Name: Evaluatie van stamcellen therapieën in een bilaterale Patellaire pees letsel Model bij ratten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Leer een bilateraal rattenmodel voor het evalueren van stamceltherapieën bij patellaire peesdefecten. Deze methode minimaliseert interindividuele variatie en optimaliseert het diergebruik in orthopedisch onderzoek naar peesherstel.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs wil erkennen van Dr. Su, PhD, voor haar statistische analyse van de gegevens. De auteurs Dr. McClure, DVM, PhD DACLAM, ook bedanken voor haar advies over de narcose en pijn beheerprotocollen gebruikt in de studie. Dit project werd ondersteund door subsidies van Western University of Health Sciences Bureau van de ondervoorzitter voor onderzoek (12678v) en de USDA sectie 1433 fondsen (2090).

Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van Western University of Health Sciences.
1. isolatie en uitbreiding van MSCs uit paarden navelstreng Matrix
<ol><li>De placenta verkrijgen door een volwassen merrie (zwanger) na waargenomen veulenen en aseptisch isoleren de navelstreng van de moederkoek. Houd de navelstreng in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met 1% penicilline-streptomycine (P/S) bij 4 ° C tijdens de overdracht tot verwerking.</li>
	<li>Wassen van de navelstreng tweemaal met kamertemperatuur PBS met 1% P/S in een tube van 50 mL. Sectie de navelstreng in 2-inch lange fragmenten op 150 mm plaat en wastafel in de kamer temperatuur, PBS, met 1% P/S in een tube van 50 mL twee of drie keer, tot het grootste deel van het bloed is gespoeld.</li>
	<li>Snijd de navelstreng lengterichting om schepen bloot te stellen. Schepen, met inbegrip van 2 slagaders en een ader een allantoïs stengel van het koord met behulp van Tang en schaar verwijderen. Navelstreng matrix (gelei van Wharton), die de gelei-achtige matrix omliggende, op een bord van de 150 mm schepen door schrapen met een scalpel, verzamelen en de gelei in fijne stukjes gehakt.</li>
	<li>Plaats Wharton de gelei van 2 – 3 navelstreng fragmenten (ongeveer 12-15 g) in een tube van 50 mL met 15 mL 0,1% (g/v) collagenase type IA oplossing in PBS. Incubeer bij 37 ° C met zacht schudden voor 3-4 h tot het is opgelost.</li>
	<li>Centrifugeer verteerd weefsel bij 300 x g gedurende 15 minuten en supernatant gecombineerd. Resuspendeer weefsel verteerd in kamertemperatuur PBS met 1% 15 mL P/S, Meng door pipetteren Centrifugeer bij 150 x g gedurende 5 min en gecombineerd supernatant (wash). Herhaal wassen tweemaal meer.</li>
	<li>Resuspendeer gewassen cellen in 15 mL kamertemperatuur PBS met 1% P/S, Meng door pipetteren, stam door met 100 µm cel zeef, centrifugeer bij 150 x g gedurende 5 min, en supernatant gecombineerd.</li>
	<li>Bereid kweekmedium (CM) door het mengen van lage glucose Dulbecco bewerkt Eagle's Medium (LG-DMEM) met foetale runderserum (FBS) en 1% P/S. het steriliseren van het medium door filtratie.</li>
	<li>Resuspendeer gespannen cellen in 10 mL CM vooraf opgewarmd tot 37 ° C, Meng door pipetteren, breng in een maatkolf van 25 cm2 weefselkweek en incubeer in 5% CO2 op 90% vochtigheid en 37.0 ° C. Verandering CM om de 3 dagen totdat de cultuur tot 70-80% samenvloeiing, wanneer de cultuur zal worden gepasseerd.</li>
	<li>Om de passage van de cultuur, gecombineerd CM vanaf de kolf tweemaal wassen met 5 mL kamertemperatuur PBS en loskoppelen met 3 mL 0,25% trypsine/ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) bij 37 ° C gedurende 5 minuten.</li>
	<li>Neutraliseren trypsine/EDTA met 6 mL CM vooraf opgewarmd tot 37.0 ° C, Meng door pipetteren, breng kwantitatief over in een tube van 15 mL, centrifugeer bij 150 x g gedurende 5 min, en supernatant gecombineerd. Resuspendeer vrijstaande cellen in CM 1 mL, Meng door pipetteren. Tellen de levensvatbare cellen met blauwe trypan en hemocytometer. Opnieuw zaad in een maatkolf van 25 cm2 weefselkweek op 5.000 cellen/cm2, en broeden in 5% CO2 op 90% vochtigheid en 37.0 ° C.</li>
</ol>2. voorbereiding van de spheroïden met UCM-MSCs gekweekt op Chitosan Films
<ol><li>Ter voorbereiding van 100 mL 1% (m/v) chitosan oplossing, 1 g chitosan in 99 mL gedestilleerd water (dH2van O) toevoegen en goed mengen met een magneetroerder.</li>
	<li>Voeg 670 µL ijsazijn en blijven mengen totdat chitosan oplost en viskeuze wordt. Dit duurt meestal 3-4 h.</li>
	<li>Voeg 500 µL van chitosan oplossing in elk putje van de plaat 12-well weefselkweek en swirl van de plaat chitosan oplossing gelijkmatig verdelen te dekken alle van het bodem-oppervlak.</li>
	<li>De chitosan oplossing beklede plaat onder laminaire flow kabinet zonder een cover's nachts gedurende 24 uur drogen. Eenmaal gedroogd, zal dunne film worden gevormd en nageleefd plaat.</li>
	<li>Chitosan film te neutraliseren door toevoeging van 1 mL natriumhydroxideoplossing 0,5 N (NaOH) in elk putje en incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur. NaOH van elk putje gecombineerd en wassen elk goed met 1 mL dH2O driemaal. Was nou eenmaal met 1 mL 70% ethanol (EtOH).</li>
	<li>Voeg 1 mL 70% EtOH in elk goed en incubeer te steriliseren chitosan film, 's nachts in laminaire flow kabinet. Gecombineerd resterende EtOH van elk putje in de volgende dag. Wassen elk goed met 1 mL steriele PBS driemaal. Steriliseren chitosan film met ultraviolet licht onder laminaire flow kabinet 's nachts zonder een cover.</li>
	<li>Formulier spheroïden van UCM-MSCs, zaad uitgebreid cellen in elk putje op 5.000 cellen/cm2gepasseerd en incubeer in 5% CO2 op 90% vochtigheid en 37.0 ° C. Opmerking: Cellen kunnen worden geïncubeerd onder hypoxie of normoxia, afhankelijk van de onderzoeker van belang.</li>
</ol>3. weergave van de oppervlakte Markers geanalyseerd via Stroom Cytometry
<ol><li>
Voorbereiding van een schorsing van één cel
	<ol>
<li>Standaard plaat<ol>
<li>Medium verwijderen uit elk putje en spoel tweemaal met kamertemperatuur PBS.</li>
			<li>Loskoppelen cellen met 500 µL van een cel dissociatie reagens in elk putje van de plaat van een 12-well voor 5-10 minuten bij kamertemperatuur.</li>
			<li>Na incubatie, voeg 1 ml buffer (PBS met 0,5% BSA) kleuring in elk putje en meng door pipetteren als u wilt loskoppelen van de cellen.</li>
			<li>Pipetteer celsuspensie in conische tube van 15 mL en centrifugeer bij 150 x g gedurende 5 min.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Chitosan plaat<ol>
<li>Verzamel alle spheroïden door zuigen medium met behulp van een precisiepipet met een 1.000 µL-tip. Verzamelde overbrengingsmedium in een conische buis 15 mL. Na het verzamelen van medium, wassen goed door toevoeging van 1 mL PBS, en breng PBS gewassen in de dezelfde conische tube van 15 mL.</li>
			<li>Centrifugeer spheroïden bij 150 x g gedurende 5 min en bovendrijvende vloeistof verwijderen.</li>
			<li>Voeg 500 µL van het cel dissociatie reagens (bijvoorbeeld, accutase) en incubeer gedurende 5-10 minuten bij kamertemperatuur. Meng pipetting via een tip van 1 mL tot spheroïden distantiëren en niet langer zichtbaar zijn.</li>
			<li>Voeg 1 mL kleuring buffer naar de interne celsuspensie en centrifugeer bij 150 x g gedurende 5 min.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Wassen van cellen
	<ol>
<li>Verwijder de bovendrijvende vloeistof uit de conische buis en resuspendeer de cellen in 3 mL koude kleuring buffer. Cellen op ijs in de hele experiment behoeden voor deze stap.</li>
		<li>Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min (wassen).</li>
		<li>Twee keer wassen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kleuring van cellen
	<ol>
<li>Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 minuten en verwijder de bovendrijvende vloeistof.</li>
		<li>Levensvatbare cellen met behulp van een trypan blauw en hemocytometer tellen. 1 x 106 cellen resuspendeer 50 µL blokkeren buffer (PBS met 10% paard serum) en incubeer gedurende 30 min op ijs.</li>
		<li>Voeg 10 µL fluoresceïne isothiocyanaat (FITC) geconjugeerde antilichamen (CD44, CD90, CD105, CD34, grote histocompatibility complex (MHC) klasse II of isotype controle voor elke antilichaam) en 40 µL van kleuring van buffer, dan Incubeer beschermd tegen licht gedurende 1 uur op het ijs.</li>
		<li>Voeg 3 mL koude kleuring buffer en meng Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min en gecombineerd supernatant (wassen).</li>
		<li>Herhaal tweemaal wassen.</li>
		<li>Resuspendeer de pellet cel in 0,5 mL buffer kleuring</li>
		<li>Voeg 5 µL van 7-AAD (levensvatbaarheid kleurstof) en incubeer gedurende 30 min op ijs</li>
		<li>Analyseren gebeitst celsteekproeven door stroom cytometer. Uitsluiten van puin door hun kleinere WS en FSC en levensvatbare cellen identificeren met lagere opname van 7-AAD. Plot FL1 en FL2 op de y - en x-assen, respectievelijk. Isotype besturingselement gebruiken maken van een poort boven de diagonale lijn. Meet het percentage positief gekleurde cellen in het gebied. Tellen minstens 20.000 evenementen/monster (aanvullende figuur 1).</li>
		<li>Meet het percentage cellen door gating levensvatbare cellen en auto-fluorescentie met antilichamen gekleurd en aftrekken percentage cellen gekleurd met isotype controle.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. bilaterale Patellaire pees Defect Model bij de Rat
<ol><li>Selecteer Sprague-Dawley ratten (volwassen mannelijke, 4 – 5 maanden oud, lichaamsgewicht 350 – 375 g). Opmerking de relatief grote omvang van de ratten gebruikt voor dit model.</li>
	<li>Anesthetize en kunstmatige oog smeermiddel de rat met 8% Sevofluraan in 2 L/min 100% zuurstof geleverd via masker, tot verdwijning van de snuifje-teen reflex in de zaal van de inductie van toepassing.</li>
	<li>Een intramusculaire injectie van Meloxicam (1 mg/kg) als preventieve analgesie beheren.</li>
	<li>Plaats de rat tussen twee flessen van 0,5 L water gevuld met warm water en bedekt met een doek om te handhaven lichaamstemperatuur en positie, terwijl het voorkomen van letsel van de huid. Tape elke extremiteit aan de tabel. Om het risico van onderkoeling, betrekking hebben op het lichaam met noppenfolie (Figuur 1).</li>
	<li>Handhaven van anesthesie met continue stroom van 5% Sevofluraan in 1 L 100% zuurstof mengsel via neus kegel, met het dier op dorsale lighouding op pad het verwarmen van water.</li>
	<li>Om te voorkomen dat de huid trauma, de chirurgische sites niet te knippen. In plaats daarvan toepassen hair remover crème over beide verstikt. Gebruik een tong depressor te verwijderen van de crème en de haren.</li>
	<li>De chirurgische site met chloorhexidine digluconate scrub te schrobben en spoel met 70% ethanol 3 keer.</li>
	<li>Incise de huid met een steriel scalpel #15 mes in een proximaal naar DISTAAL richting, op het craniomedial aspect van het verstikken. Start de incisie ongeveer 1 cm proximaal naar het niveau van de knieschijf en breiden het distale aan de tibiale tuberculum van ongeveer 5 mm.</li>
	<li>Weerspiegelen de huid om de Patellaire pees door het vrijmaken van de onderliggende subcutane weefsel met een mes #15 scalpel bloot te stellen.</li>
	<li>
Met behulp van het #15 scalpel blad, accijnzen de centrale derde van elke Patellaire pees (1 mm) van het distale aspect van de knieschijf naar de tibiale radii.
	<ol>
<li>Hiermee lijnt u een 0.99 mm-diameter Kirschner draad tegen de pees als een sjabloon op de standaardisering van de omvang van het defect in elke ledemaat (Figuur 2).</li>
		<li>Maak 2 full-dikte insnijdingen aan weerskanten van de Kirschner draad met een #15 scalpel mes te isoleren van het centrale deel van de pees (Figuur 3). Resect proximally en distally het middenstuk met fijne Iris schaar (Figuur 4).</li>
		<li>Alvorens te sluiten de fascia van het verstikken, invoegen de klonter (gemengde celsuspensie en ACS) voor de juiste behandeling groepen zoals beschreven in 5.5. Sluit de fascia met een cruciate patroon en huid met een intradermale patroon met 5-0 polyglactin 910 hechtingen (Figuur 5).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Herhaal de procedure voor de contralaterale verstikken. Opmerking: Één defect is willekeurig toegewezen aan een behandeling (stamcellen geconditioneerd op chitosan of gekweekt op standaard platen). Het contralaterale defect is leeg, om te dienen als interne controle.</li>
	<li>Na de operatie, het beheren van 4 tabletten van enrofloxacin (2 mg/tablet, mondeling, eenmaal per dag) en een tablet van meloxicam (2 mg/tablet, oraal, eenmaal per dag) gedurende 7 dagen. Deze doses werden door een laboratorium dierlijke dierenarts aanbevolen en goedgekeurd in het IACUC-protocol.</li>
</ol>5. levering van MSCs binnen de Patellaire pees Defect
<ol><li>Anesthetize een gezond rat die niet voor Patellaire pees defect creatie met 8% Sevofluraan in 2 L/min 100% zuurstof geleverd via masker, tot verdwijning van snuifje-teen reflex in de zaal van inductie gebruikt wordt.</li>
	<li>Verzamelen 5 mL bloed door cardiale punctie van narcose Sprague-Dawley ratten (volwassen mannelijke, 4 – 5 maanden oud, lichaamsgewicht 350 – 375 g), in een 5 mL injectiespuit met een naald van 20 G met 1 mL van zuur-citraat-dextrose (5:1 v/v).</li>
	<li>De rat euthanaseren na cardiale punctie en bloedinzameling, door intracardial injectie van pentobarbital (100 mg/kg), terwijl onder de dezelfde verdoving.</li>
	<li>Centrifugeer het monster bij 350 x g gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Breng supernatant en bewaren (elke 120 µL) aliquots bij-20 ° C tot gebruik.</li>
	<li>Onmiddellijk voordat in vivo implantatie, de bovenstaande hoeveelheid ontdooien en mix 20 µL met 0,5 x 106 MSCs (van 1,9 of 3.1.2.1) los van de standaard platen met behulp van trypsine/EDTA of verzamelen van chitosan platen door te spoelen (met PBS/medium).</li>
	<li>6 µL van 10% calcium chloride (CaCl2) toevoegen aan de resterende 100 µL van ontdooide plasma in een put van 96-wells-plaat om te activeren het plasma en vorming van een klonter induceren (geconditioneerde plasma geactiveerd: ACS).</li>
	<li>Meng celsuspensie (20 µL) en ACS-landen (100 µL) vormen een klonter (Figuur 6). Plaats de klonter binnen het defect van de Patellaire pees gemaakt vóór het sluiten van de fascia van het verstikken (zie stap 4.10.3).</li>
</ol>6. functionele uitkomst
<ol><li>Volgen ratten twee keer per dag op tekenen van pijn, gebaseerd op de rat grimas schaal (RGS)37,38 en zwelling over de implantatie-sites. Opmerking: Een scoresysteem (0-6) werd ontwikkeld om ambulante functie op basis van 3 activiteiten, met inbegrip van getimede hind-limb staande met de voorpoten ondersteund (0-3) wordt geëvalueerd, getimede zonder hulp hind-limb staande (0-2), en de mogelijkheid om te klimmen van een (17 cm kunststof kooi muur (0-1) Tabel 1).</li>
	<li>Ratten voor de twee hind-limb staande activiteiten evalueren in de ochtend en in de avond van elk punt van de tijd voor het berekenen van een gemiddelde score.</li>
	<li>Evalueren van ratten voor de mogelijkheid om met succes het beklimmen van een muur van 17 cm kunststof kooi met beide hind ledematen bereiken van de top.</li>
</ol>7. Bruto uiterlijk en histopathologisch onderzoek van de Patellaire pees
<ol><li>Euthanaseren van ratten op 7 dagen (om te evalueren ontsteking) of 28 dagen (om te evalueren weefsel genezing) post behandeling door intracardial injectie van pentobarbital (100 mg/kg) onder verdoving met 8% Sevofluraan en 2 L 100% zuurstof via masker geleverd.</li>
	<li>Oogst patella-pees-tibia radii eenheden door scalpel en schaar na euthanasie. Zacht weefsel en de ligamenten rond de verstikken, met uitzondering van de Patellaire pees verwijderen.</li>
	<li>Het onderzoeken van elk monster voor bruto uiterlijk en verdikking van de pees (Figuur 7).</li>
	<li>Oriënteren het model door het plaatsen van een chirurg de knoop van de 5.0 Polydioxanone op het proximale en laterale aspect van de pees. Repareren van elk specimen in 10% neutraal gebufferde formaline-oplossing en transversale secties (5 µm) te verkrijgen van het midden gedeelte van elke pees.</li>
	<li>Vlek van de secties met haematoxyline en eosine en Masson van Trichrome kleuring na standaardprotocollen.</li>
	<li>Sectie voor het detecteren van de aanwezigheid van hematoom binnen het defect, evenals de pathologische veranderingen zoals ontsteking te onderzoeken.</li>
	<li>Evalueren de histologische scoren van secties met behulp van de eerder gepubliceerde noterend systeem, op basis van collageen rang, mate van angiogenese en kraakbeen vorming (tabel 2)39.</li>
</ol>

De auteurs hebben geen conflict van belang om te vermelden.

Paarden cellen werden geselecteerd voor dit project, omdat we uiteindelijk willen beproeven van kandidaat-benaderingen in het beheer van de natuurlijke Tendinopathieën in paarden. Inderdaad, pees blessures bij paarden zijn aantrekkelijk als natuurlijke modellen van tendinopathie in de mens vanwege de biologische gelijkenis tussen de paarden oppervlakkige digitale flexor en achillespees in mens41. De cel oppervlakte markers CD44, CD90, CD105, CD34 en MHC II werden geselecteerd voor immunophenotypin...

Pees letsel is een van de meest voorkomende oorzaken van aanzienlijke pijn en spier atrofie over soorten1. In de diergeneeskunde zijn pees en een ligament letsel speciale belangstelling voor paarden, en 82% van alle blessures bij RAS paarden impliceren het houdings-en bewegingsapparaat, 46% van die van invloed zijn op pezen en ligamenten2,3. Littekenvorming is van invloed op de biomechanische eigenschappen van genezen pezen en verklaart de bewaakte prognose voor terugkeer naar atletische gebruik na flexor pees verwondingen; Re-blessure treedt op binnen 2 jaar in maximaal 67% van de paarden behandeld conservatief4. Regeneratieve geneeskunde biedt nieuwe alternatieven voor een aandoening die traditionele behandelingen daagt. Autologe stamcel therapie heeft enkele bemoedigende resultaten5,6 , maar wordt beperkt door de morbiditeit geassocieerd met weefsel collectie, vertraagde administratie als gevolg van verwerking/herprogrammering van de cellen en de invloed van de gezondheidstoestand van de patiënt (zoals leeftijd) op de eigenschappen van de stam cellen7,8. Deze beperkingen geven een reden voor het onderzoeken van allogene cellen van de stam als alternatief off-the-shelf. Foetale adnexen-afgeleide cellen zijn aantrekkelijke kandidaten omdat ze omzeilen de ethische bezwaren en de kans op vorming van Teratoom embryonale stamcellen is gekoppeld. Onder foetale adnexen is navelstreng matrix (UCM), gelei van Wharton, ook wel genoemd overvloedig en gemakkelijk te verzamelen.
Ongeacht de bron van de cel is versterking van de stemness essentieel voor het opzetten van een cel bank voor allogene regeneratieve geneeskunde. Vanuit een functioneel oogpunt, kan stemness worden gedefinieerd als de mogelijkheden voor zelf-vernieuwing en multi lineage differentiatie9. Bewijs van stemness is afhankelijk van de proliferatie en differentiatie testen, samen met expressie van gene markeringen Nanog, Oct4en Sox2, 9. Een strategie ter verbetering van de stemness is afhankelijk van het gebruik van biomaterialen om te dienen als ongeldig vulstoffen en verbetering van de proliferatie en differentiatie van de UCM-MSCs vervoerders. Deze benadering elimineert bezorgdheid over manipulatie van transcriptionele factoren om te herprogrammeren van volwassen cellen in geïnduceerde pluripotente cellen. Onder biomaterialen beschouwd als potentiële dragers voor stamcellen, is chitosan aantrekkelijk voor de biocompatibiliteit en afbreekbaarheid10. Deze natuurlijke aminopolysaccharide wordt gevormd door de alkalische deacetylation van chitine, de tweede meest voorkomende natuurlijke polysacharide, hoofdzakelijk verkregen als een subproduct van schelpdieren10. We hebben eerder onderzocht van interacties tussen MSCs en chitosan steigers en waargenomen de vorming van spheroïden11,12,13,14,15, 16. we ook gemeld op de superioriteit van chondrogenesis op chitosan matrices12,13,14,15,16,17, 18. Meer recentelijk, twee onafhankelijke studies beschreven spheroïden formatie door vetweefsel en weefsel van de placenta afgeleid MSCs gekweekt op een chitosan film19,20. Deze formatie van spheroïden niet alleen verbeterd stemness, maar ook het behoud van stamcellen na in vivo implantatie20verbeterd.
De prevalentie en de morbiditeit van tendinopathie over soorten hebben gevraagd de ontwikkeling van experimentele modellen bestuderen de pathofysiologie van Tendinopathieën en testen van nieuwe therapieën zoals stamcel injecties. Bij paarden is collagenase-geïnduceerde tendinitis een gemeenschappelijk model aan doelmatigheid met behulp van MSCs in pees reparatie21aan te tonen. De relevantie van deze aanpak is beperkt, zoals injecties veroorzaken acute ontstekingsreactie, overwegende dat klinische Tendinopathieën meestal het gevolg van chronische overspannenheid22,23. Bovendien, chemische inductie van pees ziekte induceert een genezende reactie en het verminderde genezingsproces aanwezig in klinische gevallen22,23niet gerepliceerd. Excisie van een segment van de oppervlakkige digitale flexor pees is bestempeld als een chirurgische model van tendinitis in paarden24. Meer recentelijk, een minimaal invasieve benadering werd gebruikt om de traumatische schade beperken tot de centrale kern van de oppervlakkige digitale flexor pees25. Chirurgische modellen doen niet de vermoeidheid-mechanisme dat kan leiden tot natuurlijke pees ziekte, en de neiging om het gebrek aan reproduceerbaarheid in de omvang van schade gemaakt25simuleren. Ongeacht het model, de morbiditeit en de kosten in verband met paarden modellen van pees zijn ziekten extra beperkingen, die een belang in knaagdier modellen te als een eerste stap voor in vivo evaluatie van nieuwe therapieën rechtvaardigen.
Een van de belangrijkste voordelen van experimentele modellen bij knaagdieren bestaat uit de kosten en de mogelijkheid om controle van Inter individuele variabiliteit. Knaagdieren kunnen worden gestandaardiseerd ten opzichte van verschillende fysiologische factoren als gevolg van hun snelle groei en relatief korte levensduur, beperking van de bronnen van variatie en dus vermindering van het aantal dieren nodig voor de detectie van verschillen. Strategieën voor het opwekken van de pees ziekten bij knaagdieren hebben vertrouwd op chemische inductie, maar ook op chirurgische oprichting van gedeeltelijke pees gebreken21. Chirurgische modellen natuurlijke Tendinopathieën beter dan chemische modellen kunnen simuleren, maar kunnen leiden tot hogere morbiditeit en katastrofisch mislukking van de beschadigde pees. In dat opzicht lijken ratten betere kandidaten dan muizen voor deze modellen, aangezien hun grootte staat toe de verwezenlijking van grotere defecten, teneinde de evaluatie van de genezing van weefsel te vergemakkelijken. Sprague-Dawley ratten zijn gebruikt in experimentele studies van Tendinopathieën in vier belangrijke pees groepen: rotator cuff, musculus flexor, Achilles en patellacomponenten pezen26. Daaronder zijn de modellen waarbij de Patellaire pees vooral aantrekkelijk vanwege de grotere omvang van deze pees en het gemak van toegang tot het27. De Patellaire pees hecht de spier van de quadriceps aan de tibiale radii. Binnen dit mechanisme extensor is de knieschijf een sesambeen die regisseert de actie van de quadriceps en bakent de proximale omvang van de Patellaire pees. De aanwezigheid van bony ankers op de proximale en distale afmetingen van de Patellaire pees vergemakkelijkt biomechanische proeven. Modellen waarbij de Patellaire pees meestal rekenen op eenzijdige chirurgische gebreken, met een contralaterale intact pees een besturingselement28,29bijeenkomen. De meest voorkomende Patellaire pees defect model omvat middendoor van het centrale deel (1 mm in de breedte) van de Patellaire pees van de distale apex van de knieschijf naar het inbrengen van de tibiale radii, terwijl de contralaterale Patellaire pees intact is gelaten. Maatregelen van uitkomsten hebben opgenomen histologie, niet-destructieve biomechanische proefneming of biomechanische testen tot mislukking, echografie imaging ex vivo fluorescentie imaging, bruto observatie en functionele tests28,30 ,31. Unilaterale modellen staan geen vergelijking van een voorgestelde behandeling met conservatieve beheer van een soortgelijke schade binnen hetzelfde dier. Vergelijking tussen verschillende behandelingen vereist ook afzonderlijke dieren. Een bilaterale model zou elimineren tussen afzonderlijke varianten en verminderen van het aantal dieren dat nodig is voor een studie32. Echter bilaterale verwondingen kunnen verhogen morbiditeit en evaluatie van de behandeling kan worden belemmerd door bilaterale kreupelheid. Het gebruik van bilaterale Patellaire pees defecten in ratten maar focus verslag een paar studies kort over de effecten van behandelingen in plaats van peri-operatieve beheer en morbiditeit van de model33,,34.
Doel van deze studie op lange termijn is het ontwikkelen van een strategie ter verbetering van de stemness en in vivo overleving van de UCM-MSCs bestemd voor allogene transplantatie. Om dit te bereiken, hebben we onlangs verbeterde stemness voor UCM-MSCs door vorming van spheroïden gemeld op chitosan film en incubatie onder hypoxische milieu35. Deze eigenschappen in vitro werden geassocieerd met verbeterde biomechanische eigenschappen van Patellaire pees gebreken behandeld met geconditioneerde UCM-MSCs. op basis van deze resultaten, de rat bilaterale Patellaire pees defect model lijkt geschikt voor het testen van de kandidaat-lidstaten behandelingen voor pees verwondingen36. Het doel van de studie gemeld hier is het verschaffen van gedetailleerde protocollen voor isolatie en karakterisatie van UCM-MSCs, voorbereiding van een biologische expresbezorgingssysteem voor stamcellen, creatie en behandeling van bilaterale patella pees gebreken en postoperatieve herstel en evaluatie van weefsel genezing binnen de gebreken.

<table><tbody><tr><td>PBS 10x</td><td>Hyclone</td><td>SH30258.01</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Collagenase type IA</td><td>Worthington</td><td>LS004197</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>DMEM low glucose</td><td>Hyclone</td><td>SH30021.FS</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Hyclone</td><td>SH30910.03</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin 100x</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Trypsin 0.25%</td><td>Hyclone</td><td>SH30042.01</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AT104</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Hyclone</td><td>SV30084.01</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Chitosan</td><td>Sigma</td><td>C3646</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide</td><td>Sigma</td><td>S8045</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Hyclone</td><td>SH30574.01</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Round bottom polystyrene tube</td><td>Corning</td><td>149591A</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Mouse anti-horse CD44 (FITC)</td><td>AbD serotec</td><td>MCA1082F</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Mouse anti-rat CD90 (FITC)</td><td>AbD serotec</td><td>MCA47FT</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Mouse anti-horse MHC-II (FITC)</td><td>AbD serotec</td><td>MCA1085F</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Mouse IgG1 (FITC) - Isotype Control</td><td>AbD serotec</td><td>MCA928F</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Mouse monoclonal [SN6] to CD105 (FITC)</td><td>abcam</td><td>ab11415</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Mouse IgG1 (FITC) - Isotype Control</td><td>abcam</td><td>ab91356</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Mouse anti-human CD34 (FITC)</td><td>BD</td><td>BDB560942</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Mouse IdG1 kappa (FITC)</td><td>BD</td><td>BDB555748</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>7-AAD</td><td>BD</td><td>BDB559925</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>BD Accuri C6 Flow Cytometer</td><td>BD</td><td></td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Vacutainer 5 mL</td><td>Med Vet International</td><td>RED5.0</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Acid-citrate-dextrose</td><td>Sigma</td><td>C3821</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Calcium Chloride</td><td>Sigma</td><td>C5670</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Sevoflurane</td><td>JD Medical</td><td>60307-320-25</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Rats</td><td>Charles River</td><td>Strain code: 400</td><td>Experimenteel dier</td></tr><tr><td>Rat surgical kit</td><td>Harvard apparatus</td><td>728942</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Surgical Blade #15</td><td>MEDLINE</td><td>MDS15115</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Rat MD's Baytril (2 mg/Tablet), Rimadyl (2 mg/Tablet)</td><td>Bio Serv</td><td>F06801</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Polyglactin 910, 5-0</td><td>Ethicon</td><td>J436G</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Eosin alcohol shandon</td><td>Thermo scientific</td><td>6766007</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Harris Hematoxylin</td><td>Thermo scientific</td><td>143907</td><td>Consumable</td></tr></tbody></table>

evaluatie van stamcellen therapieën in een bilaterale patellaire pees letsel model bij ratten

Evaluation of Stem Cell Therapies in a Bilateral Patellar Tendon Injury Model in Rats

Regeneratieve geneeskunde biedt nieuwe alternatieven voor voorwaarden die uitdaging van traditionele behandelingen. De prevalentie en de morbiditeit van tendinopathie over soorten, hebben gecombineerd met de beperkte helende eigenschappen van dit weefsel, gevraagd het zoeken naar cellulaire therapieën en aangedreven de ontwikkeling van experimentele modellen om te studeren van hun doeltreffendheid. Mesenchymale stamcellen, navelstreng dik, (UCM-MSC) matrix afkomstige zijn aantrekkelijke kandidaten omdat ze overvloedig, gemakkelijk te verzamelen, omzeilen de ethische bezwaren en het risico van Teratoom formatie, maar lijken op primitieve embryonale stamcellen nauwer dan volwassen weefsel afkomstige MSCs. significante belang heeft zich gericht op chitosan als een strategie ter verbetering van de eigenschappen van MSCs door sferoïde vorming. Dit papier details technieken te isoleren van de UCM-MSCs, spheroïden op chitosan film voor te bereiden en analyseren het effect van sferoïde vorming op oppervlakte marker expressie. Bijgevolg, oprichting van een bilaterale Patellaire pees letsel model bij ratten wordt beschreven voor in vivo implantatie van UCM-MSC spheroïden gevormd op chitosan film. Geen complicatie werd waargenomen in de studie met betrekking tot de morbiditeit, benadrukken stijgende effecten, of weefsel infectie. De totale functionele score van de bediende ratten op 7 dagen was lager dan dat van normale ratten, maar keerde terug naar normale binnen 28 dagen na de operatie. Histologische scores van weefsel-genezende bevestigde de aanwezigheid van een klonter in behandelde gebreken geëvalueerd op 7 dagen, afwezigheid van vreemd lichaam reactie en genezing vordert na 28 dagen. Deze bilaterale patella pees defect model was besturingselementen Inter-individuele variatie via de oprichting van een interne controle in elke rat, aanvaardbaar morbiditeit is gekoppeld en detectie van verschillen tussen onbehandelde pezen en behandelingen toegestaan.

In de huidige studie, zijn de resultaten gepresenteerd zoals bedoel ± SD (standaarddeviatie). Cellen werden geïsoleerd uit de navelstreng koorden van 6 merries en percentage van geïsoleerde cellijnen uiting van iedere markeerdraad cel oppervlakte onder standaard of chitosan conditionering werden vergeleken met een test van Friedman, als een niet-parametrische variantie-analyse met herhaling maatregelen. Voor de pees defect model creatie, 8 ratten werden gebruikt voor 7 dagen na chirurgie ...

Deze paper beschrijft de voorbereiding en de evaluatie van de navelstreng mesenchymale stamcellen matrix afkomstige spheroïden met een bilaterale Patellaire pees defect model in een rat. Dit model werd werd geassocieerd met een aanvaardbaar morbiditeit en gevonden voor het detecteren van de verschillen tussen onbehandelde en behandelde pezen, en tussen de twee behandelingen getest.

Evaluatie van stamcellen therapieën in een bilaterale Patellaire pees letsel Model bij ratten

Regenerative medicine provides novel alternatives to conditions that challenge traditional treatments. The prevalence and morbidity of tendinopathy across ...

De algemene doelen van dit bilaterale ratmodel zijn om het gebruik van dieren te optimaliseren en behandelingskandidaten voor peesdefecten te evalueren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van alle belangrijke vragen op het gebied van orthopedie. Zoals de evaluatie van cellulaire therapie bij tendinopathie.Het belangrijkste voordeel van dit model is dat het interindividuele variatie controleert, waardoor het aantal dieren dat nodig is om verschillen tussen behandelingen te detecteren wordt verminderd. Visuele demonstratie van het model is cruciaal omdat het creëren van bilaterale gestandaardiseerde peesdefecten bij ratten moeilijk te leren is. Het model vereist een goede kennis van de lokale anatomie, sterke basischirurgische vaardigheden en precisie bij het werken aan kleine structuren.Om te beginnen, was een geoogst paardennaaldraak twee keer in een buis van 50 milliliter met PBS op kamertemperatuur met antibiotica. Breng vervolgens het weefsel over naar een 150 millimeter plaat en snijd het in fragmenten van twee inch lang. Breng vervolgens de fragmenten over naar een buis van 50 milliliter en was ze met PBS met antibiotica om het bloed te verwijderen.Doe dit twee of drie keer op kamertemperatuur. Snijd vervolgens de gefragmenteerde delen van de navelstreng longitudinaal om de vaten die door de lengte lopen bloot te leggen. Verwijder deze vaten, waaronder twee slagaders en een ader, met behulp van pincetten en schaar.Verzamel nu van twee of drie fragmenten de geleiachtige matrix die de vaten omringt. Schraap het weg met een scalpel. Snijd vervolgens de geleiachtige matrix, ook bekend als Wharton's Jelley, in fijne stukjes.Breng vervolgens de geleiachtige matrix over in een buis van 50 milliliter met 15 milliliter 0,1% collagenase type 1A in PBS en incubeer het weefsel bij 37 graden Celsius met zacht schudden gedurende drie tot vier uur totdat het volledig is opgelost. Centrifugeer vervolgens het gedigesteerde weefsel en aspireer het supernatant. Suspenderen we het gedigesteerde weefsel nu in 15 milliliter PBS en mengen door te pipetteren.Herhaal vervolgens deze wassing met PBS drie keer met een langzamere centrifugatie. Na de laatste wassing, resuspendeer de cellen in 15 milliliter PBS en gebruik vervolgens een celstrainer van 100 micron om de cellen te filteren en centrifugeer gedurende vijf minuten bij 150 keer g om de cellen te verzamelen. Resuspendeer de cellen in 10 milliliter vers bereid kweekmedium bij 37 graden Celsius.Breng de suspensie over in een kweekflacon van 25 vierkante centimeter en incubeer de cellen, waarbij het medium om de derde dag wordt ververst. Wanneer de cellen 70 tot 80% confluentie bereiken, passeer ze, aspireer het medium en was de cellen twee keer met PBS op kamertemperatuur zonder antibiotica. Gebruik vervolgens drie milliliter 0,25% trypsine edta om de cellen los te maken.Beëindig de reactie met een toevoeging van zes milliliter warm medium. Verzamel de gesuspendeerde cellen en pellet ze. Gooi het supernatant weg en resuspendeer de pellet in één milliliter medium.Om de overdracht te voltooien, zaai een weefselkweekflacon met 5.000 cellen per vierkante centimeter en blijf de kweek laten groeien. Bereid om te beginnen verse chitosanoplossing. Laad vervolgens elke put van een 12-welplate met 500 microliter oplossing.Swaal de plaat om de oplossing over alle oppervlakken te verdelen. Droog vervolgens de plaat onder een laminaire stromingskast. Na 16 tot 24 uur zal er een dunne film van chitosan in de putjes van de plaat ontstaan.Neutraliseer deze film door een milliliter 0,5 normaal natriumhydroxide toe te voegen aan elke put. Incubeer vervolgens de plaat gedurende twee uur op kamertemperatuur. Aspibeer later het natriumhydroxide uit elke put en was vervolgens elke put met een milliliter gedistilleerd water.Voer drie waterwasbeurten uit en was vervolgens elke put met een milliliter 70% ethanol. Nadat de ethanolwas is verwijderd, vervang deze door nog een milliliter 70% ethanol en incubeer de plaat een nacht in een laminaire stromingskast om de chitosanfilm te steriliseren. Aspibeer de volgende dag het resterende ethanol uit elke put en was elke put drie keer met PBS.Verwijder het PBS en steriliseer vervolgens de chitosanfilm door een nachtelijke directe blootstelling aan ultraviolet licht zonder het deksel. Om sferoïden van uit navelstreng afgeleide mesenchymatische stamcellen te vormen, zaai de putten met 20.000 cellen en incubeer de plaat onder normale of hypoxische omstandigheden. Plaats een geanesthetiseerde rat tussen twee flessen van 0,5 liter gevuld met warm water en bedek de flessen met een doek om de rat warm te houden zonder huidletsel te veroorzaken.Om het risico op onderkoeling te verminderen, bedek het lichaam met bubble wrap. Om huidtrauma te voorkomen, breng vervolgens haartjesverwijderingscrème aan op beide knieën en gebruik een tongdepressor om de crème en het haar te verwijderen. Plak vervolgens elk ledemaat vast aan de tafel.Schrob nu de operatieplaats met chloorhexidine digluconaat en spoel het af met 70% ethanol. Doe dit drie keer en ga verder met de operatie. Met een steriele scalpel nummer 15, maak een incisie in de huid in proximale tot distale richting op de craniale mediale aspect van de knie.Begin de incisie ongeveer een centimeter proximaal van het niveau van de patella en verleng deze ongeveer vijf millimeter distaal tot de tibiale tuberkel. Bevrijd vervolgens het onderliggende onderhuidse weefsel met de scalpel en vouw de huid omhoog om de pees van de knieschijf bloot te leggen. Richt nu een kirschnerdraad met een diameter van 0,99 millimeter uit tegen de pees van de knieschijf tussen het distale aspect van de knieschijf tot de tibiale tuberositas.Terwijl je de draad stabiel houdt, maak vervolgens met de scalpel insnijdingen aan beide zijden van de draad om een portie pees van ongeveer een millimeter breed te vrijmaken. Vervolgens resecteer het centrale gedeelte proximaal en distaal met behulp van fijne irisschaar. Laat intussen een assistent het bloedstolsel bereiden.Om dit te doen,

evaluation-stem-cell-therapies-bilateral-patellar-tendon-injury-model

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Een experimentele techniek voor de behandeling van osteochondrale defecten in het konijn kniegewricht beschreven. De implantatie van allogene mesenchymale stamcellen in osteochondrale defecten heeft een veelbelovende ontwikkeling op het gebied van weefsel engineering. De voorbereiding van...

Behandeling van Osteochondrale Defecten in de Rabbit&#39;s kniegewricht door Implantatie van Allogeneic mesenchymale stamcellen in fibrinestolsels

Dit protocol beschrijft de radiolabeling van paarden mesenchymale stamcellen en hun implantatie in peesletsels bij het paard om celoverleving en weefselverdeling te bepalen met behulp van gamma-scintigrafie.

In vivo beeldvorming en bijhouden van Technetium-99m gelabelde beenmerg mesenchymale stamcellen in Equine tendinopathie

Diermodellen zijn belangrijke hulpmiddelen voor de evaluatie van door weefseltechniek ontwikkelde grafts. Dit artikel presenteert het protocol voor het bereiden van een elektrospunnend biologisch afbreekbaar polymeer graft voor gebruik in weefseltechniek van het voorste kruisband, evenals een chirurgisch protocol voor implantatie in een rattenmodel.

Athymische Rat Model voor de Evaluatie van Engineered voorste kruisband Grafts

We beschrijven een in vivo protocol om dorsiflexie van de voet te meten na stimulatie van de peroneale zenuw en contractie van het anterieure crurale compartiment van de achterpoot van de rat. Dergelijke metingen zijn een onmisbaar translationeel hulpmiddel voor het evalueren van skeletspierpathologie en weefselengineeringbenaderingen voor spierreparatie en -regeneratie.

toepassingen van<em&gt; In Vivo</em&gt; Functioneel testen van de Rat tibialis anterior voor de evaluatie van Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Dit protocol beschrijft het evaluatieproces van genezing van pezen bij ratten die zijn ingespoten met allogene platelet rich plasma (PRP) of zoutoplossing na het verwijderen van deel van de achillespees. De voortgang van de genezing van de pees wordt geëvalueerd op verschillende tijdstippen met behulp van verschillende types van analyses.

Effecten van allogene Platelet-Rich Plasma (PRP) op het genezingsproces van verdeelde Achilles pezen voor ratten: een methodologische beschrijving

Een driedimensionaal uniaxiale mechanische stimulatie bioreactorsysteem is een ideale bioreactor voor tenogeen-specifieke differentiatie van pees-afgeleide stamcellen en neo-peesvorming.

Toepassing van een drie-dimensionale uniaxiale mechanische stimulatie bioreactor systeem om tenogene differentiatie van pees-afgeleide stamcellen induceren

Dit protocol stelt een full-thickness cartilage defects (FTCD) model vast door gaten te boren in de femorale trochleaire groef van ratten en het daaropvolgende pijngedrag en histopathologische veranderingen te meten.

Ontwikkeling en evaluatie van een rattenmodel van kraakbeendefecten van volledige dikte

Deze studie beschrijft procedures voor het vaststellen van een chronisch vergelijkbaar letsel aan de rotator cuff (RC) van konijnen. In het bijzonder wordt de verwonding gecreëerd in de subscapularis (SSC) spierpees/myotendineuze eenheid om de menselijke RC-anatomie en pathofysiologie na te bootsen, inclusief ernstige spiervetdegeneratie (FD). Dit protocol kan worden toegepast om RC-letsels te bestuderen en regeneratieve therapieën te beoordelen.

Ontwikkeling van een chronisch model voor rotator cuff-letsel bij konijnen voor de studie van fibrose en spierdegeneratie

Hier presenteren we een assembloid-modelsysteem om peescellulaire overspraak na te bootsen tussen het dragende peeskernweefsel en een extrinsiek compartiment met celpopulaties die worden geactiveerd door ziekte en letsel. Als belangrijke use case laten we zien hoe het systeem kan worden ingezet om ziekterelevante activering van extrinsieke endotheelcellen te onderzoeken.

Engineering Tendon Assembloids om cellulaire overspraak bij ziekte en reparatie te onderzoeken

Een muis model van de In Utero Transplantatie

Leer een bilateraal rattenmodel voor het evalueren van stamceltherapieën bij patellaire peesdefecten. Deze methode minimaliseert interindividuele variatie en optimaliseert het diergebruik in orthopedisch onderzoek naar peesherstel.

Evaluatie van stamcellen therapieën in een bilaterale Patellaire pees letsel Model bij ratten

Meer video's verkennen