ondersteunde iteratieve fluorescentie in situ hybridisatie (EASI-FISH) is een robuuste techniek die expansiemicroscopie combineert met fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) om de expressie van meerdere genen in dik weefsel te detecteren. Dit protocol schetst recente vorderingen in de methode en de aanpassing ervan voor het labelen van het intacte Drosophila centrale zenuwstelsel..

Multiplex detectie van genexpressie in de intacte Drosophila hersenen met behulp van expansie-ondersteunde iteratieve fluorescentie in situ hybridisatie

Dit protocol beschrijft de stappen die nodig zijn om hybridisatiekettingreactie fluorescerende in situ hybridisatie (HCR-FISH) uit te voeren in oogtische lobben van Drosophila melanogaster-larven . Procedures voor probe-ontwerp, hybridisatie, amplificatie en weefselmontage worden gedetailleerd om de visualisatie van de zich ontwikkelende optische kwab te vergemakkelijken.

Hybridisatiekettingreactie FISH in de zich ontwikkelende Drosophila optische lob

Leer FISH-probes genereren en meiotische armcohesie visualiseren in Drosophila oöcyten tijdens prometafase en metafase. Deze methode helpt onderzoekers cohesiestoornissen identificeren en inzicht geven in chromosoomsegregatie.

Met behulp van fluorescentie In Situ hybridisatie (FISH) te controleren van de toestand van Arm cohesie in Prometaphase en metafase ik Drosophila eicellen (Video) | JoVE Journal

Met behulp van fluorescentie In Situ hybridisatie (FISH) te controleren van de toestand van Arm cohesie in Prometaphase en metafase ik Drosophila eicellen

Meer video's verkennen