Genoom-brede kwantificering van vertaling in de ontluikende gist door het ribosoom profilering

Het algemene doel van deze procedure is om te identificeren welke regio's van mRNA worden omgezet in eiwitten, eiwittranslatie kwantitatief meten in knopsporigene gist Saccharomyces cerevisiae op genoombreed niveau. Ribosoomprofilering kan worden gebruikt om de snelheid van eiwitten en ziekten te volgen en om de mechanismen van translationele regulatie te bestuderen. Het grote voordeel van deze techniek is dat het een veel hogere gevoeligheid biedt in vergelijking met andere methoden, en van die, het meten van eiwitten en ziekten in vivo op een enkele contactresolutie.

Hoewel dit protocol specifiek is voor knopsporigene gist, is het ook nuttig voor onderzoekers die ribosoomprofilering in andere modelsystemen proberen te vestigen, zoals zoogdiercellen en -weefsels. Extracten worden bereid uit gistcellen die zijn gekweekt tot midden log fase. Gebruik een glazen houder met filterassemblage om de cultuur te filteren door middel van 0,45 micromembrane filters.

Schraap de pellet met de spatel, vries snel in vloeibare stikstof en bewaar bij min 80 graden Celsius. Plaats drie chroomstalen 3,2 millimeter kralen in een roestvrijstalen buis van 1,8 milliliter en koel de buis vooraf in vloeibare stikstof. Voeg de bevroren pellets toe en dek de stalen buis af met een siliconenrubberen dop.

Homogeniseer het monster door 10 seconden bij 4200 tpm cryo-malen. Om de monsters tijdens het volledige malenprocedure bevroren te houden, is het van cruciaal belang om de buis gedurende minimaal 10 seconden in vloeibare stikstof te koelen tussen elke malen. Wanneer de homogenisatie is voltooid, voegt u een milliliter lysisbuffer met cycloheximide toe aan het monster.

Meng goed door pipetteren en breng het monster over naar een nieuwe buis van 1,5 milliliter. Centrifugeer bij 20.000 keer g bij vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Breng het supernatant over in een nieuwe buis van 1,5 milliliter.

Breng 100 microliters lysaat over naar een andere nieuwe buis van 1,5 milliliter voor poly(A)mRNA isolatie. Vries de buizen met de mRNA-monsters op de rest van het lysaat, die zal worden gebruikt voor footprint extractie, snel in vloeibare stikstof en bewaar bij min 80 graden Celsius. De nacht voor de footprint extractie, ontdooi eerder bereide sucrose gradiënten bij vier graden Celsius.

De volgende dag ontdooit u het cellysaat op ijs. Breng een aliquot van cellysaat met 50 OD260 eenheden over in een nieuwe buis van 1,5 milliliter, voeg vers lysisbuffer toe tot een milliliter en 10 microliters RNase een. Incubeer bij kamertemperatuur met zacht draaien op een kop over hoofd roterende kop gedurende een uur.

Vervolgens, legt u voorzichtig het lysaatmonster op een 10% tot 50% sucrose gradiënt in polymeerbuizen. Gebruik een SW41 ti rotor, ultracentrifugeer bij 35.000 tpm bij vier graden Celsius gedurende drie uur. Tijdens de ultracentrifugatie, zet het gradiënt fractioneringssysteem op.

Schakel de componenten in en laat de UV-monitor minimaal 30 minuten opwarmen. Vul de spuit met chase-oplossing en verwijder eventuele luchtbellen in de spuit en canula. Wanneer de ultracentrifugatie voltooid is, installeert en doorboort u de ultracentrifugebuis met de sucrosegradiënt.

Start de spuitpomp bij één milliliter per minuut en verzamel één milliliter fracties terwijl u de A254-waarden bewaakt. Fracties die de ADS monosome piek vertegenwoordigen, worden verzameld en gepoold. Filter de fracties door middel van 0,5 milliliter centrifugale filters bij 12.000 keer g bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten, gooi de flow-through weg en herhaal tot het volume minder dan 100 microliter is.

Bij 400 microliters releasebuffer, gemengd door pipetteren en incubeer op ijs gedurende 10 minuten, breng de eenheid over in een nieuwe opvangbuis en centrifugeer bij 12.000 keer g bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Verzamel de flow-through. Vervolgens zuivert u de footprint fragmenten en precipiteer de monsters met ethanolprecipitatie zoals beschreven in het tekstprotocol.

Om deze procedure te starten, centrifugeert u de geprecipiteerde footprint en gefragmenteerde mRNA-monsters bij 20.000 keer g en vier graden Celsius gedurende 30 minuten. Na het verwijderen van ethanol en luchtdrogen van de pellets, suspenderen we elke pellet in 7,75 microliter water. Voeg aan elke pellet een microliter van 10XT4 polynucleotide kinase buffer, een microliter T4 polynucleotide kinase en 0,25 microliters RNase inhibitor toe.

Incubeer bij 37 graden Celsius gedurende één uur. Voeg 10 microliters 2X TBE ureum monsterbuffer toe aan 10 microliters van elk footprint en mRNA monster. Incubeer de monsters en geschikte controles bij 75 graden Celsius gedurende drie minuten, centrifugeer naar beneden en zet op ijs gedurende één minuut.

Laad elk monster in twee putjes van een 15%TBE ureum gel en scheid de RNA-fragmenten door middel van gelelektroforese bij 180 volt gedurende één uur. Kleur de gel met een nucleïnezuurgelkleurstof, beschermd tegen licht gedurende vijf minuten. Terwijl u de gel visualiseert onder een blauw lichttransilluminator, snijdt u de juiste band tussen 28 en 32 nucleotiden voor footprint monsters en rond 50 tot 70 nucleotiden voor mRNA monsters.

Vries de uitgesneden polyacrylamide gel stukken bij min 80 graden Celsius gedurende ten minste 10 minuten voordat u RNA uit de polyacrylamide gel extraheert. Voorafgaand aan reverse transcriptie, voer ligatie van de 3' adapter uit en precipiteer de monsters zoals beschreven in het tekstprotocol. Resuspendeer elke pellet in 11,5 microliter nuclease-vrij water.

Voeg vervolgens 0,5 microliters van acht micromolar reverse transcriptie primer en een microliter dNTP mix toe. Incubeer bij 65 graden Celsius gedurende vijf minuten en plaats vervolgens op ijs. Voeg aan elk monster vier microliters 5x eerste streng buffer, twee microliters 0,1 molair DTT, 0,5 microliters RNase inhibitor en 0,5 microliters reverse transcriptase toe.

Incubeer bij 48 graden Celsius gedurende 30 minuten, 65 graden Celsius gedurende één minuut en 80 grade