Ftaalzuur Ester-Binding DNA Aptamer selectie, karakterisering en toepassing aan een elektrochemische Aptasensor
March 21st, 2018
Een protocol voor de in vitro selectie en karakterisering van groepsspecifieke ftaalzuur ester-binding DNA aptamers wordt gepresenteerd. De toepassing van de geselecteerde aptamer in een elektrochemische aptasensor is ook inbegrepen.
Het algemene doel van deze procedure is om groepsspecifieke DNA-aptameren te selecteren voor zeer hydrofobe, kleine moleculen en om de geselecteerde aptamer te gebruiken voor het ontwikkelen van een gevoelige elektrochemische biosensor. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het aptamer-selectieveld te beantwoorden, over hoe groepsspecifieke aptameren te selecteren en te karakteriseren wanneer doelen zeer hydrofobe moleculen zijn. Hoewel het meest nuttige deel van deze methode de ontwikkeling van elektrochemische biosensoren is, voor de detectie van titels.
Deze biosensoren zouden ook moeten werken voor onze aptamer affiniteitsmetingen. Om de reactie te starten, voeg 100 microliter RNase-vrij water toe aan het gezuiverde aptamer PCR-product. Vortex de mengsel totdat het precipitaat is opgelost.
Lambda exonuclease reactie is gevoelig voor de zoutconcentratie en is een product dat zou moeten worden vermenigvuldigd door ethanolprecipitatie maar een andere isopropanol. Plaats in elk van de vijf microcentrifugebuizen vijf microliter van de aptameroplossing, 11 microliter Rnase-vrij water en twee microliter 10x reactiebuffer. Voeg twee microliter Rnase-vrij water en oplossingen van twee, vijf, acht en 10 eenheden van lambda exonuclease in Rnase-vrij water toe aan elke buis.
Meng goed met voorzichtig pipetteren. Incubeer de buizen gedurende 35 minuten bij 37 graden Celsius en gedurende 15 minuten bij 80 graden Celsius. Houd de buizen vervolgens op vier graden Celsius en bereid een 12% native paginagel voor.
Voeg aan elke buis een microliter ladingsverf en vier microliter Rnase-vrij water toe. Laat de mengsels in de native paginagel gedurende 45 minuten draaien op 150 volt. Identificeer de laagste hoeveelheid lambda exonuclease die nodig is om volledig enkelstrengs DNA te genereren.
Voer een grootschalige reactie uit om enkelstrengs DNA te genereren. Voor elk te testen bindingsdoel, incubeer 10 microliters gemiddeld functionele DBP-gecodeerde magnetische kralen met 500 microliters van een micromolaire oplossing van DBP-1 gedurende een uur bij kamertemperatuur terwijl u draait. Gooi vervolgens het supernatant weg.
Was de kralen vier keer met 200 microliter porties van PAE binding buffer en schud de kralen opnieuw op in 10 microliter PAE binding buffer. Verkrijg 10 micromolaire bindingsdoel testdispersies in PAE binding buffer. Het is geweldig om de dispersieversie van de hydrofobe doelen in PAE binding buffer te gaan.
Om ervoor te zorgen dat er verrijking van de bibliotheek is, werden geselecteerd onder affiniteitstests. Voeg 10 microliter DBP-1 gecodeerde kralen toe aan 110 microliter van elke doeltestoplossing. Incubeer de mengsels gedurende een uur en verzamel de supernatanten door magnetische scheiding.
Verdun de supernatanten 100 keer en gebruik drie microliter voor elke kwantitatieve PCR. Bereken de relatieve affiniteiten door het aantal DBP-1 vrijgelaten in de aanwezigheid van het testmonster te delen door het aantal DBP-1 vrijgelaten in alleen PAE binding buffer. Voorafgaand aan het uitvoeren van de metingen synthetiseer en zuiver de DBP-1-gebaseerde thiolated kernsequentieprobe en de signaalprobe.
Reconstitueer de thiolated probe en de signaalprobe en als 100 micromolaire oplossingen in nucleasevrij water. Volgende polijst een twee millimeter diameter gouden elektrode tot een spiegelachtige oppervlakte met een, 0,3 en 0,5 micron alumina poeder en een microvezeldoek gedurende vijf minuten elk. Soniceer de elektrode gedurende vijf minuten in ultra zuiver water na elke polijst.
Dompel de gepolijste elektrode in een 0,5 molaire oplossing van zwavelzuur. Reinig de elektrode met 35 opeenvolgende cyclische voltammetrie scans van min 0,4 tot plus 1,2 volt versus kwikcalomel bij 100 millivolt per seconde. Bereid vervolgens in een dunne wandcentrifugebuis een mengsel van 0,5 micromolaire thiolated probe DBP-1.
En 0,5 micromolaire FC gemodificeerde DBP-1 in 100 microliters PBS. Verhit de mengsel in een waterbad ingesteld op 95 graden Celsius gedurende 10 minuten. Laat vervolgens het mengsel afkoelen tot kamertemperatuur in het waterbad.
Voeg een microliter van een 10 millimolair TCEP stamoplossing toe aan het afgekoelde mengsel en houd het bij kamertemperatuur gedurende een uur. Dompel vervolgens de schone gouden elektrode in het mengsel gedurende 12 uur bij kamertemperatuur. Spoel de elektrode met PBS en dompel vervolgens de elektrode in een 1 millimolair oplossing van thiolated PEG in PBS gedurende een uur.
Spuil de elektrode grondig met doelvrije PAE binding buffer en dompel de elektrode in de buffer. Soniceer vervolgens elektrolytische cellen van platina tegenelektrode en een verzadigd calomel referentie-elektrode gedurende twee minuten elk in ultra zuiver water en PAE binding buffer op volgorde. Open de vierkante golf van voltammetrie instrumentsoftware en voer de experiment parameters in.
Vul een schone elektrolytische cel met doelvrije PAE binding buffer. Verbind de drie schone elektroden aan een potentiostaat en dompel de elektroden in de buffer. Verwerf een achtergrond SWV scan.
Dompel vervolgens de gouden werkelektrode in een 10 picamolair DEHP oplossing in PAE binding buffer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Spuil de elektrode grondig met PAE binding buffer. Dompel alle drie de elektroden in verse PAE binding buffer en verzamel een andere SWV curve met behulp van dezelfde parameters als eerder.
Herhaal dit proces met toenemende concentraties van DEHP om een titratiecurve te verkrijgen. De minimale hoeveelheid lambda exonuclease die nodig is om alleen enkelstrengs DNA te verkrijgen, werd gevonden om twee eenheden te zijn op basis van kleinschalige reacties. De aptamer kandidaat DBP-1 werd geïdentificeerd door SELEX gevolgd door high throughput sequencing.
DBP-1 vertoonde goede groepsspecificiteit voor PAE congeneren. Een elektrochemische aptasensor met behulp van DBP-1 reageerde selectief op DEHP boven andere gebruikelijke milieuverontreinigingen. De aptasensor was zeer gevoelig voor DEHP met de respons bij concentraties zo laag als 10 picamolair.
Laserdeeltje waar selectie en karakteriser
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor de in vitro selectie en karakterisering van groepsspecifieke DNA aptamers die binden aan hydrofobe kleine moleculen. Bovendien bespreekt het de toepassing van deze geselecteerde aptamers in de ontwikkeling van een elektrochemische biosensor.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Biochemie
- Biofysica
- Analytische Chemie
Achtergrond
- DNA aptamers zijn korte, enkelstrengse DNA-moleculen die zich kunnen binden aan specifieke doelen.
- Hydrofobe kleine moleculen stellen uitdagingen voor bij de selectie van aptamers vanwege hun eigenschappen.
- Elektrochemische biosensoren bieden een gevoelige methode voor het detecteren van aptamer-doelinteracties.
- Deze studie richt zich op de behoefte aan effectieve methoden om aptamers voor dergelijke uitdagende doelen te selecteren.
Doel van het onderzoek
- Om een protocol te ontwikkelen voor het selecteren van groepsspecifieke DNA aptamers.
- Om deze aptamers te karakteriseren op hun bindingsaffiniteit aan hydrofobe moleculen.
- Om de geselecteerde aptamers te gebruiken bij het creëren van een gevoelige elektrochemische biosensor.
Gebruikte methoden
- In vitro selectie van DNA aptamers door systematische evolutie.
- Karakterisering van aptamer bindingseigenschappen.
- Ontwikkeling van een elektrochemische aptasensor voor detectie.
- Gebruik van RNase-Vrij water om aptamer oplossingen te bereiden.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle selectie van groepsspecifieke DNA aptamers voor hydrofobe doelen.
- Gedemonstreerde bindingsaffiniteit van geselecteerde aptamers.
- Ontwikkeling van een elektrochemische biosensor die in staat is om aptamer-doelinteracties te detecteren.
- Methodologie biedt inzichten in aptamer selectie voor uitdagende doelen.
Conclusies
- Het protocol selecteert en karakteriseert effectief DNA aptamers voor hydrofobe moleculen.
- Elektrochemische biosensoren kunnen worden ontwikkeld met behulp van deze aptamers.
- Deze studie draagt bij aan het begrip van aptamer selectiemethodologieën.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Discovery-stage detection of hydrophobic small molecules like phthalic acid esters (PAEs) is limited by the lack of robust, group-specific recognition elements. This protocol enables the selection and quantitative characterization of DNA aptamers for highly hydrophobic targets, supporting the development of ultrasensitive electrochemical biosensors. The approach advances predictive confidence and portfolio triage for environmental and safety-relevant analytes in biopharma R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables group-specific interrogation of hydrophobic small molecule targets using DNA aptamers.
- Supports mechanistic de-risking by providing quantitative affinity and selectivity data for aptamer-target interactions.
- Facilitates functional validation of aptamer binding to structurally related PAEs, informing target confidence.
Screening & Assay Development
- Prepares validated aptamer-based systems for downstream biosensor workflows.
- Standardizes competitive binding assays for reproducible affinity and selectivity measurements.
- Enables scalable screening of aptamer candidates for group-specific detection.
- Provides quantitative outputs for reliable compound evaluation in biosensor platforms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns aptamer selection with translational biosensor development for environmental and safety monitoring.
- Supports continuity from molecular recognition discovery to preclinical biosensor validation.
- Reduces risk in advancing aptamer-based detection systems for regulatory or field deployment.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates from early aptamer discovery through biosensor assay development, enabling a continuum from target validation to preclinical biosensor readiness.
- Discovery Biology: Provides a platform for hypothesis testing and pathway clarification in small molecule recognition.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative affinity and selectivity data for aptamer candidates.
- Analytics: Employs qPCR and competitive assays to generate comparative binding metrics across PAEs.
- Translational Research: Bridges aptamer discovery with biosensor application for environmental and safety endpoints.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for aptamer selection against other hydrophobic small molecules.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in small molecule detection.
- Operational Value: Standardizes aptamer selection and biosensor fabrication for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency in biosensor pipeline development.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of aptamer-based detection platforms.
Implementation Considerations
- Requires expertise in aptamer selection, qPCR analytics, and biosensor fabrication.
- Needs access to magnetic separation, high-throughput sequencing, and electrochemical instrumentation.
- Demands cross-team standardization of binding and competitive assay protocols.
- May require adaptation for other hydrophobic targets with limited solubility or functionalization options.
- Practical limitations include the challenge of immobilizing highly hydrophobic targets for selection.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:50
Small-scale λ Exonuclease Reaction
2:40
Relative Affinity and Specificity Test by Competitive Assays
4:17
Fabrication and Electrochemical Measurements of Diethylhexyl Phthalate (DEHP) Electrochemical Biosensors
7:52
Results: Optimization of λ Exonuclease Reaction and Electrochemical Aptasensor Evaluation
8:46
Conclusion
