Name: Genoom-brede kwantificering van vertaling in de ontluikende gist door het ribosoom profilering (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 57 s
Description: Leer ribosoomprofilering voor genoom-brede kwantificering van eiwittranslatie in Saccharomyces cerevisiae. Deze gevoelige methode helpt onderzoekers translatie-efficiëntie en regulatiemechanismen in vivo te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd gesteund door de National Institutes of Health grants AG040191 en AG054566 naar VML. Dit onderzoek werd uitgevoerd terwijl VML een onderzoeksbeurs van de AFAR-ontvanger van de Amerikaanse Federatie voor veroudering onderzoek was.

<ol><li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+in+stress+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).</li>
<li>Tanenbaum, M. E., Stern-Ginossar, N., Weissman, J. S., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mRNA+translation+during+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Regulation of mRNA translation during mitosis.</a> Elife. 4, (2015).</li>
<li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li>
<li>Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+translational+profiling+by+ribosome+footprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide translational profiling by ribosome footprinting.</a> Methods Enzymol. 470, 119-142 (2010).</li>
<li>Brar, G. A., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+profiling+reveals+the+what%2C+when%2C+where+and+how+of+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (11), 651-664 (2015).</li>
<li>Wolin, S. L., Walter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+pausing+and+stacking+during+translation+of+a+eukaryotic+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA.</a> EMBO J. 7 (11), 3559-3569 (1988).</li>
<li>Guo, H., Ingolia, N. T., Weissman, J. S., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+microRNAs+predominantly+act+to+decrease+target+mRNA+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels.</a> Nature. 466 (7308), 835-840 (2010).</li>
<li>Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nat Protoc. 7 (8), 1534-1550 (2012).</li>
<li>Bartholomaus, A., Del Campo, C., Ignatova, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+non-standardized+biases+of+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mapping the non-standardized biases of ribosome profiling.</a> Biol Chem. 397 (1), 23-35 (2016).</li>
<li>Larsson, O., Sonenberg, N., Nadon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((anota%3A+Analysis+of+differential+translation+in+genome-wide+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">anota: Analysis of differential translation in genome-wide studies.</a> Bioinformatics. 27 (10), 1440-1441 (2011).</li>
<li>Zhong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RiboDiff%3A+detecting+changes+of+mRNA+translation+efficiency+from+ribosome+footprints%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">RiboDiff: detecting changes of mRNA translation efficiency from ribosome footprints.</a> Bioinformatics. 33 (1), 139-141 (2017).</li>
<li>Xiao, Z., Zou, Q., Liu, Y., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+assessment+of+differential+translations+with+ribosome+profiling+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Genome-wide assessment of differential translations with ribosome profiling data.</a> Nat Commun. 7, 11194(2016).</li>
<li>Chung, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+duplex-specific+nuclease+in+ribosome+profiling+and+a+user-friendly+software+package+for+Ribo-seq+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">The use of duplex-specific nuclease in ribosome profiling and a user-friendly software package for Ribo-seq data analysis.</a> RNA. 21 (10), 1731-1745 (2015).</li>
<li>Popa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RiboProfiling%3A+a+Bioconductor+package+for+standard+Ribo-seq+pipeline+processing%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Res%22%5BJournal%5D)">RiboProfiling: a Bioconductor package for standard Ribo-seq pipeline processing.</a> F1000Res. 5, 1309(2016).</li>
<li>Dunn, J. G., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plastid%3A+nucleotide-resolution+analysis+of+next-generation+sequencing+and+genomics+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Plastid: nucleotide-resolution analysis of next-generation sequencing and genomics data.</a> BMC Genomics. 17 (1), 958(2016).</li>
<li>Baranov, P. V., Michel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+translation+with+ribosome+profiling+spectra%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Illuminating translation with ribosome profiling spectra.</a> Nat Methods. 13 (2), 123-124 (2016).</li>
<li>Calviello, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+actively+translated+open+reading+frames+in+ribosome+profiling+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Detecting actively translated open reading frames in ribosome profiling data.</a> Nat Methods. 13 (2), 165-170 (2016).</li>
<li>Michel, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RiboGalaxy%3A+A+browser+based+platform+for+the+alignment%2C+analysis+and+visualization+of+ribosome+profiling+data%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">RiboGalaxy: A browser based platform for the alignment, analysis and visualization of ribosome profiling data.</a> RNA Biol. 13 (3), 316-319 (2016).</li>
<li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://journal.embnet.org/index.php/embnetjournal/article/view/200">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet J. 17 (1), 10-12 (2011).</li>
<li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biol. 10 (3), R25(2009).</li>
<li>Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HTSeq--a+Python+framework+to+work+with+high-throughput+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">HTSeq--a Python framework to work with high-throughput sequencing data.</a> Bioinformatics. 31 (2), 166-169 (2015).</li>
<li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biol. 15 (12), 550(2014).</li>
<li>van den Elzen, A. M., Schuller, A., Green, R., Seraphin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dom34-Hbs1+mediated+dissociation+of+inactive+80S+ribosomes+promotes+restart+of+translation+after+stress%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Dom34-Hbs1 mediated dissociation of inactive 80S ribosomes promotes restart of translation after stress.</a> EMBO J. 33 (3), 265-276 (2014).</li>
<li>Guydosh, N. R., Green, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dom34+rescues+ribosomes+in+3%27+untranslated+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dom34 rescues ribosomes in 3' untranslated regions.</a> Cell. 156 (5), 950-962 (2014).</li>
<li>Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+profiling%3A+new+views+of+translation%2C+from+single+codons+to+genome+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale.</a> Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).</li>
<li>Gerashchenko, M. V., Lobanov, A. V., Gladyshev, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+ribosome+profiling+reveals+complex+translational+regulation+in+response+to+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genome-wide ribosome profiling reveals complex translational regulation in response to oxidative stress.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (43), 17394-17399 (2012).</li>
<li>Weinberg, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+ribosome-footprint+and+mRNA+measurements+provide+insights+into+dynamics+and+regulation+of+yeast+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Improved ribosome-footprint and mRNA measurements provide insights into dynamics and regulation of yeast translation.</a> Cell Rep. 14 (7), 1787-1799 (2016).</li>
<li>Park, J. E., Yi, H., Kim, Y., Chang, H., Kim, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+poly%28A%29+tail+and+translation+during+the+somatic+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of poly(A) tail and translation during the somatic cell cycle.</a> Mol Cell. 62 (3), 462-471 (2016).</li>
<li>Howard, M. T., Carlson, B. A., Anderson, C. B., Hatfield, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+redefinition+of+UGA+codons+is+regulated+by+selenium+availability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Translational redefinition of UGA codons is regulated by selenium availability.</a> J Biol Chem. 288 (27), 19401-19413 (2013).</li>
<li>Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribonuclease+selection+for+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Ribonuclease selection for ribosome profiling.</a> Nucleic Acids Res. 45 (2), e6(2017).</li>
<li>Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation+inhibitors+cause+abnormalities+in+ribosome+profiling+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Translation inhibitors cause abnormalities in ribosome profiling experiments.</a> Nucleic Acids Res. 42 (17), e134(2014).</li>
<li>O'Connor, P. B., Andreev, D. E., Baranov, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+survey+of+the+relative+impact+of+mRNA+features+on+local+ribosome+profiling+read+density%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Comparative survey of the relative impact of mRNA features on local ribosome profiling read density.</a> Nat Commun. 7, 12915(2016).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

De Ribo-Seq-aanpak heeft ontpopt als een krachtige technologie voor de analyse van mRNA vertaling in vivo aan de genoom-brede niveau 3. Studies met deze aanpak, die zorgt voor de opvolging van de vertaling met single-codon resolutie, heeft bijgedragen aan ons begrip van translationeel verordening. Ondanks zijn voordelen heeft Ribo-Seq verscheidene beperkingen. Ribosomaal RNA (rRNA) fragmenten zijn altijd mede gezuiverde tijdens Isolatievan ribosoom beveiligd voetafdrukken minderen van de ...

vertaling van mRNA is een van de fundamentele processen in de cel, die een belangrijke rol in de regulatie van eiwit expressie speelt. Vertaling van mRNA is daarom streng gecontroleerd in reactie op verschillende interne en externe fysiologische stimuli 1,2. De mechanismen van translationeel verordening blijven echter understudied. Hier beschrijven we het protocol voor genoom-brede kwantificering van vertaling in de ontluikende gist door het ribosoom profilering. Het algemene doel van het ribosoom profiling techniek is om te studeren en kwantificeren van de vertaling van specifieke mRNAs onder verschillende cellulaire omstandigheden. Deze techniek maakt gebruik van volgende-generatie sequencing kwantitatief ribosoom bezetting gedurende het genoom te analyseren en zorgt voor de opvolging van het tempo van de eiwit synthese in vivo aan de enkel codon resolutie 3,4. Op dit moment deze methode biedt de meest geavanceerde middelen voor het meten van de hoeveelheid eiwit vertaling, en heeft bewezen te zijn een nuttige ontdekkingshulpmiddel verstrekken van informatie die door andere momenteel beschikbare technieken, bijvoorbeeld microarrays kan niet worden onthuld of vertaling staat matrix analyse (TSAA) 5. Als ribosoom profilering van de verslagen over de gecombineerde wijzigingen in afschrift niveaus en eindmaterialen zijn translationeel, biedt het ook veel grotere gevoeligheid ten opzichte van andere methoden.
Deze aanpak is gebaseerd op diep sequentiebepaling van ribosoom beveiligd mRNA fragmenten 3. Tijdens de eiwit vertaling, ribosomen beschermen ~ 28 nt gedeelten van de mRNA (genaamd voetafdrukken) 6. Door het bepalen van de volgorde van de fragmenten ribosoom-beschermd, kan Ribo-Seq betreffendedepositie van ribosomen op het vertaalde mRNA in kaart en bepalen welke gebieden van mRNA zijn waarschijnlijk actief in eiwit 3,7worden omgezet. Daarnaast kunnen we de vertaling van mRNA kwantitatief meten door het tellen van het aantal voetafdrukken die zijn afgestemd op een bepaalde transcriptie van mRNA.
Om te isoleren van het ribosoom beveiligd fragmenten, worden cel lysates in eerste instantie behandeld met een vertaling-remmer tot stilstand van de ribosomen gevolgd door ribonuclease spijsvertering. Overwegende dat vrije mRNA en delen van vertaalde mRNAs niet beschermd door de ribosomen zijn afgebroken door ribonuclease, kunnen het ribosoom beveiligd mRNA fragmenten worden hersteld door het zuiveren van intact ribosoom-voetafdruk complexen. Deze mRNA voetafdrukken worden vervolgens omgezet in cDNA Bibliotheek en geanalyseerd door diepe sequentiebepaling (Figuur 1). Parallel aan het ribosoom profilering, is intact mRNA geëxtraheerd uit hetzelfde monster en sequenced. Door het vergelijken van het niveau van de vertaling geïdentificeerd door Ribo-Seq met mRNA overvloed metingen, kunnen we identificeren van genen die specifiek up - of down-geregeld op het niveau van de vertaling en berekenen van de efficiëntie van de vertaling van mRNA op het genoom-brede niveau. Terwijl het protocol beschreven in dit artikel specifiek voor gist is, zou het ook nuttig zijn voor onderzoekers die proberen zal om het Ribo-Seq-protocol in andere systemen.

<table><tbody><tr><td>0.45 &mu;M membraanfilters</td><td>Millipore</td><td>HVLP04700</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>AM9261</td><td></td></tr><tr><td>0.5 mL centrifugale filters (100 kDa MWCO)</td><td>Millipore</td><td>UFC510024</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl, pH 7.0</td><td>Invitrogen</td><td>AM9850G</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl, pH 7.5 (pH 8.0 bij 4&deg;C)</td><td>Invitrogen</td><td>15567-027</td><td></td></tr><tr><td>10X TBE buffer</td><td>Invitrogen</td><td>AM9863</td><td></td></tr><tr><td>10% TBE-ureageel</td><td>Invitrogen</td><td>EC6875BOX</td><td></td></tr><tr><td>15% TBE-ureageel</td><td>Invitrogen</td><td>EC6885BOX</td><td></td></tr><tr><td>2 M MgCl2</td><td>RPI</td><td>M24500-10.0</td><td></td></tr><tr><td>2X TBE-ureageel buffer</td><td>Invitrogen</td><td>LC6876</td><td></td></tr><tr><td>3M NaOAc, pH 5.5</td><td>Invitrogen</td><td>AM9740</td><td></td></tr><tr><td>5' Deadenylase (10 U/μL)</td><td>Epicentre</td><td>DA11101K</td><td></td></tr><tr><td>5X Nucleïnezuur monster buffer</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0767</td><td></td></tr><tr><td>8% TBE geel</td><td>Invitrogen</td><td>EC6215BOX</td><td></td></tr><tr><td>Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (met IAA, 125:24:1)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9722</td><td></td></tr><tr><td>Blauwlicht transilluminator</td><td>Clare Chemical Research</td><td>DR-46B</td><td></td></tr><tr><td>Chrome-staalkorrels, 3,2 mm</td><td>BioSpec Products</td><td>11079132c</td><td></td></tr><tr><td>Cryogrinder</td><td>Biospec product</td><td>3110BX</td><td></td></tr><tr><td>Cycloheximide</td><td>RPI</td><td>C81040-5.0</td><td></td></tr><tr><td>Data verzamelsysteem</td><td>DATAQ Instruments</td><td>DI-245</td><td></td></tr><tr><td>Deoxynucleotide (dNTP) oplossingsmix (10 mM)</td><td>NEB</td><td>N0447L</td><td></td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>Invitrogen</td><td>AM9510</td><td></td></tr><tr><td>Gradiënt fractionering systeem</td><td>Brandel</td><td>BR-184X</td><td></td></tr><tr><td>High-fidelity DNA polymerase (2.000 U/mL)</td><td>NEB</td><td>M0530S</td><td>Geleverd met 5X Phusion HF Buffer</td></tr><tr><td>Next-generation sequencing bibliotheek kwantificeringskit</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK4824</td><td></td></tr><tr><td>Nucleïnezuur gel vlek</td><td>Invitrogen</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>Optima XE-90 ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>A94471</td><td></td></tr><tr><td>Poly(A) mRNA isolatiekit</td><td>Invitrogen</td><td>61011</td><td></td></tr><tr><td>Rec J exonuclease (10 U/μL)</td><td>Epicentre</td><td>RJ411250</td><td></td></tr><tr><td>Reverse transcriptase (200 U/μL)</td><td>Invitrogen</td><td>18080093</td><td>Geleverd met 5X first-strand buffer en 0,1 M DTT</td></tr><tr><td>RNA fragmentatie buffer</td><td>NEB</td><td>E6186A</td><td></td></tr><tr><td>RNase I (100 U/μL)</td><td>Invitrogen</td><td>AM2295</td><td></td></tr><tr><td>RNase inhibitor (20 U/μL)</td><td>Invitrogen</td><td>AM2696</td><td></td></tr><tr><td>Silicone rubber doppen</td><td>BioSpec Products</td><td>2008</td><td></td></tr><tr><td>ssDNA ligase (100 U/μL)</td><td>Epicentre</td><td>CL9021K</td><td>Geleverd met 10X CircLigase II buffer en 50 mM MnCl2</td></tr><tr><td>Roestvrijstalen microvialen, 1,8 mL</td><td>BioSpec Products</td><td>2007</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>RPI</td><td>S24060-5000.0</td><td></td></tr><tr><td>SW-41 Ti rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>Spuitpomp</td><td>New Era Pump Systems</td><td>NE-300</td><td></td></tr><tr><td>T4 polynucleotide kinase (10.000 U/mL)</td><td>NEB</td><td>M0201S</td><td>Geleverd met 10X T4 polynucleotide kinase buffer</td></tr><tr><td>T4 RNA ligase 2 getrunceerd KQ (200.000 U/mL)</td><td>NEB</td><td>M0373S</td><td>Geleverd met 10X T4 RNA ligase buffer en 50% PEG8000</td></tr><tr><td>Thermische cycler</td><td>Bio-Rad</td><td>1851148</td><td></td></tr><tr><td>Dunwandige polyallomer buizen, 13,2 mL</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>UV monitor</td><td>Bio-Rad</td><td>7318160</td><td></td></tr><tr><td>Saccharomyces cerevisiae stam BY4741</td><td>Open Biosystems</td><td>YSC1048</td><td></td></tr></tbody></table>

genoom-brede kwantificering van vertaling in de ontluikende gist door het ribosoom profilering

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Vertaling van mRNA in eiwitten is een complex proces waarbij verschillende lagen van de verordening. Er wordt vaak verondersteld dat wijzigingen in de transcriptie van mRNA in de eiwitsynthese wijzigingen, maar veel uitzonderingen zijn waargenomen. Onlangs, een techniek genaamd ribosoom profiling (of Ribo-Seq) heeft ontpopt als een krachtige methode waarmee identificatie, met een hoge nauwkeurigheid, welke regio's van mRNA worden omgezet in eiwitten en kwantificering van de vertaling op de genoom-brede niveau. Hier presenteren we een gegeneraliseerde protocol voor genoom-brede kwantificering van vertaling Ribo-Seq met ontluikende gist. Daarnaast kan Ribo-Seq gegevens combineren met mRNA overvloed metingen we tegelijkertijd kwantificeren vertaling efficiëntie van duizenden mRNA afschriften in hetzelfde monster en wijzigingen in deze parameters in reactie op experimentele vergelijken manipulaties of in verschillende fysiologische staten. Beschrijven we een gedetailleerd protocol voor generatie van ribosoom footprints nuclease spijsvertering, isolatie van intact ribosoom-voetafdruk complexen via sacharose kleurovergang fractionering en voorbereiding van DNA bibliotheken gebruiken voor het diepe rangschikken samen met passende kwaliteitscontroles nodig om ervoor te zorgen nauwkeurige analyse van in vivo vertaling.

Gedetailleerde pijpleidingen voor bioinformatic analyse van data profiling ribosoom geweest eerder 8,9beschreven. Verschillende onderzoeksgroepen hebben voorts bioinformatica tools voor differentiële gen expressie analyse en verwerking van gegevens van reeksnummers, die specifiek zijn voor ribosoom profilering methode 10,11,12 ,</su...

Translationeel verordening speelt een belangrijke rol in de controle van eiwitten overvloed. Hier beschrijven we een hoge gegevensdoorvoer methode voor de kwantitatieve analyse van vertaling in de ontluikende gist Saccharomyces cerevisiae.

Genoom-brede kwantificering van vertaling in de ontluikende gist door het ribosoom profilering

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Het algemene doel van deze procedure is om te identificeren welke regio's van mRNA worden omgezet in eiwitten, eiwittranslatie kwantitatief meten in knopsporigene gist Saccharomyces cerevisiae op genoombreed niveau. Ribosoomprofilering kan worden gebruikt om de snelheid van eiwitten en ziekten te volgen en om de mechanismen van translationele regulatie te bestuderen. Het grote voordeel van deze techniek is dat het een veel hogere gevoeligheid biedt in vergelijking met andere methoden, en van die, het meten van eiwitten en ziekten in vivo op een enkele contactresolutie.Hoewel dit protocol specifiek is voor knopsporigene gist, is het ook nuttig voor onderzoekers die ribosoomprofilering in andere modelsystemen proberen te vestigen, zoals zoogdiercellen en -weefsels. Extracten worden bereid uit gistcellen die zijn gekweekt tot midden log fase. Gebruik een glazen houder met filterassemblage om de cultuur te filteren door middel van 0,45 micromembrane filters.Schraap de pellet met de spatel, vries snel in vloeibare stikstof en bewaar bij min 80 graden Celsius. Plaats drie chroomstalen 3,2 millimeter kralen in een roestvrijstalen buis van 1,8 milliliter en koel de buis vooraf in vloeibare

genome-wide-quantification-translation-budding-yeast-ribosome

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Hier beschrijven we een werkwijze veranderingen in de initiatie van mRNA translatie van eukaryote cellen in reactie stresssituaties analyseren. Deze methode is gebaseerd op de snelheid scheiding op sucrosegradiënten vertalen ribosomen van niet-translating ribosomen.

Analyse van de translatie-initiatie tijdens stress Voorwaarden door polysome Profiling

Ribosomen spelen een centrale rol in de eiwitsynthese. Polyribosome (polysome) fractionering van sucrose dichtheidsgradiëntcentrifugatie maakt een directe bepaling van de vertaling efficiëntie van de individuele mRNA's op een genoom-brede schaal. Bovendien kan deze methode worden gebruikt voor biochemische analyse van de ribosoom-en-polysome geassocieerde factoren zoals chaperonnes en signaalmoleculen.

Polysome fractionering en analyse van zoogdieren Translatomes op een genoom-brede schaal

Het vermogen van cellen om zich aan stress aan te passen is cruciaal voor hun overleven. Regulatie van mRNA-translatie is een van deze aanpassingsstrategieën, die zorgt voor een snelle regulering van het proteoom. Hier bieden we een gestandaardiseerd polysoomprofileringsprotocol om specifieke mRNA's te identificeren die selectief worden getransleerd onder stressomstandigheden.

Beoordeling van Selectieve mRNA Vertaling in zoogdiercellen door polysoom Profiling

Dit manuscript beschrijft een methode om te visualiseren en te kwantificeren van gelokaliseerde vertaling gebeurtenissen in subcellular compartimenten. De in dit manuscript voorgestelde benadering is vereist van een basissysteem voor confocal beeldvorming en reagentia en snelle en kostenefficiënte.

Kwantitatieve immunofluorescentie te meten Global gelokaliseerd vertaling

Het protocol hier beschreven is gebaseerd op het genoom-brede kwantificeren van nieuw samengestelde mRNA gezuiverd van gistcellen aangeduid met 4-thiouracil. Deze methode maakt het mogelijk om het meten van de mRNA-synthese rekken van mRNA verval en biedt dus een nauwkeurige meting van RNA polymerase II transcriptie.

Saccharomyces cerevisiae Metabole labelen met 4-thiouracil en de kwantificering van gesynthetiseerd mRNA nieuw als een Proxy voor RNA Polymerase II activiteit

Hier beschrijven we de stadia van monsterverzameling en voorbereiding voor RIBO-seq bij bacteriën. Sequencing van de bibliotheken die volgens deze richtlijnen zijn opgesteld, resulteert in voldoende gegevens voor een uitgebreide bio-informatische analyse. Het protocol dat we presenteren is eenvoudig, maakt gebruik van standaard laboratoriumapparatuur en duurt zeven dagen van lysis tot het verkrijgen van bibliotheken.

RIBO-seq in Bacteria: een Sample Collection and Library Preparation Protocol voor NGS Sequencing

We presenteren een techniek om translationele (eiwitbiosynthese) complexen snel te stabiliseren met formaldehyde crosslinking in levende gist- en zoogdiercellen. De aanpak maakt het mogelijk om transiënte tussenproducten en dynamische RNA:eiwitinteracties te ontleden. De crosslinked complexen kunnen worden gebruikt in meerdere downstream-toepassingen, zoals in op diepe sequencing gebaseerde profileringsmethoden, microscopie en massaspectrometrie.

Snelle in vivo fixatie en isolatie van translationele complexen uit eukaryote cellen

Dit protocol beschrijft hoe u een polysoomprofiel kunt genereren zonder gebruik te maken van geautomatiseerde gradiëntmakers of gradiëntfractioneringssystemen.

Polysoomprofilering zonder gradiëntmakers of fractioneringssystemen

Co-translationele interacties spelen een cruciale rol bij ontluikende ketenaanpassingen, targeting-, vouw- en assemblagepaden. Hier beschrijven we Selective Ribosome Profiling, een methode voor in vivo, directe analyse van deze interacties in het model eukaryote Saccharomyces cerevisiae.

Wereldwijde identificatie van co-translationele interactienetwerken door selectieve ribosoomprofilering

Het vertalen van ribosomen decodeert drie nucleotiden per codon in peptiden. Hun beweging langs mRNA, vastgelegd door ribosoomprofilering, produceert de voetafdrukken die karakteristieke triplet periodiciteit vertonen. Dit protocol beschrijft hoe RiboCode te gebruiken om deze prominente functie te ontcijferen uit ribosoomprofileringsgegevens om actief vertaalde open leesframes op het niveau van het hele transcriptoom te identificeren.

De novo Identificatie van actief vertaalde open leesframes met ribosoomprofileringsgegevens

Leer ribosoomprofilering voor genoom-brede kwantificering van eiwittranslatie in Saccharomyces cerevisiae. Deze gevoelige methode helpt onderzoekers translatie-efficiëntie en regulatiemechanismen in vivo te bestuderen.

Genoom-brede kwantificering van vertaling in de ontluikende gist door het ribosoom profilering

Meer video's verkennen