Name: DNA-magnetische deeltjes analyse door dynamische en elektroforetische lichtverstrooiing bindend (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Leer de synthese en karakterisering van magnetische deeltjes voor DNA-binding met dynamische en elektroforetische lichtverstrooiing. Deze methode optimaliseert deeltjesontwerp voor biotechnologische toepassingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De financiële steun van de Tsjechische Science Foundation (project GA CR 17-12816S) en CEITEC 2020 (LQ1601) wordt sterk erkend.

1. magnetische nanodeeltjes synthese <ol><li>synthese van magnetische nanodeeltjes gestabiliseerd met citraat (MNPs) <ol><li>toevoegen 20 mmol van FeCl 3 &#8729; 6 H 2 O (5.406 g) en 10 mmol van FeCl 2 &#8729; 4 H 2 O (1.988 g) in 20 mL gedeoxygeneerd dubbel gedestilleerd water (ddd water). Roer verkregen oplossing krachtig in het bekerglas onder N 2 sfeer met behulp van een mechanische schudinrichting totdat een transparante oplossing wordt verkregen.</li>
		<li>Toevoegen onder snelle mechanische roeren, 150 mL 1 M NH 4 OH, druppel voor druppel met trechter (Neem 1 h of meer indien nodig). Breng de oplossing kwantitatief in een schroefbare schip nadat alle NH 4 OH is toegevoegd. Schroef de vaartuig en warmte oplossing bij 75 ° C gedurende 30 min. 
		Let op: NH 4 OH is ingedeeld als bijtend en voor milieu gevaarlijke. 
		Opmerking: Bereid NH 4 OH oplossing van hoge rang 28% NH 4 OH in water met behulp van gedeoxygeneerd water.</li>
		<li>Verzamelen de zwarte neerslag met magneet en wassen met 100 mL water ddd. Herhaal dit 3 keer. Voeg 50 mL 0,5 M tri-natrium citraat (dihydraat) p.a. neerslaan. Schroef de schip. 
		Opmerking: Gebruik gedeoxygeneerd oplossing van tri-natrium citraat dihydraat.</li>
		<li>Opnieuw verspreiden de neerslag via ultrasoonapparaat (35 kHz, amplitude van 100%) en warmte vaartuig bij 80 ° C gedurende 1 h. 
		Opmerking: Een ultrasoonapparaat van voldoende energie nodig is.</li>
		<li>Laat de oplossing afkoelen tot kamertemperatuur. Verzamelen van neerslag met behulp van een magneet en bovendrijvende vloeistof verwijderen. Opnieuw verspreiden zwarte modder in ddd water ultrasoonapparaat (35 kHz, amplitude van 100%) met 50 mL.</li>
		<li>Pipetteer aliquots (~ 25 mL) in 50 mL centrifuge buizen en Voeg 20 mL aceton. Centrifugeer bij 2400 x g gedurende 10 minuten en verwijder supernatant.</li>
		<li>Opnieuw verspreiden neerslag en dialyze oplossing tegen water laag molecuulgewicht cut-off dialyse apparaat (500-1000 Da) van geschikt volume gebruikt voor 24 h. 
		Opmerking: Bereiden de dialyse apparaat volgens fabrikant &#39; s eisen.</li>
	</ol></li> <li>Synthese van magnetische nanodeeltjes bewerkt met vertakte polyethylenimine (MNPs_PEI) <ol><li>, voeg 2 mL van de verkregen MNPs-oplossing (~0.1 g/mL) in een bekerglas van glas. Voeg 38 mL ddd water toe en bewerk ultrasone trillingen ten (35 kHz, amplitude van 100%) de schorsing (10 min).</li>
		<li>Onder snelle mechanische roeren, voeg toe 10 mL 10% vertakt polyethylenimine (gemiddelde 25 kDa). Roer de oplossing voor latere 3 h.</li>
		<li>Collect precipiteren met behulp van magneet en bovendrijvende vloeistof verwijderen. Opnieuw verspreiden neerslag in 20 mL ddd water. Herhaal dit 5 keer dan bewerk ultrasone trillingen ten de definitieve opschorting (35 kHz, amplitude van 100%).</li>
	</ol></li> <li>Synthese van magnetische nanodeeltjes deeltjes bewerkt met siliciumdioxide (MNPs_TEOS) <ol><li>Voeg 10 mL van de verkregen MNPs-oplossing (~0.1 g/mL) in een bekerglas van glas. Voeg 60 mL water en 130 mL ethanol. Bewerk ultrasone trillingen ten oplossing en voeg 28% NH 4 OH 6 mL.</li>
		<li>Onder snelle mechanische roeren, voeg 1 mL tetraethyl orthosilicate. Roer de oplossing voor de daaropvolgende 12 h.</li>
		<li>Zwarte neerslag met magneet verzamelen en wassen met behulp van 50 mL ethanol (3 keer) en 50 mL water (3 keer). Opnieuw verspreiden deeltjes in 10 mL voor ddd water en bewerk ultrasone trillingen ten de schorsing (35 kHz, amplitude van 100%).</li>
	</ol></li> <li>Synthese van magnetische nanodeeltjes bewerkt met amino groepen (MNPs_APTES) <ol><li>Voeg 5 mL van de verkregen oplossing van de MNPs_TEOS (~0.1 g/mL) in een bekerglas van glas. 45 mL water en 50 mL ethanol toevoegen. Bewerk ultrasone trillingen ten oplossing (35 kHz, amplitude van 100%).</li>
		<li>Onder snelle mechanische roeren, Voeg 0,5 mL (3-aminopropyl) triethoxysilane. Roer de oplossing voor latere 3 h.</li>
		<li>Zwarte neerslag met magneet verzamelen en wassen met behulp van 50 mL ethanol (3 keer) en 50 mL water (3 keer). Opnieuw verspreiden deeltjes in ddd 5 mL water en bewerk ultrasone trillingen ten de schorsing (35 kHz, amplitude van 100%).</li>
	</ol></li></ol> 2. Magnetische deeltjes synthese <ol><li>synthese van magnetische deeltjes gestabiliseerd met citraat (MMP) <ol><li>Voeg toe 25 mL 2 M KNO 3, 12,5 mL 1 M KOH en 205.875 mL van ddd water in een schroefbare vaartuig. Voeg 6.675 mL 1 M FeSO 4 tijdens het magnetische schudden. Onmiddellijk overdracht schip een voorverwarmde waterbad (90 ° C) voor 2 h. 
		Opmerking: Bereiden KNO 3 en KOH oplossingen in ddd water.</li>
		<li>Laat de oplossing afkoelen tot kamertemperatuur. Verzamelen van zwarte neerslag met magneet en wassen met behulp van 50 mL ddd water (5 keer). Voeg 50 mL 0,5 M tri-natrium citraat (dihydraat) p.a. neerslaan. Schroef de schip.</li>
		<li>Redisperse van de neerslag via ultrasoonapparaat (35 kHz, amplitude van 100%) en warmte vaartuig bij 80 ° C gedurende 1 h. verzamelen zwarte neerslag met magneet en wassen met behulp van 50 mL ddd water (10 keer).</li>
		<li>Wijzigen MMP met vertakte polyethylenimine (MMPs_PEI), siliciumdioxide (MMPs_TEOS) en de amino groepen (MMPs_APTES) vergelijkbaar met MNPs-protocol. Verwijzen naar secties 2.2, 2.3 en 2.4, respectievelijk voor meer details.</li>
	</ol></li> <li>Synthese van magnetische deeltjes bewerkt met vertakte polyethylenimine (MMPs_PEI) <ol><li>Voeg 5 mL van MMP oplossing (~0.1 g/mL) in een bekerglas van glas. Voeg 38 mL ddd water toe en bewerk ultrasone trillingen ten de oplossing (35 kHz, amplitude van 100%, 10 min). Voeg toe 10 mL 10% vertakt polyethylenimine (gemiddelde 25 kDa) onder snelle mechanische roeren. Roer de oplossing voor latere 3 h.</li>
		<li>Verzamelen neerslag met behulp van een magneet en bovendrijvende vloeistof verwijderen. Redisperse neerslag in 20 mL dubbel gedestilleerd water. Herhaal dit 5 keer dan bewerk ultrasone trillingen ten de eindoplossing (35 kHz, amplitude van 100%).</li>
	</ol></li> <li>Synthese van magnetische deeltjes bewerkt met siliciumdioxide (MMPs_TEOS) <ol><li>Voeg 5 mL van MMP oplossing (~0.1 g/mL) in een bekerglas van glas. Voeg 60 mL water en 130 mL ethanol. Bewerk ultrasone trillingen ten schorsing (35 kHz, amplitude van 100%) en voeg 28% NH 4 OH 6 mL.</li>
		<li>Onder snelle mechanische roeren, voeg 1 mL tetraethyl orthosilicate. Roer de oplossing voor de daaropvolgende 12 h.</li>
		<li>Zwarte neerslag met behulp van een magneet verzamelen en wassen met behulp van 50 mL ethanol (3 keer) en 50 mL water (3 keer). Redisperse van deeltjes in 5 mL water voor ddd en bewerk ultrasone trillingen ten de schorsing (35 kHz, amplitude van 100%).</li>
	</ol></li> <li>Synthese van magnetische deeltjes bewerkt met amino groepen (MMPs_APTES) <ol><li>Voeg 3 mL MMPs_TEOS oplossing (~0.1 g/mL) in een bekerglas van glas. 45 mL water en 50 mL ethanol toevoegen. Bewerk ultrasone trillingen ten de schorsing (35 kHz, amplitude van 100%).</li>
		<li>Onder snelle mechanische roeren, Voeg 0,5 mL (3-Aminopropyl) triethoxysilane. Roer de oplossing voor latere 3 h.</li>
		<li>Zwarte neerslag met magneet verzamelen en wassen met behulp van 50 mL ethanol (3 keer) en 50 mL water (3 keer). Redisperse van deeltjes in 3 mL ddd water en bewerk ultrasone trillingen ten de schorsing (35 kHz, amplitude van 100%).</li>
	</ol></li></ol> 3. Magnetische deeltjes grootte analyse met behulp van DLS <ol><li>grootte van de deeltjes in water <ol><li>gebruik een DLS-instrument waarvoor een terug verstrooiing detector hoek (173 °) en een bundel golflengte van 633 nm. 
		Opmerking: Achterwaarts-verstrooiing DLS is geschikt voor geconcentreerde monsters waar meerdere verstrooiing kan worden vermeden. Kant verstrooiing (detector hoek 90°) en forward-verstrooiing (detector hoek 15°) DLS zijn geschikt voor kleinere deeltjes en deeltjes, respectievelijk gemengd.</li>
		<li>Voorafgaande aan meten in water, bewerk ultrasone trillingen ten deeltjes voor 3 min. 
		Opmerking: Gebruik verdunde oplossing van de deeltjes. Voor dit doel, meng u 9,6 µL van deeltjes met 96 ÂµL van water.</li>
		<li>Zorgvuldig Pipeteer 50 µL van deeltje oplossing in polystyreen latex cuvettes en de vorming van luchtbellen vermijden. 
		Opmerking: Voor elk monster, gebruikt wegwerp cuvette (zie tabel van materialen).</li>
		<li>Merk op de duidelijkheid van de meetcel en de richting van de lichtbundel. De cel ingevoegd in de monsterhouder en sluiten de kamer.</li>
		<li>De volgende parameters gebruiken voor het meten: temperatuur: 25 ° C; refractive index van dispersief fase (ijzer): 2.344; refractive index van dispersief milieu (water): 1,333 
		Opmerking: Uitvoeren van meting van het gebruik van een refractometer voor meer accurate resultaten, met name bij het ontwikkelen van nieuwe of hybride materialen brekingsindex.</li>
	</ol></li></ol> 4. Voorbereiding van DNA Stock, magnetische deeltjes en bindende Buffer <ol><li>DNA voorraad <ol><li>gebruik 10 mM Tris-HCL buffer (pH = 8) voor verdunning en opslag van DNA. Gebruik een standaardmonster van DNA die kan worden versterkt, specifiek met een directe PCR protocol in het laboratorium (verwijs naar punt 5.2 voor reactie instellingen en omstandigheden). Om te vullen 498 basenpaar (bp) van het gen xis van bacteriofaag lambda controle, gebruikt u de volgende inleidingen. Toekomen primer: 5 &#39; - CCTGCTCTGCCGCTTCACGC - 3Ɔ Omgekeerde primer: 5 &#39; - TCCGGATAAAAACGTCGATGACATTTGC - 3 &#39;</li> <li>zuiveren PCR product met behulp van commerciële DNA zuivering kit. 
		Opmerking: Commerciële kits met behulp van silica kolom gebaseerde procedure opbrengst &#62; 100 ng/µL gezuiverd DNA.</li>
		<li>Maatregel concentratie van DNA spectrofotometrische methode (absorptie bij 260 nm). Verdun de DNA-voorraad van 10 11 kopieën/µL zoals hierboven geïnstrueerde tot werkende oplossingen van 10 10, 10 9, 10, 8 en 10 7 kopieën/µL. 
		Opmerking: Het aantal exemplaren van het PCR-product kan worden berekend volgens de volgende vergelijking, ervan uitgaande dat gemiddeld molecuulgewicht 650 Da voor elke bp: DNA-kopieën/µL = (aantal in ng/µL * 6.022x10 23 kopieën/mol) / (498 bp * 650 g/mol van bp * 1 x 10 9 ng/g)</li></ol></li> <li>magnetische deeltjes <ol><li>toestaan deeltjes sediment zonder de magneet en de bovendrijvende vloeistof verwijderen. Mix 1:20 v/v-verhouding van magnetische deeltjes met ddd water (deeltjes: water). 
		Opmerking: Volume gebaseerde benadering is gebruikt om te beschrijven van hoeveelheden van magnetische deeltjes aangezien gelijke massa's MNPs en MMP gemakkelijk moeilijk waren te vergelijken.</li>
	</ol></li> <li>Bindend buffer <ol><li>voor snelle bereiding van 0,75 M natrium acetaat-HCL-oplossing (pH = 6), meng 1 mL 3 M Natriumacetaat met 1 mM HCL 3 mL. 
		Opmerking: Alle oplossingen in bindende gebruikt kunnen worden achtergelaten bij 4 ° C. opmerking dat lage temperatuur binden met name in het geval van ethanol oplossing aanzienlijk verhoogt. Zorgvuldig controleren van de temperatuur van oplossingen voor betere reproduceerbaarheid en nauwkeurigheid van screening.</li>
	</ol></li></ol> 5. Testen van de efficiëntie van DNA isolatie met behulp van kwantitatieve PCR <ol><li>DNA isolatie door gewijzigde MMP of MNPs <ol><li>gebruiken een 96-wells-plaat en een magneet aangepast voor 96-wells-plaat voor klein volume experimenten.</li>
		<li>Gebruik het volgende bindende oplossing mengsel: 8 µL bewerkt MMP of MNPs, 10 µL natrium acetaat-HCl (0,75 M, pH = 6), 60 µL van 85% ethanol, 10 µL DNA (10 10 exemplaren-oplossing).</li>
		<li>Mix goed door pipetteren en laat de plaat op de magneet voor 3 min. Terwijl de plaat op de magneet, verwijderen van de oplossing en voeg 100 µL van 85% ethanol voor wassen.</li>
		<li>Verwijderen ethanol. 
		Opmerking: Laat de ethanol te drogen voor een paar seconden maar laat niet de deeltjes te drogen of Toon van scheuren. Als de deeltjes te drogen ze zullen moeilijk te ontbinden met elutie oplossing.</li>
		<li>Verwijderen de plaat uit de magneet en voeg 40 µL van elutie oplossing. Meng goed door pipetteren. Plaats de plaat terug op de magneet en verzamelen geëlueerd DNA (~ 37 µL). Eluens bij-20 ° C bewaren tot nadere analyse.</li>
	</ol></li> <li>Kwantitatieve PCR <ol><li>gebruiken de inleidingen die werden gebruikt voor het bereiden van voorraad DNA in stap 4.1.1 te kwantificeren van kopieën van het gen xis, volgens het protocol door Haddad et al.. 10</li> <li>master mix oplossing volgens de hoeveelheid monsters moeten worden getest voor te bereiden, dan het mengsel over PCR buizen of een witte achtergrond 96-wells-plaat verdelen.</li>
		<li>De volgende hoeveelheden gebruiken voor een volledig volume van 20 µL PCR mengsel: 10 µL polymerase / intercalating kleurstof mengsel (zie tabel van materialen), 2 µL DNA-monster, 2 µL voorste primer (10 µM), 2 µL omgekeerde primer (10 µM)</li>
		<li>Instellen de thermocycler volgens het volgende programma: 95 ° C gedurende 120 s, 40 cycli (95 ° C gedurende 15 s, 64 ° C gedurende 15 s, 68 ° C gedurende 45 s), 68 ° C gedurende 5 min.</li>
		<li>Using triplicates voor normen en monsters, de drempel van de cyclus berekenen en construeren van een standaard curve voor het inschatten van het aantal kopieën van het DNA in elk monster opgehaald. Het instrument hier dit automatisch uitgevoerd.</li>
		<li>Hier, het aantal kopieën van het DNA wordt geschat voor totale elutievolume (~ 40 µL). Percentage van DNA ontvangen overeenkomt met het oorspronkelijke bedrag toegevoegd aan de oplossing (totaal 10 11 exemplaren) bindend kan variëren buiten het interval van 0 tot 100.</li>
	</ol></li></ol> 6. DNA-magnetische deeltjes bindende analyse met behulp van DLS <ol><li>Binding van DNA <ol><li>voor grote volume experimenten (in 1,5 mL tube), gebruik de volgende bindende oplossing mengsel: 96 µL bewerkt MMP of MNPs, 120 µL natrium acetaat-HCl (0,75 M, pH = 6), 720 µL van 85% ethanol, 120 µL DNA (10 10 exemplaren oplossing) of 120 µL Tris-HCL buffer (10 mM, pH = 8) voor besturingselement.</li>
	</ol></li> <li>Zeta onderzoek naar de potentiële <ol><li>voorbereiden twee bindoplossingen, één met DNA en een ander met Tris-HCL buffer voor controle volgens de instructies in stap 6.1.1. Voorkom de vorming van luchtbellen, zorgvuldig Pipetteer 800 µL van het mengsel van bindende in een wegwerp cel. 
		Opmerking: Gebruik wegwerp cuvette voor meting van oppervlakte zeta potentiële (zie tabel van materialen).</li>
	</ol></li> <li>De volgende parameters gebruiken bij de meting op DLS instrument: Smoluchowski model met een F(ka) van 1,5, temperatuur: 25 ° C, brekingsindex van dispersief fase (ijzer): 2.344, brekingsindex van dispersief milieu (Water): 1,333. 
	Opmerking: Het aantal DNA-magnetische deeltjes interactie is direct invloed op de meting van replicaat-organismen. Een enkele meting door het instrument neemt 60-70 s. Hier, werd het instrument opgedragen te nemen 10 metingen met 1 min vertraging intervallen. Voor de eenvoud, de resultaten worden getoond op moment 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 en 18 min uit de eerste lezing =.</li>
</ol>

<ol><li>Kulinski, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+preparation+module+for+bacterial+lysis+and+isolation+of+DNA+from+human+urine%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Sample preparation module for bacterial lysis and isolation of DNA from human urine.</a> Biomed Microdevices. 11 (3), 671-678 (2009).</li>
<li>Loonen, A. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Pathogen+DNA+Isolation+Methods+from+Large+Volumes+of+Whole+Blood+to+Improve+Molecular+Diagnosis+of+Bloodstream+Infections%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Comparison of Pathogen DNA Isolation Methods from Large Volumes of Whole Blood to Improve Molecular Diagnosis of Bloodstream Infections.</a> PloS One. 8 (8), (2013).</li>
<li>Mahmoudi, N., Slater, G. F., Fulthorpe, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+commercial+DNA+extraction+kits+for+isolation+and+purification+of+bacterial+and+eukaryotic+DNA+from+PAH-contaminated+soils%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of commercial DNA extraction kits for isolation and purification of bacterial and eukaryotic DNA from PAH-contaminated soils.</a> Can J Microbiol. 57 (8), 623-628 (2011).</li>
<li>Rachmayanti, Y., Leinemann, L., Gailing, O., Finkeldey, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+from+processed+and+unprocessed+wood%3A+Factors+influencing+the+isolation+success%5BTitle%5D)+AND+%22Forensic+Sci+Int+Genet%22%5BJournal%5D)">DNA from processed and unprocessed wood: Factors influencing the isolation success.</a> Forensic Sci Int Genet. 3 (3), 185-192 (2009).</li>
<li>Munir, M. T., Umar, S., Shahzad, K. A., Shah, M. A. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/308698261_Potential_of_Magnetic_Nanoparticles_for_Hepatitis_B_Virus_Detection">Potential of Magnetic Nanoparticles for Hepatitis B Virus Detection.</a> J Nanosci Nanotechnol. 16 (12), 12112-12123 (2016).</li>
<li>Ulbrich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+drug+delivery+with+polymers+and+magnetic+nanoparticles%3A+covalent+and+noncovalent+approaches%2C+release+control%2C+and+clinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Targeted drug delivery with polymers and magnetic nanoparticles: covalent and noncovalent approaches, release control, and clinical studies.</a> Chem Rev. 116 (9), 5338-5431 (2016).</li>
<li>Pershina, A. G., Sazonov, A. E., Filimonov, V. D. <a target="_blank" href="http://iopscience.iop.org/article/10.1070/RC2014v083n04ABEH004412/meta">Magnetic nanoparticles-DNA interactions: design and applications of nanobiohybrid systems.</a> Rus Chem Rev. 83 (4), 299(2014).</li>
<li>Xu, R. L. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1674200108000357">Progress in nanoparticles characterization: Sizing and zeta potential measurement.</a> Particuol. 6 (2), 112-115 (2008).</li>
<li>Krickl, S., Touraud, D., Kunz, W. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0926669017302169">Investigation of ethanolamine stabilized natural rubber latex from Taraxacum kok-saghyz and from Hevea brasiliensis using zeta-potential and dynamic light scattering measurements.</a> Ind Crops Prod. 103, 169-174 (2017).</li>
<li>Haddad, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Isolation+of+DNA+by+Polycharged+Magnetic+Particles%3A+An+Analysis+of+the+Interaction+by+Zeta+Potential+and+Particle+Size%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">The Isolation of DNA by Polycharged Magnetic Particles: An Analysis of the Interaction by Zeta Potential and Particle Size.</a> Int J Mol Sci. 17 (4), (2016).</li>
<li>Tenorio-Neto, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Submicron+magnetic+core+conducting+polypyrrole+polymer+shell%3A+Preparation+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Mater+Sci+Eng+C+Mater+Biol+Appl%22%5BJournal%5D)">Submicron magnetic core conducting polypyrrole polymer shell: Preparation and characterization.</a> Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 61, 688-694 (2016).</li>
<li>Baharvand, H. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/272536835_Encapsulation_of_ferromagnetic_iron_oxide_particles_by_polyester_resin">Encapsulation of ferromagnetic iron oxide particles by polyester resin.</a> e-Polym. 8 (1), 1-9 (2008).</li>
<li>Ghorbani, Z., Baharvand, H., Nezhati, M. N., Panahi, H. A. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s10965-013-0199-0">Magnetic polymer particles modified with beta-cyclodextrin.</a> J Polym Res. 20 (7), (2013).</li>
<li>Heger, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paramagnetic+Nanoparticles+as+a+Platform+for+FRET-Based+Sarcosine+Picomolar+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Paramagnetic Nanoparticles as a Platform for FRET-Based Sarcosine Picomolar Detection.</a> Sci Rep. 5, (2015).</li>
<li>Navarro, E., Serrano-Heras, G., Castaño, M. J., Solera, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25451956">Real-time PCR detection chemistry.</a> Clin Chim Acta. 439, 231-250 (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In dit protocol werden de theoretische principes die DNA binding met magnetische deeltjes via zeta potentiële verklaren onder vraag. Het protocol beschrijft de synthese en de wijziging van magnetische nanodeeltjes en microdeeltjes. Methode voor de bereiding van DNA controle en bindende oplossing worden ook beschreven. Twee strategieën worden hier weergegeven voor screening van DNA-deeltjes interacties: kwantitatieve PCR en DLS benadert. DLS biedt drie indicatoren van fysisch-chemische veranderingen in deeltjes: deeltjesg...

DNA isolatie is een van de meest essentiële stappen in moleculaire biologie. De ontwikkeling van nucleïnezuur extractiemethoden heeft grote impact op het opkomende gebied van de genomica, metagenomics en epigenetica transcriptomics. Er is een breed scala van biotechnologische toepassingen voor DNA isolatie met inbegrip van medische (forensische/diagnose tools en prognostische biomarkers) en milieu-toepassingen (metagenomic biodiversiteit, pathogen prevalentie en toezicht). Er is toenemende vraag om te zuiveren en isoleren van DNA van verschillende materialen en in verschillende schalen zoals bloed, urine, bodem, hout en andere soorten monsters. 1 , 2 , 3 , 4
Nano - en micro-gerangschikte deeltjes zijn geschikt voor DNA isolatie vanwege hun hoge oppervlakte en in het bijzonder wanneer ze door een magnetisch veld kunnen worden geïmmobiliseerd. Fysisch-chemische eigenschappen van deeltjes, zoals het formaat of de lading, kunnen hun vermogen om te binden doel biomoleculen sterk beïnvloeden. 5 ter verdere versterking van de binding van biomoleculen en deeltjes stabiel te houden, kunnen er verschillende chemische wijzigingen (oppervlaktecoatings) worden gebruikt. De vele verschillende strategieën voor bindende worden ingedeeld covalent en niet-covalente interacties. 6 de grootte van de deeltjes rechtstreeks van invloed is op hun magnetisatie-eigenschappen, overwegende dat deeltje samenstelling kan worden aangepast door opneming van metalen, aluminium of andere materialen die invloed op de dichtheid, porositeit en oppervlak uitoefenen kunnen. 7 is er geen betrouwbare manier om te meten oppervlak last van kleine deeltjes. In plaats daarvan, de elektrische potentiaal op het desbetreffende vliegtuig (enige afstand van nanoparticle oppervlak) kan worden gemeten. 8 deze waarde heet zeta potentiële en het is een krachtig instrument dat gewoonlijk wordt gebruikt voor de evaluatie van nano- en microparticle stabiliteit via DLS. 9 omdat de waarde ervan sterk afhankelijk zijn niet alleen van de pH en de Ionische sterkte van de verspreide omgeving, maar ook over de oppervlakte kenmerken van de deeltjes is, het kan ook blijken de veranderingen in dit oppervlak veroorzaakt door de interactie tussen de deeltjes en molecule van belang. 10
Aan de andere kant, voorkomende DNA-structuur in gedehydrateerde voorwaarden (A-DNA formulier) exposities gecomprimeerde conformaties die haar neerslag (aggregatie vergemakkelijken) in vergelijking tot vaak B-DNA formulier. Elektrostatische (Ionische en H-binding) zijn de grote krachten die beheersing van de binding van DNA met andere materialen als gevolg van hun sterically toegankelijk fosfaat en stikstof (met name guanine) baseert. 7 , 10
In dit werk, drie representatieve chemische wijzigingen van magnetische nanodeeltjes en microdeeltjes worden geanalyseerd (figuur 1A). De methode van synthese en chemische modificatie van nanodeeltjes en microdeeltjes wordt beschreven. Een bindoplossing, die akkoorden aan de theoretische principes van DNA neerslag (pH, Ionische sterkte en uitdroging), wordt gebruikt ter beoordeling van DNA-bindende en elutie. Kwantitatieve PCR wordt gebruikt ter beoordeling van de efficiëntie van de elutie van DNA van de representatieve nanodeeltjes en microdeeltjes (figuur 1B). Deeltjesgrootte, polydispersiteit index en zeta potentiële zijn belangrijke parameters die worden gebruikt voor het visualiseren van de fysisch-chemische veranderingen die op deeltje oppervlak (Figuur 1 c optreden). Het is belangrijk om te benadrukken op de chemische karakterisatie van magnetische deeltjes oppervlak. Hoewel deze stap buiten het bestek van dit protocol was, kunnen verschillende moderne technieken worden toegepast om na te gaan van de efficiëntie van chemische wijzigingen. 11 , 12 , 13 , 14 Fourier transform infrarood spectroscopie (FTIR) kan worden gebruikt voor het infraroodspectrum van deeltje oppervlak te evalueren en te vergelijken met het spectrum van gratis chemische modifiers. X-Ray photoelectron spectroscopy (XPS) is een andere techniek die kan worden gebruikt voor het identificeren van de elementaire samenstelling van materiële oppervlak. Andere elektrochemische, microscopische en spectroscopische methoden kunnen worden gebruikt de licht werpen op de kwaliteit van deeltje synthese. Dit werk markeert een nieuw perspectief te analyseren DNA-magnetische deeltjes interacties via DLS.

<table><tbody><tr><td>Iron(III) chloride hexahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>207926</td><td>Magneetdeeltjessynthese</td></tr><tr><td>Iron(II) chloride tetrahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>380024</td><td>Magneetdeeltjessynthese</td></tr><tr><td>Iron(II) sulfate heptahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8263</td><td>Magneetdeeltjessynthese</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Penta</td><td>10060-11000</td><td>Magneetdeeltjessynthese</td></tr><tr><td>Sodium citrate dihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W302600</td><td>Magneetdeeltjessynthese</td></tr><tr><td>Tetraethyl orthosilicate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>131903</td><td>Magneetdeeltjessynthese</td></tr><tr><td>(3-Aminopropyl)triethoxysilane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440140</td><td>Magneetdeeltjessynthese</td></tr><tr><td>Polyethylenimine, branched, average Mw ~25,000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>408727</td><td>Magneetdeeltjessynthese</td></tr><tr><td>Ammonium hydroxide solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221228-M&nbsp;</td><td>Magneetdeeltjessynthese</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Penta</td><td>71250-11000</td><td>Magneetdeeltjessynthese</td></tr><tr><td>Potassium nitrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6083</td><td>Magneetdeeltjessynthese</td></tr><tr><td>Potassium hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.05012</td><td>Magneetdeeltjessynthese</td></tr><tr><td>Low-molecular-weight cut-off membrane (Mw=1 kDa)</td><td>Spectrum labs</td><td>G235063</td><td>Magneetdeeltjessynthese</td></tr><tr><td>Overhead Stirrer</td><td>witeg Labortechnik GmbH</td><td>DH.WOS01035</td><td>Magneetdeeltjessynthese</td></tr><tr><td>Waterbath</td><td>Memmert GmbH + Co.</td><td>84198998</td><td>Magneetdeeltjessynthese</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Bandelin</td><td>795</td><td>Magneetdeeltjessynthese</td></tr><tr><td>BRAND UV cuvette micro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR759200-100EA</td><td>Cuvet voor groottemeting</td></tr><tr><td>BRAND cap voor UV-cuvet micro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR759240-100EA</td><td>Cuvetdeksels voor groottemeting</td></tr><tr><td>Folded Capillary Zeta Cell</td><td>Malvern</td><td>DTS1070</td><td>Cuvet voor zeta potentiaal meting</td></tr><tr><td>Zetasizer Nano ZS</td><td>Malvern</td><td>ZEN3600</td><td>Apparaat voor meting van grootte en zeta potentiaal</td></tr><tr><td>Infinite 200 PRO NanoQuant instrument</td><td>Tecan</td><td>396 227 V1.0, 04-2010</td><td>Apparaat voor meting van DNA concentratie</td></tr><tr><td>SYBR Green Quantitative RT-PCR Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>QR0100</td><td>PCR kit</td></tr><tr><td>Mastercycler pro S instrument</td><td>Eppendorf</td><td>6325 000.013</td><td>Thermocycler</td></tr><tr><td>MinElute kit</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td>DNA zuiveringskit</td></tr><tr><td>Sodium acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7670</td><td>DNA binding</td></tr></tbody></table>

dna-magnetische deeltjes analyse door dynamische en elektroforetische lichtverstrooiing bindend

DNA-magnetic Particle Binding Analysis by Dynamic and Electrophoretic Light Scattering

Isolatie van DNA met behulp van magnetische deeltjes is een gebied van groot belang in de biotechnologie en moleculaire biologie onderzoek. Dit protocol beschrijft de beoordeling van DNA-magnetische deeltjes bindend via Dynamische lichtverstrooiing (DLS) en elektroforetische lichtverstrooiing (ELS). Analyse door DLS biedt waardevolle informatie over de fysisch-chemische eigenschappen van deeltjes met inbegrip van deeltjesgrootte, polydispersiteit en zeta potentiële. De laatstgenoemde beschrijft de oppervlakte lading van de deeltjes die hoofdrol in elektrostatische binding van materialen zoals DNA speelt. Hier is een vergelijkende analyse exploiteert drie chemische wijzigingen van nanodeeltjes en microdeeltjes en hun effecten op DNA-bindende en elutie. Chemische wijzigingen door vertakt polyethylenimine, tetraethyl orthosilicate en (3-aminopropyl) triethoxysilane worden onderzocht. Aangezien DNA een negatieve lading vertoont, verwacht wordt dat de zeta potentieel van deeltje oppervlak op binding van DNA zal afnemen. Vorming van clusters, moet dit ook invloed op de deeltjesgrootte. Om te onderzoeken de efficiëntie van deze deeltjes in isolatie en de elutie van DNA, worden de deeltjes vermengd met DNA in lage pH (~ 6), hoge Ionische sterkte en uitdroging milieu. Deeltjes worden gewassen op magneet en DNA wordt dan uitgewassen door Tris-HCl buffer (pH = 8). DNA exemplaaraantal is geschat aan de hand van kwantitatieve polymerase-kettingreactie (PCR). Zeta potentieel, deeltjesgrootte, polydispersiteit en kwantitatieve PCR-gegevens zijn geëvalueerd en vergeleken. DLS is een inzichtelijke en ondersteuning van de analysemethode waarmee u een nieuw perspectief aan het proces van screening van deeltjes voor DNA isolatie toevoegt.

Met behulp van het protocol beschreven hier voor chemische synthese en wijziging van magnetische deeltjes, werden zes magnetische deeltjes gesynthetiseerd en geanalyseerd voor het DNA binden. Een samenvatting van de analyse wordt weergegeven in tabel 1. Door vergelijking van de grootte van de deeltjes in water en in bindoplossing, is het duidelijk dat alle deeltjes in oplossing bindend door 2-22 plooien samengevoegd. Sommige deeltjes verder samengevoegd tot meer plooien i...

Dit protocol beschrijft de synthese van magnetische deeltjes en evaluatie van hun DNA-bindende eigenschappen via dynamische en elektroforetische lichtverstrooiing. Deze methode richt zich op het volgen van veranderingen in de grootte van de deeltjes, hun polydispersiteit en zeta potentieel van deeltje oppervlak die spelen belangrijke rol bij het binden van materialen zoals DNA.

DNA-magnetische deeltjes analyse door dynamische en elektroforetische lichtverstrooiing bindend

Isolation of DNA using magnetic particles is a field of high importance in biotechnology and molecular biology research. This protocol describes the ...

Het algemene doel van dit experiment is om de binding van DNA en magnetische deeltjes te analyseren via Dynamische en Elektroforetische Lichtverstrooiing. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen in het biotechnologieveld, zoals hoe snel en sterk de binding is tussen nucleïnezuur en magnetische deeltjes. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de visualisatie van fysisch-chemische veranderingen op de deeltjes, zoals grootte, polydispersiteit of zetapotentiaal. De implicaties van deze techniek strekken zich uit naar moleculaire diagnose vanwege de toenemende vraag naar snelle en gevoelige DNA-isolatie. In deze procedure, voeg 20 millimol Ferric Chloride en tien millimol Ferrous Chloride toe in 20 milliliter gedeoxygeneerd Dubbel Gedestilleerd Water. Roer vervolgens de verkregen oplossing krachtig in een beker onder stikstofgasatmosfeer met behulp van een mechanische roerder tot een transparante oplossing is verkregen. Vervolgens, onder snelle mechanische roeren, voeg onder druppelsgewijs toevoeging met een druppeltrechter gedurende een uur, 150 milliliter van één molaar waterige ammoniak toe. Breng daarna de oplossing over in een schroefblik en verwarm

dna-magnetic-particle-binding-analysis-dynamic-electrophoretic-light

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

In dit artikel wordt een eenvoudige, kwantitatieve, vloeibare fase affiniteit capture assay gepresenteerd. Het is een betrouwbare techniek op de interactie tussen het magnetische kralen en gemerkte eiwitten (bijv. nanobodies) enerzijds en de affiniteit tussen het gemerkte eiwit en een tweede, gemerkt eiwit (bijv. poliovirus) anderzijds.

Een vloeibare fase Affiniteit Capture test met behulp van magnetische korrels aan eiwit-eiwit interactie te bestuderen: het poliovirus-Nanobody Voorbeeld

Een scanner voor beeldvorming magnetische deeltjes in vlakke monsters werd ontwikkeld met vlakke frequentie mengen magnetische detectietechniek. De magnetische intermodulatieproduct reactie van de lineaire nonhysteretic magnetisatie van de deeltjes wordt opgenomen op een twee-frequentie excitatie. Het kan worden gebruikt om 2D beelden dunne biologische monsters.

Frequentie mengen Magnetic Detection Scanner voor de beeldvorming van magnetische deeltjes in Planar Samples

We presenteren een strategisch plan en protocol voor het identificeren van niet-coderende genetische varianten die de binding van transcriptiefactoren (TF) aan DNA beïnvloeden. Er wordt een gedetailleerd experimenteel protocol gegeven voor elektroforetische mobiliteitsverschuivingsassay (EMSA) en DNA-affiniteitsprecipitatie-assay (DAPA) analyse van genotype-afhankelijke TF DNA-binding.

Screening voor Functionele niet-coderende genetische varianten Met behulp van Electroforetische Mobility Shift Assay (EMSA) en DNA-affiniteit Neerslag Assay (DAPA)

Hier gebruiken we een polyurethaan afstembare nanopore geïntegreerd in een weerstandsbelasting puls detectie techniek nanodeeltjes oppervlaktechemie gekenmerkt via de meting van het translocatie snelheden, die kunnen worden gebruikt om het zeta potentieel van individuele nanodeeltjes bepalen.

Bepaling van de Zeta Potentiële via nanodeeltjes Translocation Snelheden door een Tunable Nanopore: Met behulp van DNA-gemodificeerde deeltjes als een voorbeeld

Hier presenteren we een protocol voor de productie en zuivering van eiwitten die zijn gemarkeerd met stabiele isotopen, en verdere karakterisering van eiwit-eiwitinteractie met behulp nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie en MicroScale Thermophoresis (MST) experimenten.

Meten van interacties van bolvormige en filamenteuze eiwitten door nucleaire magnetische resonantie spectroscopie (NMR) en Microscale Thermophoresis (MST)

Een protocol voor de toepassing van paramagnetische relaxatieverbetering NMR-spectroscopie om zwakke en voorbijgaande inter- en intramoleculaire interacties in intrinsiek ongeordende eiwitten te detecteren, wordt gepresenteerd.

Paramagnetische relaxatieverbetering voor het detecteren en karakteriseren van zelfassociaties van intrinsiek ongeordende eiwitten

Hier beschrijven we een snelle magnetische pincetopstelling die nanomechanische metingen uitvoert op krachtgevoelige biomoleculen met de maximale snelheid van 1,2 kHz. We introduceren de toepassing ervan op DNA-haarspelden en SNARE-complexen als modelsystemen, maar het zal ook van toepassing zijn op andere moleculen die betrokken zijn bij mechanobiologische gebeurtenissen.

High-speed magnetisch pincet voor nanomechanische metingen aan krachtgevoelige elementen

We rapporteren een hybride ensemble- en single-molecule-assay om de beweging van fluorescerend gelabelde, volledig gereconstitueerde Cdc45/Mcm2-7/GINS (CMG) helicase op lineaire DNA-moleculen die op hun plaats worden gehouden in een optische val, direct in beeld te brengen en te kwantificeren.

Hybride ensemble en single-molecule assay om de beweging van volledig gereconstitueerde CMG in beeld te brengen

Antivrieseiwitten (ACP's) binden zich aan specifieke ijsvlakken om ijsgroei te voorkomen of te vertragen. Fluorescentie-gebaseerde ijsvlakaffiniteitsanalyse (FIPA) is een wijziging van de oorspronkelijke ijsetsmethode voor de bepaling van AFP-gebonden ijsvlakken. AFP's zijn fluorescerend gelabeld, verwerkt in macroscopische enkelvoudige ijskristallen en gevisualiseerd onder UV-licht.

Het bepalen van de IJsbindende Vlakken van Antivries eiwitten door Fluorescentie-gebaseerde Ice Plane Affiniteit

Colloïdale sondev-nanoscopie kan binnen verschillende velden worden gebruikt om inzicht te krijgen in de fysische stabiliteit en coagulatiesnelheid van colloïdale systemen en om medicijnontdekking en formuleringswetenschappen te ondersteunen met behulp van biologische systemen. De beschreven methode biedt een kwantitatief en kwalitatief middel om dergelijke systemen te bestuderen.

Kwantitatieve en kwalitatieve onderzoek van Particle-deeltje Interacties gebruik Colloïdaal Probe Nanoscopy

Leer de synthese en karakterisering van magnetische deeltjes voor DNA-binding met dynamische en elektroforetische lichtverstrooiing. Deze methode optimaliseert deeltjesontwerp voor biotechnologische toepassingen.

DNA-magnetische deeltjes analyse door dynamische en elektroforetische lichtverstrooiing bindend

Meer video's verkennen