Met behulp van fluorescentie In Situ hybridisatie (FISH) te controleren van de toestand van Arm cohesie in Prometaphase en metafase ik Drosophila eicellen
December 6th, 2017
Dit manuscript presenteert een gedetailleerde methode voor het genereren van X-chromosoom arm sondes en presterende fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) te onderzoeken van de Braziliaanse deelstaat zus chromatide cohesie in prometaphase en metafase ik gearresteerd Drosophila eicellen. Dit protocol is geschikt om te bepalen of cohesie Meiotische arm intact of verstoord in verschillende genotypen is.
Het algemene doel van deze procedure is om FISH-sondes te genereren en de toestand van meiotische armcohesie in drosophila-eicellen tijdens prometafase één en metafase één te visualiseren. Het grote voordeel van deze techniek is dat het mogelijk maakt om de toestand van armcohesie in prometafase en metafase één gearresteerde drosophila-eicellen te meten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van drosophila-meiose, zoals welke omstandigheden leiden tot voortijdig verlies van armcohesie?
Deze techniek heeft het potentieel om ons begrip van het effect van moederlijke leeftijd bij mensen te vergroten, dat voor een deel optreedt omdat meiotische cohesie verslechtert naarmate eicellen ouder worden. Begin dit protocol met het genereren van de armsonde voor FISH, evenals de dissectie en fixatie van eicellen zoals beschreven in de tekstprotocol. Om de eicellen in laat stadium te scheiden, voegt u eerst een milliliter PBSBTX toe aan een ondiepe dissectiekom.
Gebruik vervolgens een P-200 met een BSA-gecoate tip om de gefixeerde eierstokken in de ondiepe kom over te brengen. Pipetteer de eierstokken op en neer met de BSA-gecoate pipettetip om de rijpe eicellen los te maken van de minder rijpe eicellen. Wanneer de eicellen in laat stadium voldoende gescheiden zijn, brengt u al het weefsel over in een microfugebuis van 500 milliliter.
Verwijder overtollig vocht met een getrokken Pasteurpipet en laat ongeveer 150 tot 200 microliter in de buis. Om voorbereiding voor het rollen van eicellen te maken, bevochtigt u een diepe kom vooraf met 200 microliter PBSBTX. Bedek de kom en zet deze opzij.
Verkrijg drie bevroren glazen schuifjes en leg schuifje drie opzij. Wrijf vervolgens voorzichtig de bevroren glazen gebieden van schuifje één en twee tegen elkaar. Spoel ze af in gedeïoniseerd water om eventuele glazen scherven te verwijderen en droog ze af met een wegwerpdoekje.
Bedek de bevroren gebieden van schuifje één en twee met PBSBTX door 50 microliter PBSBTX toe te voegen aan één schuifje en dit gebied te wrijven met het andere schuifje. Verwijder het vocht met een wegwerpdoekje en plaats de schuifjes onder een dissectiemicroscoop. Houd de bevroren gebieden van schuifje één en twee in contact, waarbij schuifje drie schuifje twee ondersteunt.
Om de eicellen te rollen, bevochtigt u eerst een P-200 pipettetip in PBSBTX en verspreidt u de eicellen in de microfugebuis door op en neer te pipetteren. Breng 50 microliter vloeistof met de eicellen over naar het midden van het bevroren glazen deel van schuifje één. Til schuifje twee op om dit te doen.
Laat schuifje twee langzaam zakken totdat de oppervlaktespanning van de vloeistof een afdichting creëert tussen de twee bevroren glazen gebieden. Er moet voldoende vloeistof zijn om het bevroren gebied te bedekken, maar er mag geen vloeistof uitlekken. Houd vervolgens de onderste schuifje één met één hand op zijn plaats en gebruik de andere hand om de bovenste schuifje twee heen en weer te bewegen in horizontale richting, waarbij schuifje twee horizontaal en ondersteund op schuifje drie wordt gehouden.
Voer de procedure uit onder een microscoop voor eenvoudige visualisatie van eicellenbewegingen en voortgang. Na een paar bewegingen in horizontale richting, verandert u lichtjes de bewegingshoek. In meerdere stappen, verhoogt u geleidelijk deze hoek tot 90 graden totdat de beweging van de bovenste schuifje twee loodrecht staat op de startrichting.
Merk op dat lege chorionen zichtbaar zullen zijn in de vloeistof en eicellen zonder chorionen zullen langer en dunner lijken. Zorg ervoor dat de rolrichting altijd in een rechte lijn is en nooit in een cirkelvorkige beweging. Herhaal het rollen ongeveer zeven tot tien keer totdat de oplossing licht troebel wordt.
Stop met rollen wanneer de meeste eicellen hun vitelline membranen lijken te hebben verloren. Til voorzichtig het bovenste schuifje twee op en sleep een van de hoeken naar het midden van het bevroren gebied van het onderste schuifje één zodat de gerolde eicellen zich ophopen in het midden van het bevroren gebied. Spoel de eicellen van beide schuifjes met PBSBTX in de diepe kom met PBSBTX.
Reinig schuifje één en twee met ultrapuur water. Droog af met een wegwerpdoekje en reset. Herhaal deze stappen totdat alle eicellen van hetzelfde genotype zijn gerold.
Dit vereist meestal drie tot vier rondes van rollen per genotype. Om puin na het rollen te verwijderen, voegt u een milliliter PBSBTX toe aan een 15-milliliter conische buis. Laat de vloeistof ronddraaien om de zijden van de buis te bedekken.
Gebruik een met PBSBTX gecoate P-1, 000 pipettetip om de gerolde eicellen van de diepe kom naar de conische buis met een milliliter PBSBTX over te brengen. Voeg nog eens twee milliliter PBSBTX toe aan de conische buis met de eicellen. Houd de conische buis tegen een donkere achtergrond om de ondoorzichtige eicellen te zien zinken.
Laat de eicellen naar de bodem zakken en gebruik een P-1, 000 om de bovenste twee milliliter oplossing met puin te verwijderen en weg te gooien. Herhaal de stap totaal drie keer om puin te verwijderen en gebruik vervolgens een met PBSBTX gecoate P-1, 000 pipettetip om de eicellen terug te brengen naar de oorspronkelijke microfugebuis van 500 microliter. 20 tot 25 vrouwtjes zouden ongeveer 50 microliter gerolde rijpe eicellen moeten opleveren.
Herhaal dit proces voor de resterende genotypen met behulp van verse bevroren schuifjes, een schone diepe kom en een nieuwe conische buis voor elk genotype. Spoel de eicellen af met 500 microliter PBS met 1% Triton X-100. Verwijder het vocht
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit manuscript presenteert een gedetailleerde methode voor het genereren van X-chromosoomarm proben en het uitvoeren van fluorescence in situ hybridisatie (FISH) om zusterchromatide cohesie in Drosophila-eicellen te onderzoeken. Dit protocol is geschikt om te bepalen of meiotische armscohesie intact of verstoord is in verschillende genotypen.
Belangrijkste Studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Genetica
Achtergrond
- Meiotische cohesie is cruciaal voor een goede chromosoomsegregatie.
- Drosophila-eicellen dienen als model voor het bestuderen van meiose.
- Het begrijpen van cohesie kan licht werpen op effecten van maternale leeftijd bij mensen.
- Fluorescence in situ hybridisatie (FISH) is een belangrijke techniek die in deze studie wordt gebruikt.
Doel van het onderzoek
- Om FISH-proben te genereren voor het visualiseren van meiotische armscohesie.
- Om de toestand van armscohesie in gearresteerde Drosophila-eicellen te beoordelen.
- Om condities te onderzoeken die leiden tot voortijdig verlies van armscohesie.
Gebruikte Methoden
- Generatie van arms proben voor FISH.
- Dissectie en fixatie van Drosophila-eicellen.
- Visualisatie van meiotische stadia met behulp van FISH.
- Beoordeling van de cohesietoestand in verschillende genotypen.
Belangrijkste Resultaten
- Succesvolle generatie van FISH-proben voor X-chromosoomarmen.
- Visualisatie van zusterchromatide cohesie in eicellen.
- Identificatie van genotypen met verstoorde meiotische cohesie.
- Inzichten in de effecten van maternale leeftijd op cohesiestabiliteit.
Conclusies
- Deze methode biedt een betrouwbare benadering om meiotische cohesie te bestuderen.
- Bevindingen dragen bij aan het begrijpen van de mechanismen van chromosoomsegregatie.
- Mogelijke implicaties voor menselijke reproductieve gezondheid en veroudering.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
This method enables direct visualization of meiotic arm cohesion defects in Drosophila oocytes, providing a quantitative cytological readout for assessing chromosomal stability. It supports mechanistic de-risking in target validation by linking genetic or environmental perturbations to premature loss of sister chromatid cohesion. The approach offers predictive confidence in preclinical models of reproductive aging and aneuploidy risk.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to cohesion regulators and chromosomal stability pathways.
- Operational Value: Provides a direct phenotypic readout for functional target validation in meiotic progression.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by quantifying arm cohesion defects as a readout of genomic integrity.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, reproducible FISH-based assays for detecting cohesion states in oocytes.
- Operational Value: Enables scalable screening of genotypes or conditions affecting meiotic fidelity.
- Scientific Value: Produces quantitative 3D imaging outputs for scoring individual arm signals and cohesion status.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects Drosophila meiotic findings to human maternal age effect models through conserved cohesion mechanisms.
- Operational Value: Facilitates preclinical continuity by establishing a conserved cytological endpoint for aneuploidy risk.
- Scientific Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by measuring cohesion loss as a biomarker of meiotic aging.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery biology phase, enabling hypothesis testing of cohesion regulators prior to lead identification efforts in reproductive therapeutics.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by linking genetic perturbations to direct visualization of arm cohesion loss.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized oocyte preparation and FISH hybridization for high-content imaging.
- Analytics: Provides quantitative measurements of FISH spot counts to objectively score cohesion defects across experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling age-related cohesion deterioration relevant to human oocyte aging.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable cytological platform for evaluating meiotic stability across multiple genetic backgrounds or compound treatments.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing ambiguity in meiotic defect mechanisms.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized probe generation, oocyte rolling, and confocal imaging workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of genomic instability risks in discovery models.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization of targets based on their impact on chromosomal fidelity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila oocyte dissection, FISH probe design, and confocal microscopy.
- Dependent on fluorescence microscopy infrastructure with Z-stack acquisition and 3D image analysis capabilities.
- Necessitates standardization of oocyte rolling and fixation procedures across laboratories for consistent results.
- Involves adaptation considerations when applying the arm probe strategy to other chromosomes or species.
- Limited by the technical challenge of oocyte settlement during washes, which affects yield if not performed with sufficient patience.
