Name: Ftaalzuur Ester-Binding DNA Aptamer selectie, karakterisering en toepassing aan een elektrochemische Aptasensor (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Ontdek de selectie en karakterisering van DNA-aptameren voor hydrofobe kleine moleculen met elektrochemische aptasensoren. Deze methode maakt gevoelige detectie van ftalaten mogelijk voor analytische chemie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We zijn dankbaar voor de financiële steun van de nationale natuurlijke Science Foundation (21675112), Key project van de wetenschap en technologie plan van Peking onderwijs Commissie (KZ201710028027) en Yanjing jonge geleerde programma van kapitaal Normal University.

<ol><li>Vorkamp, K., Riget, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+new+and+current-use+contaminants+in+the+Arctic+environment%3A+Evidence+of+long-range+transport+and+indications+of+bioaccumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">A review of new and current-use contaminants in the Arctic environment: Evidence of long-range transport and indications of bioaccumulation.</a> Chemosphere. 111, 379-395 (2014).</li>
<li>Net, S., Sempere, R., Delmont, A., Paluselli, A., Ouddane, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occurrence%2C+fate%2C+behavior+and+ecotoxicological+state+of+phthalates+in+different+environmental+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Sci+Technol%22%5BJournal%5D)">Occurrence, fate, behavior and ecotoxicological state of phthalates in different environmental matrices.</a> Environ Sci Technol. 49 (7), 4019-4035 (2015).</li>
<li>Xie, Q. L., Liu, S. H., Fan, Y. Y., Sun, J. Z., Zhang, X. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+phthalate+esters+in+edible+oils+by+use+of+QuEChERS+coupled+with+ionic-liquid-based+dispersive+liquid-liquid+microextraction+before+high-performance+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+BioanalChem%22%5BJournal%5D)">Determination of phthalate esters in edible oils by use of QuEChERS coupled with ionic-liquid-based dispersive liquid-liquid microextraction before high-performance liquid chromatography.</a> Anal BioanalChem. 406 (18), 4563-4569 (2014).</li>
<li>Ierapetritis, I., Lioupis, A., Lampi, E. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s12161-013-9770-x">Determination of phthalates into vegetable oils by isotopic dilution gas chromatography mass spectrometry.</a> Food Anal Methods. 7 (7), 1451-1457 (2014).</li>
<li>Sun, J. Z., He, H., Liu, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+phthalic+acid+esters+in+Chinese+white+spirit+using+dispersive+liquid-liquid+microextraction+coupled+with+sweeping+beta-cyclodextrin-modified+micellar+electrokinetic+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Sep+Sci%22%5BJournal%5D)">Determination of phthalic acid esters in Chinese white spirit using dispersive liquid-liquid microextraction coupled with sweeping beta-cyclodextrin-modified micellar electrokinetic chromatography.</a> J Sep Sci. 37 (13), 1679-1686 (2014).</li>
<li>Yilmaz, P. K., Ertas, A., Kolak, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+determination+of+seven+phthalic+acid+esters+in+beverages+using+ultrasound+and+vortex-assisted+dispersive+liquid-liquid+microextraction+followed+by+high-performance+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Sep+Sci%22%5BJournal%5D)">Simultaneous determination of seven phthalic acid esters in beverages using ultrasound and vortex-assisted dispersive liquid-liquid microextraction followed by high-performance liquid chromatography.</a> J Sep Sci. 37 (16), 2111-2117 (2014).</li>
<li>Sun, R., Zhuang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ultrasensitive+gold+nanoparticles+improved+real-time+immuno-PCR+assay+for+detecting+diethyl+phthalate+in+foodstuff+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">An ultrasensitive gold nanoparticles improved real-time immuno-PCR assay for detecting diethyl phthalate in foodstuff samples.</a> Anal Biochem. 480, 49-57 (2015).</li>
<li>Sun, R. Y., Zhuang, H. S. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2014/ay/c4ay02088j">A sensitive heterogeneous biotin-streptavidin enzyme-linked immunosorbent assay for the determination of di-(2-ethylhexyl)phthalate (DEHP) in beverages using a specific polyclonal antibody.</a> Anal Methods. 6 (24), 9807-9815 (2014).</li>
<li>Zhou, L., Lei, Y., Zhang, D., Ahmed, S., Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ultra-sensitive+monoclonal+antibody-based+enzyme-linked+immunosobent+assay+for+dibutyl+phthalate+in+human+urinary%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Total+Environ%22%5BJournal%5D)">An ultra-sensitive monoclonal antibody-based enzyme-linked immunosobent assay for dibutyl phthalate in human urinary.</a> Sci Total Environ. 541, 570-578 (2016).</li>
<li>Shen, J., Li, Y., Gu, H., Xia, F., Zuo, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+development+of+sandwich+assay+based+on+the+nanobiotechnologies+for+proteins%2C+nucleic+Acids%2C+small+Molecules%2C+and+ions%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Recent development of sandwich assay based on the nanobiotechnologies for proteins, nucleic Acids, small Molecules, and ions.</a> Chem Rev. 114 (15), 7631-7677 (2014).</li>
<li>Yin, X. -B. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0165993612000040">Functional nucleic acids for electrochemical and electrochemiluminescent sensing applications.</a> TrAC, Trends Anal Chem. 33, 81-94 (2012).</li>
<li>Nguyen, V. -T., Kwon, Y. S., Gu, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamer-based+environmental+biosensors+for+small+molecule+contaminants%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Aptamer-based environmental biosensors for small molecule contaminants.</a> Curr Opin Biotechnol. 45, 15-23 (2017).</li>
<li>Groher, F., Suess, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+of+antibiotic-binding+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">In vitro selection of antibiotic-binding aptamers.</a> Methods. 106, 42-50 (2016).</li>
<li>Yang, K. -A., Pei, R., Stojanovic, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+and+amplification+protocols+for+isolation+of+aptameric+sensors+for+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">In vitro selection and amplification protocols for isolation of aptameric sensors for small molecules.</a> Methods. 106, 58-65 (2016).</li>
<li>Jing, M., Bowser, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+measuring+aptamer-protein+equilibria%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Methods for measuring aptamer-protein equilibria: a review.</a> Anal. Chim. Acta. 686 (1-2), 9-18 (2011).</li>
<li>Mehta, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+and+characterization+of+PCB-binding+DNA+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Selection and characterization of PCB-binding DNA aptamers.</a> Anal Chem. 84 (3), 1669-1676 (2012).</li>
<li>Matsumoto, M., Hirata-Koizumi, M., Ema, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+adverse+effects+of+phthalic+acid+esters+on+human+health%3A+A+review+of+recent+studies+on+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22Regul+Toxicol+Pharm%22%5BJournal%5D)">Potential adverse effects of phthalic acid esters on human health: A review of recent studies on reproduction.</a> Regul Toxicol Pharm. 50 (1), 37-49 (2008).</li>
<li>Goodchild, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conjugates+of+oligonucleotides+and+modified+oligonucleotides%3A+a+review+of+their+synthesis+and+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug+Chem%22%5BJournal%5D)">Conjugates of oligonucleotides and modified oligonucleotides: a review of their synthesis and properties.</a> Bioconjug Chem. 1 (3), 165-187 (1990).</li>
<li>Brown, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brief+history+of+oligonucleotide+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Protocols+for+Oligonucleotides+and+Analogs%3A+Synthesis+and+Properties%22%5BJournal%5D)">A brief history of oligonucleotide synthesis.</a> Protocols for Oligonucleotides and Analogs: Synthesis and Properties. , 1-17 (1993).</li>
<li>Reese, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligo-and+poly-nucleotides%3A+50+years+of+chemical+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Org+Biomol+Chem%22%5BJournal%5D)">Oligo-and poly-nucleotides: 50 years of chemical synthesis.</a> Org Biomol Chem. 3 (21), 3851-3868 (2005).</li>
<li>Sproat, B., Colonna, F., Mullah, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/15257779508014668">An efficient method for the isolation and purification of oligoribonucleotides.</a> Nucleos Nucleot Nucl. 14 (1-2), 255-273 (1995).</li>
<li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+group-specific+phthalic+acid+esters+binding+DNA+aptamers+via+rationally+designed+target+immobilization+and+applications+for+ultrasensitive+and+highly+selective+detection+of+phthalic+acid+esters%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Selection of group-specific phthalic acid esters binding DNA aptamers via rationally designed target immobilization and applications for ultrasensitive and highly selective detection of phthalic acid esters.</a> Anal Chem. 89 (10), 5270-5277 (2017).</li>
<li>Bartlett, J. M. S., Stirling, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+short+history+of+the+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22PCR+protocols%22%5BJournal%5D)">A short history of the polymerase chain reaction.</a> PCR protocols. , 3-6 (2003).</li>
<li>Saiki, R. K., Scharf, S., Faloona, F., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2999980">Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia.</a> Science. 230, 1350-1354 (1985).</li>
<li>Albright, L. M., Slatko, B. E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18428223">Denaturing polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. , A. 3B 1-A. 3B 5 (2001).</li>
<li>Summer, H., Grämer, R., Dröge, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Denaturing+urea+polyacrylamide+gel+electrophoresis+%28Urea+PAGE%29%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (Urea PAGE).</a> JoVE. (32), e1485(2009).</li>
<li>Jing, M., Bowser, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+measuring+aptamer-protein+equilibria%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Methods for measuring aptamer-protein equilibria: a review.</a> Anal Chim Acta. 686 (1), 9-18 (2011).</li>
<li>Sharma, T. K., Bruno, J. G., Dhiman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ABCs+of+DNA+aptamer+and+related+assay+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Adv%22%5BJournal%5D)">ABCs of DNA aptamer and related assay development.</a> Biotechnol Adv. 35 (2), 275-301 (2017).</li>
<li>Liu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S001346861530551X">Signaling-probe displacement electrochemical aptamer-based sensor (SD-EAB) for detection of nanomolar kanamycin A.</a> Electrochim Acta. 182, 516-523 (2015).</li>
<li>Mendonsa, S. D., Bowser, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+evolution+of+functional+DNA+using+capillary+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">In vitro evolution of functional DNA using capillary electrophoresis.</a> J Am Chem Soc. 126, 20-21 (2004).</li>
<li>Lou, X. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromagnetic+selection+of+aptamers+in+microfluidic+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Micromagnetic selection of aptamers in microfluidic channels.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106 (9), 2989-2994 (2009).</li>
<li>Cho, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+selection+of+DNA+aptamers+through+microfluidic+selection+and+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Quantitative selection of DNA aptamers through microfluidic selection and high-throughput sequencing.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 15373-15378 (2010).</li>
<li>Cho, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+selection+and+parallel+characterization+of+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Quantitative selection and parallel characterization of aptamers.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 110 (46), 18460-18465 (2013).</li>
<li>Song, K. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold+nanoparticle-based+colorimetric+detection+of+kanamycin+using+a+DNA+aptamer%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Gold nanoparticle-based colorimetric detection of kanamycin using a DNA aptamer.</a> Anal Biochem. 415 (2), 175-181 (2011).</li>
<li>Yang, Z., Ding, X., Guo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0925400517313278">Second generation of signaling-probe displacement electrochemical aptasensor for detection of picomolar ampicillin and sulfadimethoxine.</a> Sens Actuators B. 253 (2017), 1129-1136 (2017).</li>
<li>Lou, X., Zhao, T., Liu, R., Ma, J., Xiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembled+DNA+monolayer+buffered+dynamic+ranges+of+mercuric+electrochemical+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Self-assembled DNA monolayer buffered dynamic ranges of mercuric electrochemical sensor.</a> Anal Chem. 85 (15), 7574-7580 (2013).</li>
<li>Zhao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoprobe-enhanced%2C+split+aptamer-based+electrochemical+sandwich+assay+for+ultrasensitive+detection+of+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Nanoprobe-enhanced, split aptamer-based electrochemical sandwich assay for ultrasensitive detection of small molecules.</a> Anal Chem. 87 (15), 7712-7719 (2015).</li>
<li>Lou, X., He, L. A. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0925400507006181">Surface passivation using oligo(ethylene glycol) in ATRP-assisted DNA detection.</a> Sens Actuators,B. 129 (1), 225-230 (2008).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen concurrerende financieel belang.

Een uitstekende voordeel van aptamers is dat ze worden geïdentificeerd door middel van de methode in vitro SELEX, hoewel antilichamen worden gegenereerd via in vivo immunoreactions. Daarom, aptamers kunnen worden geselecteerd met de gewenste doelgroep specificiteit uit hoofde van goed ontworpen proefomstandigheden, overwegende dat antilichamen beperkt tot de fysiologische omstandigheden zijn.
Ter vergemakkelijking van de scheiding van afhankelijke sequenties van gratis sequen...

Samen met de snelle economische ontwikkeling is versnelling van de industrialisatie en de bouw van het stedelijk, milieuvervuiling ernstiger dan ooit. Typische milieuverontreinigende stoffen zijn zware metaal ionen, toxinen, antibiotica, bestrijdingsmiddelen, hormoonontregelaars en persistente organische verontreinigende stoffen (POP's). Naast metaalionen en toxines, andere verontreinigende stoffen zijn kleine moleculen dat heel vaak bestaan uit een verscheidenheid van congeneren. De meest giftige POP's bijvoorbeeld polychloorbifenylen (PCB's), polycyclische aromatische koolwaterstoffen (PAK's), bifenyl polybroomdifenylethers (PBDE's), polychloordibenzo-p-dioxines (PCDD's), polychloorbifenylen polychloordibenzofuraancongeneren (PCDF's), en ftaal esters van (PAEs)1,2, die alle bestaan uit vele congeneren. Klein molecuul detectie is voornamelijk uitgevoerd door chromatografie/massa spectrometrie gebaseerde technieken als gevolg van hun verscheidenheid van toepassingen3,,4,,5,6. Voor on-site detecties, hebben antilichamen gebaseerde methoden onlangs ontwikkelde7,8,9. Echter, aangezien deze methoden zeer specifiek voor een bepaalde congeneer zijn, meerdere proeven moeten worden uitgevoerd. Wat ernstiger is, is dat de roman congeneren zo snel groeien dat hun antilichamen kunnen niet worden gegenereerd in de tijd. Dus, de ontwikkeling van groepsspecifieke biosensoren te controleren van het totale gehalte aan alle congeneren in één test kan voorzien in een onschatbare waarde metric milieuvervuiling status beoordelen.
Onlangs, nucleic zuur aptamers wijd zijn toegepast als erkenning elementen in verschillende biosensing platformen als gevolg van hun vermogen van de erkenning van een grote verscheidenheid van doelen, van ionen en kleine moleculen aan eiwitten en cellen10,11 ,12. Aptamers worden geïdentificeerd door middel van een in vitro -methode aangeroepen systematische evolutie van liganden door exponentiële verrijking (SELEX)13,14. SELEX begint met de willekeurige synthetische enkele streng oligonucleotide bibliotheek, die ongeveer 1014-1015 fragmenten bevat. De grootte van de willekeurige bibliotheek zorgt ervoor dat de diversiteit van de RNA of DNA kandidaat-structuren. Het typische SELEX proces bestaat uit meerdere rondes van verrijking totdat de bibliotheek is verrijkt met sequenties met hoge affiniteit en specificiteit naar het doel. Het laatste verrijkt zwembad is dan sequenced en de dissociatieconstanten (Kd) en selectiviteit tegen potentieel storende stoffen worden bepaald door verschillende technieken zoals filteren bindend, chromatografie van de affiniteit, oppervlakte Plasmon resonantie (SPR), enz. 15
Vanwege de extreem slechte water oplosbaarheid en gebrek aan functionele groepen voor oppervlakte immobilisatie is de selectie van de aptamer van POP's theoretisch moeilijk. Significante vooruitgang voor SELEX hebben versneld van de ontdekking van aptamers. Echter, de selectie van groepsspecifieke aptamers voor POP's heeft nog niet is gerapporteerd. Tot nu toe geweest alleen PCB-bindende DNA aptamers met hoge specificiteit voor een bepaalde congeneer geïdentificeerde16. PAEs worden hoofdzakelijk gebruikt in polyvinylchloride materialen, polyvinylchloride van een hard plastic omzetten in een elastische kunststof, dus die fungeert als een weekmaker. Sommige PAEs zijn geïdentificeerd als endocriene verstoorders, kan ernstige schade veroorzaken aan de lever en nierfunctie, beperken de beweeglijkheid van de mannelijke zaadcellen, en kan resulteren in abnormale sperma morfologie en testiculaire kanker17. De compound- noch groepsspecifieke PAE-bindende aptamers zijn gemeld.
Het doel van dit werk is bedoeld als een representatieve protocol voor het selecteren van groepsspecifieke DNA aptamers met zeer hydrofobe kleine molecules zoals PAEs, een representatieve groep van POP's. We tonen ook de toepassing van de geselecteerde aptamer voor milieuvervuiling opsporen. Dit protocol biedt begeleiding en inzichten voor de ontdekking van de aptamer van andere hydrofobe kleine moleculen.

<table><tbody><tr><td>UV-2550</td><td>Shimadzu,Japan</td><td></td><td>protocol, sectie 3.8.2</td></tr><tr><td>DNA Engnine Thermal cycler,PTC0200</td><td>BIO-RAD</td><td></td><td>sectie 3.5.1.2 en 3.5.2</td></tr><tr><td>C1000 Touch</td><td>BIO-RAD</td><td></td><td>sectie 5.3.6 en 6.3</td></tr><tr><td>VMP3 multichannel potentiostat</td><td>Bio-Logic Science, Claix, Frankrijk</td><td></td><td>sectie 7.4, 7.8 en 7.11</td></tr><tr><td>Epoxy-activated Sepharose 6B</td><td>GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA)</td><td>10220020</td><td>agarose kralen, sectie 2.3 en 3.3</td></tr><tr><td>Dynabeads M-270 carboxylic acid magnetische kralen</td><td>Invitrogen, VS</td><td>420420</td><td>magnetische kralen, sectie 5.2 en 5.3</td></tr><tr><td>Premix Taq Hot Start Version</td><td>Takara,Dalian,China</td><td>R028A</td><td>polymerase, sectie 3.5.1.1</td></tr><tr><td>PARAFILM Sealing Membrane</td><td>Bemis, VS</td><td>PM-996</td><td>sectie 3.6.5</td></tr><tr><td>Lambda Exonuclease</td><td>Invitrogen, VS</td><td>EN0561</td><td>sectie 3.7.1.2. De 10 &times; reactiebuffer wordt samen met &lambda; exonuclease geleverd door de leverancier.</td></tr><tr><td>Dr. GenTLE Precipitatie Carrier</td><td>Takara,Dalian,China</td><td>9094</td><td>sectie 3.6.2 en 3.8.1</td></tr><tr><td>UNIQ-10 PAGE DNA recovery kit</td><td>Sangon Biotech (Shanghai)</td><td>B511135</td><td>sectie 4.2</td></tr><tr><td>SYBR Gold nucleic acid gel stain</td><td>Invitrogen, VS</td><td>1811838</td><td>nucleïnezuurkleuring, sectie 3.5.1.5</td></tr><tr><td>SYBR Premix Ex Taq II</td><td>Takara,Dalian,China</td><td>RR820A</td><td>polymerase mix met polymerase en dNTP's, sectie 5.3.5</td></tr><tr><td>2-(N-Morpholino)ethansulfonzuur (MES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CAS: 1132-61-2</td><td>sectie 5.2.1</td></tr><tr><td>1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimidehydrochloride (EDC)</td><td>Invitrogen, VS</td><td>CAS: 25952-53-8</td><td>sectie 5.2.2</td></tr><tr><td>N-hydroxysuccinimide (NHS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6066-82-6</td><td>sectie 5.2.3</td></tr><tr><td>mercaptohexanol (MCH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CAS: 1633-78-9</td><td>sectie 7.7</td></tr><tr><td>Goudelektrode</td><td>Shanghai Chenhua</td><td>CHI101</td><td>sectie 7.4 - 7.11</td></tr><tr><td>tris(2-carboxyethyl)fosfinehydrochloride (TCEP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CAS: 51805-45-9</td><td>sectie 7.5</td></tr><tr><td>O-(2-Mercaptoethyl)-O'-methyl-hexa-(ethyleenglycol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CAS: 651042-82-9</td><td>sectie 7.7</td></tr><tr><td>diethylhexylftalaat (DEHP)</td><td>Nationaal Instituut voor Metrologie, China</td><td>CAS: 117-81-7</td><td>sectie 7.11</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CAS: 9005-64-5</td><td>polyoxyethyleen(20) sorbitaanmonolauraat</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CAS: 9002-93-1</td><td>niet-ionogene oppervlakteactieve stof</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5368</td><td>10 mM fosfaatbuffer met 1 M NaCl, pH 7.4</td></tr></tbody></table>

ftaalzuur ester-binding dna aptamer selectie, karakterisering en toepassing aan een elektrochemische aptasensor

Phthalic Acid Ester-Binding DNA Aptamer Selection, Characterization, and Application to an Electrochemical Aptasensor

Ftaalzuur esters (PAEs) areone van de grote groepen van persistente organische verontreinigende stoffen. De groepsspecifieke detectie van PAEs is zeer gewenst als gevolg van de snel groeiende van congeneren. DNA aptamers zijn steeds meer toegepast als erkenning elementen op biosensor platformen, maar selecteren aptamers richting zeer hydrofobe klein molecuul doelen, zoals PAEs, is zelden gerapporteerd. Dit werk beschrijft een kraal gebaseerde methode ontworpen om te selecteren groepsspecifieke DNA aptamers aan PAEs. De aminogroep matiemaatschappij dibutylftalaat (DBP-NH2) zoals het anker doel werd gesynthetiseerd en geïmmobiliseerd op de epoxy-geactiveerde agarose parels, waardoor de weergave van de ftaal ester-groep aan het oppervlak van de immobilisatie-matrix, en Daarom is de selectie van de groepsspecifieke bindmiddelen. Wij vastbesloten de dissociatieconstanten van de aptamer kandidaten door kwantitatieve polymerisatie kettingreactie van magnetische scheiding wordt gekoppeld. De relatieve affiniteiten en de selectiviteit van de aptamers aan andere PAEs werden bepaald door de concurrerende testen, waar de aptamer kandidaten waren vooraf begrensd aan de DBP-NH2 aangesloten magnetische kralen en vrijgegeven aan het supernatans dat na incubatie met de geteste PAEs of andere potentieel storende stoffen. De concurrerende assay werd toegepast omdat het verstrekt een vergelijking van de facile affiniteit tussen PAEs die had geen functionele groepen voor oppervlakte immobilisatie. Tot slot, wij aangetoond van de fabricage van een elektrochemische aptasensor en gebruikt voor ultrasensitive en selectieve detectie van bis(2-ethylhexyl) ftalaat. Dit protocol biedt inzichten voor de ontdekking van de aptamer van andere hydrofobe kleine moleculen.

We ontworpen en gesynthetiseerd de aminogroep matiemaatschappij dibutylftalaat (DBP-NH2) als het anker doel (figuur 1F). We uitgevoerd dan de DNA aptamer selectie van PAEs DBP-NH2 gebruikt als anker doel en na de klassieke doel immobilisatie gebaseerde methode (Figuur 2). In elke ronde, werd een pilot PCR uitgevoerd met behulp van de gedenatureerde pagina voor het optimaliseren van het nummer van de cyclus v...

Een protocol voor de in vitro selectie en karakterisering van groepsspecifieke ftaalzuur ester-binding DNA aptamers wordt gepresenteerd. De toepassing van de geselecteerde aptamer in een elektrochemische aptasensor is ook inbegrepen.

Ftaalzuur Ester-Binding DNA Aptamer selectie, karakterisering en toepassing aan een elektrochemische Aptasensor

Phthalic acid esters (PAEs) areone of the major groups of persistent organic pollutants. The group-specific detection of PAEs is highly desired due to the ...

Het algemene doel van deze procedure is om groepsspecifieke DNA-aptameren te selecteren voor zeer hydrofobe, kleine moleculen en om de geselecteerde aptamer te gebruiken voor het ontwikkelen van een gevoelige elektrochemische biosensor. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het aptamer-selectieveld te beantwoorden, over hoe groepsspecifieke aptameren te selecteren en te karakteriseren wanneer doelen zeer hydrofobe moleculen zijn. Hoewel het meest nuttige deel van deze methode de ontwikkeling van elektrochemische biosensoren is, voor de detectie van titels.Deze biosensoren zouden ook moeten werken voor onze aptamer affiniteitsmetingen. Om de reactie te starten, voeg 100 microliter RNase-vrij water toe aan het gezuiverde aptamer PCR-product. Vortex de mengsel totdat het precipitaat is opgelost.Lambda exonuclease reactie is gevoelig voor de zoutconcentratie en is een product dat zou moeten worden vermenigvuldigd door ethanolprecipitatie maar een andere isopropanol. Plaats in elk van de vijf microcentrifugebuizen vijf microliter van de aptameroplossing, 11 microliter Rnase-vrij water en twee microliter 10x reactiebuffer. Voeg twee microliter Rnase-vrij water en oplossingen van twee, vijf, acht en 10 eenheden van lambda exonuclease in Rnase-vrij water toe aan elke buis.Meng goed met voorzichtig pipetteren. Incubeer de buizen gedurende 35 minuten bij 37 graden Celsius en gedurende 15 minuten bij 80 graden Celsius. Houd de buizen vervolgens op vier graden Celsius en bereid een 12% native paginagel voor.Voeg aan elke buis een microliter ladingsverf en vier microliter Rnase-vrij water toe. Laat de mengsels in de native paginagel gedurende 45 minuten draaien op 150 volt. Identificeer de laagste hoeveelheid lambda exonuclease die nodig is om volledig enkelstrengs DNA te genereren.Voer een grootschalige reactie uit om enkelstrengs DNA te genereren. Voor elk te testen bindingsdoel, incubeer 10 microliters gemiddeld functionele DBP-gecodeerde magnetische kralen met 500 microliters van een micromolaire oplossing van DBP-1 gedurende een uur bij kamertemperatuur terwijl u draait. Gooi vervolgens het supernatant weg.Was de kralen vier keer met 200 microliter porties van PAE binding buffer en schud de kralen opnieuw op in 10 microliter PAE binding buffer. Verkrijg 10 micromolaire bindingsdoel testdispersies in PAE binding buffer. Het is geweldig om de dispersieversie van de hydrofobe doelen in PAE binding buffer te gaan.Om ervoor te zorgen dat er verrijking van de bibliotheek is, werden geselecteerd onder affiniteitstests. Voeg 10 microliter DBP-1 gecodeerde kralen toe aan 110 microliter van elke doeltestoplossing. Incubeer de mengsels gedurende een uur en verzamel de supernatanten door magnetische scheiding.Verdun de supernatanten 100 keer en gebruik drie microliter voor elke kwantitatieve PCR. Bereken de relatieve affiniteiten door het aantal DBP-1 vrijgelaten in de aanwezigheid van het testmonster te delen door het aantal DBP-1 vrijgelaten in alleen PAE binding buffer. Voorafgaand aan het uitvoeren van de metingen synthetiseer en zuiver de DBP-1-gebaseerde thiolated kernsequentieprobe en de signaalprobe.Reconstitueer de thiolated probe en de signaalprobe en als 100 micromolaire oplossingen in nucleasevrij water. Volgende polijst een twee millimeter diameter gouden elektrode tot een spiegelachtige oppervlakte met een, 0,3 en 0,5 micron alumina poeder en een microvezeldoek gedurende vijf minuten elk. Soniceer de elektrode gedurende vijf minuten in ultra zuiver water na elke polijst.Dompel de gepolijste elektrode in een 0,5 molaire oplossing van zwavelzuur. Reinig de elektrode met 35 opeenvolgende cyclische voltammetrie scans van min 0,4 tot plus 1,2 volt versus kwikcalomel bij 100 millivolt per seconde. Bereid vervolgens in een dunne wandcentrifugebuis een mengsel van 0,5 micromolaire thiolated probe DBP-1.En 0,5 micromolaire FC gemodificeerde DBP-1 in 100 microliters PBS. Verhit de mengsel in een waterbad ingesteld op 95 graden Celsius gedurende 10 minuten. Laat vervolgens het mengsel afkoelen tot kamertemperatuur in het waterbad.Voeg een microliter van een 10 millimolair TCEP stamoplossing toe aan het afgekoelde mengsel en houd het bij kamertemperatuur gedurende een uur. Dompel vervolgens de schone gouden elektrode in het mengsel gedurende 12 uur bij kamertemperatuur. Spoel de elektrode met PBS en dompel vervolgens de elektrode in een 1 millimolair oplossing van thiolated PEG in PBS gedurende een uur.Spuil de elektrode grondig met doelvrije PAE binding buffer en dompel de elektrode in de buffer. Soniceer vervolgens elektrolytische cellen van platina tegenelektrode en een verzadigd calomel referentie-elektrode gedurende twee minuten elk in ultra zuiver water en PAE binding buffer op volgorde. Open de vierkante golf van voltammetrie instrumentsoftware en voer de experiment parameters in.Vul een schone elektrolytische cel met doelvrije PAE binding buffer. Verbind de drie schone elektroden aan een potentiostaat en dompel de elektroden in de buffer. Verwerf een achtergrond SWV scan.Dompel vervolgens de gouden werkelektrode in een 10 picamolair DEHP oplossing in PAE binding buffer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Spuil de elektrode grondig met PAE binding buffer. Dompel alle drie de elektroden in verse PAE binding buffer en verzamel een andere SWV curve met behulp van dezelfde parameters als eerder.Herhaal dit proces met toenemende concentraties van DEHP om een titratiecurve te verkrijgen. De minimale hoeveelheid lambda exonuclease die nodig is om alleen enkelstrengs DNA te verkrijgen, werd gevonden om twee eenheden te zijn op basis van kleinschalige reacties. De aptamer kandidaat DBP-1 werd geïdentificeerd door SELEX gevolgd door high throughput sequencing.DBP-1 vertoonde goede groepsspecificiteit voor PAE congeneren. Een elektrochemische aptasensor met behulp van DBP-1 reageerde selectief op DEHP boven andere gebruikelijke milieuverontreinigingen. De aptasensor was zeer gevoelig voor DEHP met de respons bij concentraties zo laag als 10 picamolair.Laserdeeltje waar selectie en karakteriser

phthalic-acid-ester-binding-dna-aptamer-selection-characterization

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

SELEX protocollen bestaan ​​uit meerdere ronden van selectie, die elk vereisen regeneratie van gebonden liganden, die op hun beurt behoefte aan vaste primer sequenties aan weerszijden van de willekeurige bibliotheek regio's. Deze vaste primer sequenties kunnen interfereren met de selectieprocedure (vals positieven en negatieven). Hier presenteren wij een primer-vrij protocol.

Primer-Free aptameer Selection behulp van een random DNA-bibliotheek

"E-DNA" sensoren, reagentless hebben elektrochemische biosensoren die goed presteren, zelfs wanneer direct uitgedaagd in het bloed en andere complexe matrices, aangepast aan de detectie van een breed scala van nucleïnezuur, eiwitten en kleine moleculen analyten. Hier presenteren we een algemene procedure voor de fabricage en het gebruik van dergelijke sensoren.

Fabricatie van elektrochemische-DNA Biosensoren voor de Reagentless detectie van nucleïnezuren, eiwitten en kleine moleculen

We hebben onlangs melding gemaakt van een nieuwe benadering voor het genereren van fluorogene DNAzyme probes die kan worden toegepast op het opzetten van een eenvoudige, "mix-and-lezen" TL-test voor bacteriële detectie. Deze speciale DNA probes katalyseren de splitsing van een chromofoor gemodificeerde DNA-RNA chimère substraat in aanwezigheid van ruwe extracellulaire mengsel (CEM) door een bepaald bacterie, waardoor vertaling bacteriële detectie in fluorescentiesignaal generatie. In dit...

Detectie van bacteriën met behulp van fluorogene DNAzymes

Er wordt een protocol geboden om structure-switching aptameren voor kleine molecuuldoelen te selecteren op basis van een instelbare strengheid magneetparel selectiemethode. Aptameren geselecteerd met structure-switching eigenschappen zijn gunstig voor assays die een conformationele verandering vereisen om de aanwezigheid van een doel aan te geven, zoals de beschreven gouden nanodeeltjes assay.

Een methode voor het selecteren-Structure schakelen Aptameren Toegepast op een Colorimetric gouden nanodeeltjes Assay

MicroScale Thermoforese (MST) is een gevoelige technologie voor het karakteriseren van aptameer-doelinteracties. Dit manuscript beschrijft een MST-protocol voor het karakteriseren van aptameer-kleine molecuulinteracties.

In kaart brengen van de bindingsplaats van een aptameer op ATP gebruik van microschaal Thermophoresis

Een protocol voor de ontwikkeling van een elektrochemische DNA biosensor bestaat uit een polylactic acid-gestabiliseerde, gouden nanodeeltjes gemodificeerde, gezeefdrukt koolstof elektrode voor het detecteren van Vibrio parahaemolyticus wordt gepresenteerd.

Ontwikkeling van een elektrochemische DNA Biosensor te detecteren een Foodborne Pathogen

Veranderde Nuclease activiteit is in verband gebracht met verschillende menselijke omstandigheden, die onderliggende zijn potentieel als een biomarker. De modulaire en eenvoudig te implementeren screenings methodiek die in dit document wordt gepresenteerd, maakt het mogelijk specifieke nucleïnezuur voelers te selecteren voor het benutten van Nuclease activiteit als een biomarker van de ziekte.

Kinetische screening van Nuclease activiteit met behulp van nucleïnezuur sondes

Het huidige protocol beschrijft het gebruik van isotherme titratiecalorimetrie (ITC) om de associatie en dissociatiekinetiek van de binding tussen een DNA-aptamer en tetracycline te analyseren, inclusief monstervoorbereiding, lopende normen en monsters, en het interpreteren van de resulterende gegevens.

Het bepalen van de thermodynamische en kinetische associatie van een DNA-aptamer en tetracycline met behulp van isothermische titratiecalorimetrie

Een noodzakelijke stap in de ontwikkeling van aptameren tegen kanker is om de binding aan het doelwit te testen. We demonstreren een flowcytometrische test om deze binding te bestuderen, waarbij we het belang benadrukken van het opnemen van een negatieve controle aptamer en kankercellen die positief of negatief zijn voor dat specifieke eiwit.

Een flowcytometrie-gebaseerde celoppervlakeiwitbindingstest voor het beoordelen van selectiviteit en specificiteit van een antikanker aptamer

Het huidige protocol demonstreert het gebruik van een snelle, 3-traps, aptamer-gebaseerde exponentiële versterkingstest om doelen te detecteren. Monstervoorbereiding, signaalversterking en kleurontwikkeling worden behandeld om dit systeem te implementeren om de aanwezigheid van theofylline te herkennen boven die van cafeïne.

Aptamer-gebaseerde doeldetectie mogelijk gemaakt door een 3-traps G-Quadruplex isothermische exponentiële versterkingsreactie

Dit protocol schetst het ontwerp van gesplitste hybridisatiesondes die gebruik maken van fluorescerende oplichtende aptameer DAP-10-42 als signaalreporter en hun toepassing voor nucleïnezuurdetectie en differentiatie tussen doelen met single-nucleotidesubstituties.

Gesplitste hybridisatiesonde die gebruik maakt van een DNA-fluorescerende oplichtende aptameer als signaalreporter voor sequentiespecifieke nucleïnezuuranalyse

Ontdek de selectie en karakterisering van DNA-aptameren voor hydrofobe kleine moleculen met elektrochemische aptasensoren. Deze methode maakt gevoelige detectie van ftalaten mogelijk voor analytische chemie.

Ftaalzuur Ester-Binding DNA Aptamer selectie, karakterisering en toepassing aan een elektrochemische Aptasensor

Meer video's verkennen