Chromatografie-gebaseerde methoden voor biomolecuulzuivering
In de biochemie worden op chromatografie gebaseerde zuiveringsmethoden gebruikt om verbindingen uit een complex mengsel te isoleren. Twee van dergelij…
In de biochemie worden op chromatografie gebaseerde zuiveringsmethoden gebruikt om verbindingen uit een complex mengsel te isoleren. Twee van deze methoden die vaak door biochemici worden gebruikt, zijn grootte-exclusie chromatografie en affiniteitschromatografie. Bij grootte-exclusie chromatografie scheidt een kolom gevuld met poreuze kralen de componenten van een mengsel op basis van grootte. Aan de andere kant, maakt affiniteitschromatografie een meer specifieke scheiding van biomoleculen mogelijk door gebruik te maken van een kolom die bestaat uit een stationaire fase, die doelspecifieke liganden bevat.
Deze video dient als inleiding tot grootte-exclusie en affiniteitschromatografie, evenals de concepten die ze beheersen. Een stapsgewijze procedure voor de zuivering van een histidine-getagd eiwit door geïmmobiliseerde metaal-affiniteitschromatografie wordt beschreven. Toepassingen voor beide chromatografische methoden in biochemie en biomedisch onderzoek worden ook geprofileerd.
"Chromatografie" verwijst naar een breed scala aan methoden die worden gebruikt om een component uit een complex mengsel te isoleren, een essentiële stap voordat de eigenschappen en activiteiten van een biomolecuul kunnen worden bepaald. Elke chromatografische techniek heeft een ander scheidingsmechanisme, afhankelijk van de monstermatrix en het doelverbinding. Deze video richt zich op de principes en werking van twee methoden die in de biochemie gebruikelijk zijn: grootte-uitsluitings- en affiniteitschromatografie.
Grootte-uitsluitingschromatografie of SEC is gebaseerd op de grootte van de verbindingen in het monster. Een mobiele fase die het monster bevat, wordt toegevoegd aan een kolom met poreus materiaal: de stationaire fase. De moleculen in het monster vallen in 1 van 3 categorieën.
Moleculen die te groot zijn om de poriën binnen te gaan, reizen de kortste afstand door de kolom. Alle soorten met een molecuulgewicht boven deze "uitsluitingslimiet" verlaten de kolom tegelijkertijd. Moleculen die klein genoeg zijn om vrij in de poriën te komen, worden het langst vastgehouden en verlaten de kolom samen. Het molecuulgewicht dat volledige poriëntoegang mogelijk maakt, is de "permeatielimiet".
Alleen moleculen tussen deze grenzen worden van elkaar gescheiden, omdat ze verschillende tijdsduur doorbrengen met diffunderen in en uit de poriën. Kleinere moleculen worden langer in de kolom vastgehouden omdat ze meer tijd in de stationaire fase doorbrengen, terwijl grotere moleculen binnen deze grenzen eerder uitstromen.
Molecuulgewichten over 1 tot 2 ordes van grootte vallen binnen deze grenzen. Kolommen worden hiermee gekozen, of meerdere kolommen kunnen in serie worden gebruikt als er een breed scala aan gewenste verbindingen is.
Nu je de theorie van SEC hebt gezien, laten we eens kijken hoe het wordt uitgevoerd.
Om de SEC-procedure te starten, moet de kolom worden geëquilibreerd met gedeïoniseerd water en chromatografiebuffer. Eenmaal voorbereid, wordt buffer met het monster geïnjecteerd in de kolom. De buffer wordt vervolgens met een lage stroomsnelheid doorgedrukt. Een detector bewaakt wat de kolom verlaat om de aanwezigheid van de gewenste analyt te bepalen. Grote moleculen met molecuulgewichten boven de uitsluitingslimiet verlaten de kolom tegelijkertijd. Kleine fracties uit de kolom worden verzameld in buisjes. Elke fractie wordt getest op de kwaliteit van de doelmolecuul door middel van gelelektroforese of andere analytische technieken.
Laten we nu eens kijken naar affiniteitschromatografie of AC, een van de meest efficiënte manieren om eiwitten te zuiveren. Veel biomoleculen binden selectief aan bepaalde liganden - een eigenschap die AC benut door een doelspecifiek ligand aan de stationaire fase te hechten.
Wanneer het mengsel door de kolom stroomt, hechten de doelmoleculen zich aan de ligand en de rest stroomt door. Nadat het mengsel door de kolom is gepasseerd, kan het doelmolecuul worden verzameld via een van de twee elutiemethoden op basis van specificiteit.
Biospecifieke elutie kan worden gezegd een "normale-" of "omgekeerde rol" te hebben. In normale rol biospecifieke elutie, wordt een middel toegevoegd dat concurreert met het aangehechte ligand om te binden met de doelbiomolecuul.
In omgekeerde rol biospecifieke elutie, concurreert een middel met het doel om te binden aan het aangehechte ligand. De tweede elutietype, niet-specifieke elutie, verlaagt de binding tussen doel en ligand door de pH, ionische sterkte of polariteit van de oplossing te veranderen. Als een eiwit zich niet aan een ligand bindt die kan worden geïmmobiliseerd, kan het eiwit worden uitgedrukt met een "tag": korte peptidesequenties die zijn ontworpen om aan de ligand te binden.
Een variëteit is geïmmobiliseerde metaalionenaffiniteitschromatografie, "IMAC" voor kort, waarbij een aangehecht metaalliganden, zoals nikkel of kobalt, bindt aan histidineresiduen op het gemodificeerde eiwit. Door moleculaire biologietechnieken worden doelwitten gegenereerd met herhalende histidineresiduen, genoemd een polyhistidin-tag, die zich bindt aan het metaal via de imidazoolzijketen op histidine. Eenmaal gebonden, kan het eiwit worden verzameld met vrij imidazool via omgekeerde rol specifieke elutie en later worden gebruikt in een breed scala aan downstream-toepassingen. Nu je de theorie van affiniteitschromatografie hebt gezien, laten we eens kijken naar een IMAC-procedure in het laboratorium.
In IMAC kan de stationaire fase direct aan de mengsel van mobiele fase en monster worden toegevoegd, waardoor de binding van het his-getagde eiwit mogelijk is. Deze slurry wordt vervolgens in de kolom gegoten, waar de niet-gebonden verbindingen in afval druppelen, terwijl de slurry blijft. De slurry container wordt gespoeld om resterende hars en monster te verzamelen, die aan de kolom wordt toegevoegd.
Het hars wordt geroerd om ervoor te zorgen dat de niet-gebonden componenten vrij stromen. Toegevoegde wasbuffer helpt ze weg te spoelen. Zodra alle niet-gebonden componenten zijn verwijderd, wordt het afval vervangen door een container om het doelwiteiwit te verzamelen.
Buffer met imidazool wordt toegevoegd, geroerd en toegelaten om te rusten om het doelmolecuul los te maken. Het imidazool bindt zich aan het metaal, vervangt en geeft het getagde eiwit vrij. Het bevrijde eiwit wordt verzameld en de imidazoolstap wordt herhaald om een totale verzameling te garanderen. Om het monster verder te zuiveren, kan SEC worden uitgevoerd op het monster vóór analyse.
Nu we de theorie en procedure van deze twee technieken hebben gezien, laten we eens kijken naar enkele van de manieren waarop ze worden toegepast in het biochemische veld.
Een veelvoorkomende reden om eiwitten te zuiveren is om hun rol in ziekte te bestuderen. Cystische fibrose wordt veroorzaakt door defecten in het eiwit van de transmembraanconductantieregulator voor cystische fibrose, of CFTR. Na het kweken van het eiwit met een his-tag in gist, maken zowel affiniteits- als grootte-uitsluitingschromatografie de isolatie van het eiwit mogelijk, gevolgd door de studie van zijn functie.
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: How does size-exclusion chromatography separate molecules in a mixture?
Size-exclusion chromatography separates molecules based on their size using a column packed with porous material. Large molecules cannot enter the pores and exit first, while small molecules enter the pores and exit last. Only molecules between the exclusion and permeation limits are separated from one another as they spend varying amounts of time diffusing in and out of the pores.
Q2: What are the three molecular weight categories in size-exclusion chromatography?
Molecules fall into three categories: those above the exclusion limit that cannot enter pores and exit together first; those below the permeation limit that freely enter pores and exit together last; and those between these limits that separate based on varying retention times. Molecular weights across one to two orders of magnitude typically fall within the separation range.
Q3: How does affinity chromatography use ligands to purify target proteins?
Affinity chromatography attaches target-specific ligands to the stationary phase. When a mixture flows through the column, target molecules selectively bind to the ligands while other components pass through. The target protein is then collected through elution methods that either compete with the ligand or change solution conditions like pH or ionic strength.
Q4: What is a polyhistidine tag and how is it used in immobilized metal affinity chromatography?
A polyhistidine tag is a short peptide sequence of repeating histidine residues engineered onto target proteins. In immobilized metal affinity chromatography, these tags bind to adhered metal ligands like nickel or cobalt via the imidazole side chain on histidine. The tagged protein is then released using free imidazole via reverse-role specific elution.
Q5: What steps are involved in the immobilized metal affinity chromatography procedure?
The IMAC procedure involves adding the stationary phase directly to the sample mixture to allow his-tagged protein binding. The slurry is poured into a column where unbound compounds drain to waste. After washing to remove unbound components, imidazole buffer is added to release the target protein by competing with the metal ligand.
Q6: Why might researchers combine size-exclusion and affinity chromatography in protein purification?
Researchers combine these techniques to achieve higher purity levels. After affinity chromatography isolates the target protein using ligand binding, size-exclusion chromatography can further purify the sample by separating based on molecular size. This sequential approach is particularly useful when protein tags like polyhistidine may affect protein structure or function.
Q7: How is gel electrophoresis used to evaluate fractions collected from size-exclusion chromatography?
After fractions are collected from the size-exclusion column, gel electrophoresis and other analytical techniques are used to test the quality and identity of the target molecule in each fraction. This verification step ensures that the desired biomolecule has been successfully isolated and separated from other components in the mixture.