Functionele beeldvorming van virale transcriptie fabrieken met behulp van 3D fluorescentie microscopie
18 januari 2018
Virale transcriptionele fabrieken zijn discrete structuren die zijn verrijkt met cellulaire RNA polymerase II te verhogen van virale gen transcriptie tijdens reactivering. Hier, wordt een methode om te vinden sites van actief het transcriberen van virale chromatine in 3D-nucleaire ruimte door een combinatie van immunofluorescentie kleuring en in situ hybridisatie van RNA beschreven.
Het algemene doel van het combineren van nascent RNA-FISH met aminokleuring van virale latente eiwitten is om actieve transcriptie te visualiseren gekoppeld aan de vorming van virale transcriptie-fabriek. Deze methode kan worden gebruikt om sleutelvragen te helpen beantwoorden op het gebied van genetica, celbiologie, virologie en celbiologie virologie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een inducibel vireel mini-chromosoommodel gebruikt om de moleculaire details achter genomische architecturale veranderingen te bestuderen.
Verzamel cellen in een microcentrifugebuisje van 1,5 milliliter. Centrifugeer de cellen gedurende twee minuten bij 200 Volt zwaartekracht. Was de cellen drie keer met één milliliter steriele DEPC PBS.
Suspeneer vervolgens de cellen in 1,2 milliliter DEPC PBS. Plaats de dekglasjes in de bodem van een zes-wellplaat. Pipetteer 200 microliter van het cel-DEPC PBS-mengsel op elk dekglas.
Nadat de cellen twee minuten zijn bezonken, aspireer overtollig DEPC PBS, waardoor er slechts een dunne laag cellen overblijft. Voeg voorzichtig één milliliter fixeeroplossing toe aan elk dekglas. Laat de cellen 10 minuten fixeren.
Was de dekglasjes drie keer met DEPC PBS. Voeg na het wassen voorzichtig één milliliter glycine DEPC PBS toe tot een eindconcentratie van glycine van 100 millimolair aan elk dekglas. Laat de cellen vijf minuten quenchen.
Voeg 1,5 milliliter DEPC PBS toe en plaats op een shaker gedurende vijf minuten, en schud stevig maar voorzichtig in de hand gedurende één minuut. Aspireer het overtollige DEPC PBS en wees voorzichtig om de cellen niet te verstoren. Voeg voorzichtig één milliliter permeabiliseringsoplossing toe aan elk dekglas.
Laat de cellen 15 minuten permeabiliseren. Voeg 1,5 milliliter DEPC PBS toe. Plaats de cellen op een shaker gedurende vijf minuten, en schud stevig maar voorzichtig in de hand gedurende één minuut.
Aspireer het overtollige DEPC PBS en wees voorzichtig om de cellen niet te verstoren. Label de microscoopglazen en bevochtig een papieren handdoek en bekleed de bodem van een afsluitbare plastic container met de handdoek. Bereid vervolgens de primaire antilichaamoplossing voor en vermenigvuldig het recept voor elke aanwezige dekglas.
Plaats 30 microliter primaire antilichaamoplossing op elk gelabeld microscoopglas. Zorg ervoor dat de primaire antilichaamconcentratie correct is door de hoek van het dekglas vast te houden en voorzichtig te schudden. Bovendien kan de hoek van een tissue worden gebruikt om overtollige vocht af te voeren.
Plaats vervolgens het dekglas op de gelabelde microscoopglazen, zorg ervoor dat er geen luchtbellen ontstaan. Bedek de buitenkant van de container met plasticfolie. Plaats de container in een incubator ingesteld op 37 graden Celsius gedurende één uur.
Tijdens de incubatie bereidt u de benodigde reagentia voor. Na incubatie wast u de cellen drie keer met DEPC PBS in een zes-wellplaat gedurende vijf minuten per keer. Was vervolgens de cellen drie keer met FISH-wasbuffer gedurende vijf minuten per keer.
En houd het dekglas in FISH-wasbuffer totdat de secundaire antilichaam-, een intron-sondemengsel is voorbereid. Reinig vervolgens de glasplaatjes voor primaire antilichaam-incubatie voor hybridisatie met zeepwater. Nadat ze droog zijn, reinig ze met ethanol en een labdoekje.
Plaats 40 microliter van de secundaire antilichaam- en FISH-intron-sonde met oplossing op elk glasplaatje. Plaats de dekglasjes met de cellen op de glasplaatjes met de celzijde naar beneden op de buffer. En wees voorzichtig om geen luchtbellen te introduceren.
Plaats de glasplaatjes in een plastic container met een vochtige papieren handdoek op de bodem. Wikkel de plastic container eerst in plasticfolie en vervolgens in aluminiumfolie. En incubeer de container met de glasplaatjes.
Na incubatie verplaatst u voorzichtig het dekglas vanaf de rand van het glasplaatje en plaatst u het terug in zes-wellplaten, met de bovenkant naar boven. Was de cellen drie keer met FISH-wasbuffer in een zes-wellplaat gedurende vijf minuten per keer. Was vervolgens de cellen twee keer met tweevoudig SSC.
Voeg DAPI toe bij een concentratie van één op 1000 in de tweevoudige SSC en laat de oplossing vijf minuten staan op kamertemperatuur. Was de cellen twee keer met tweevoudig SSC. Reinig de glasplaatjes die voor hybridisatie zijn gebruikt en breng 10 microliter montageoplossing aan op de glasplaatjes.
Plaats de dekglasjes met de bovenkant naar beneden op de montageoplossing. Verwijder voorzichtig het overtollige montageoplossing met een laboratoriumdoekje, zorg ervoor dat de cellen niet worden verpletterd. Breng met nagellak een ruime laag aan rond de rand van de dekglasjes en laat de lak drogen.
De monster is nu klaar voor fluorescentiemicroscopie. BCBL-1-cellen werden gekleurd voor LANA en K-Rta RNA om te onderzoeken waar actief transcriberende virale episomen zijn en de heterogeniteit van de respons op Kaposi's Sarcoma-geassocieerd Herpesvirus, of KSHV reactivatiestimuli. De duidelijke K-Rta-fluorescentie in regio's die nauw overeenkomen met de distributie van virale episomen is bewijs voor actieve transcriptie die plaatsvindt dicht bij KSHV-genoom.
In hetzelfde monster kunnen cellen worden waargenomen die veel zwakkere en diffuse K-Rta-fluorescentie vertonen die niet significant overlapt met LANA, wat de aanzienlijke variatie en de mate van respons op reactivatiestimuli binnen een populatie cellen illustreert. Vervolgens werd de effectiviteit van thymidine-synchronisatie onderzocht door de expressie van vireel eiwit te visualiseren, wat duidelijk aantoonde dat gesynchroniseerde cellen meer reageerden op de reactivatiestimuli dan de ongesynchroniseerde populatie. DAPI-kleuring kan verschillende functies hebben, dit voorbeeld toont duidelijk dat er drie afzonderlijke cellen zijn in plaats van één.
3D-microscopie naast deze techniek onthulde ringvormige RNA PII-structuren die te zien zijn met KSHV-genoom gepunterd op de periferie. Met de ontwikkeling ervan zou het mini-virale chromosoom unieke hulpmiddelen
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een methode om actieve transcriptie in virale transcriptionele fabrieken te visualiseren met behulp van nascent RNA-FISH in combinatie met amino-kleuring van virale latente eiwitten. De techniek is erop gericht de moleculaire details achter genomische architecturale veranderingen tijdens virale reactivatie te verhelderen.
Belangrijkste Onderzoekscomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Virologie
- Celbiologie
- Genetica
Achtergrond
- Virale transcriptionele fabrieken verhogen de transcriptie van virale genen.
- Cellulair RNA-polymerase II is verrijkt in deze structuren.
- Het begrijpen van de transcriptionele activiteit is cruciaal voor virologisch onderzoek.
- Induceerbare virale mini-chromosoommodellen bieden inzicht in genomische veranderingen.
Doel van de studie
- Om actieve transcriptie te visualiseren in verband met de vorming van virale transcriptiefabrieken.
- Om kernvragen in de genetica en virologie te beantwoorden.
- Om moleculaire details van virale reactivatieprocessen te onderzoeken.
Gebruikte methoden
- Combinatie van nascente RNA-FISH en aminokleuring.
- Gebruik van een induceerbaar viraal minichromosoommodel.
- Technieken voor celverzameling en centrifugatie.
- Immunofluorescentiekleuring en in situ RNA-hybridisatie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisatie van actief transcriberend viraal chromatine.
- Identificatie van transcriptionele fabrieken in de 3D-nucleaire ruimte.
- Inzichten in de dynamiek van virale genexpressie tijdens reactivatie.
- Demonstratie van de toepasbaarheid van de methode in virologisch onderzoek.
Conclusies
- De methode biedt een krachtig instrument voor het bestuderen van virale transcriptie.
- Het vergroot het begrip van mechanismen achter virale reactivatie.
- Toekomstig onderzoek kan voortbouwen op deze bevindingen om de virale biologie verder te verkennen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie
Ruimtelijk opgeloste beeldvorming van virale transcriptiefabrieken met behulp van 3D-fluorescentiemicroscopie maakt directe visualisatie van actieve genexpressiegebeurtenissen binnen de nucleaire architectuur mogelijk. Deze mogelijkheid is cruciaal voor het wegnemen van onzekerheden bij mechanistische hypothesen over de regulatie van het virale genoom en ondersteunt het voorspellend vertrouwen bij de validatie van antivirale targets in een vroeg stadium. De benadering informeert portfoliobeslissingen door de ruimtelijke en temporele dynamiek van virale reactivatie op single-cell niveau te verduidelijken.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt directe visualisatie van actieve virale transcriptieplaatsen mogelijk voor functionele validatie van targets.
- Verduidelijkt de ruimtelijke relatie tussen virale episomen en transcriptionele activiteit, wat bijdraagt aan mechanistische risicoreductie.
- Ondersteunt hypothese-gestuurd onderzoek naar virale genregulatie tijdens reactivatie.
- Levert bewijs voor pathway-activatie en de biologische relevantie van kandidaat-targets.
Screening & Assayontwikkeling
- Stelt gevalideerde imaging-assays vast voor het kwantificeren van transcriptionele activiteit als reactie op perturbaties.
- Faciliteert reproduceerbare detectie van nascent RNA en eiwitmarkers in high-content screening-formaten.
- Maakt standaardisatie van read-outs mogelijk voor de evaluatie van verbindingen die gericht zijn op virale genexpressie.
- Ondersteunt schaalbaarheid en platformhergebruik voor gerelateerde virale systemen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Rijgt imaging-outputs uit met ziekterelevante modellen van virale reactivatie.
- Biedt continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door moleculaire gebeurtenissen te koppelen aan fenotypische resultaten.
- Maakt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling mogelijk op basis van ruimtelijke en temporele genexpressiegegevens.
- Ondersteunt de identificatie van translationele biomarkers voor de ontwikkeling van antivirale middelen.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze beeldgevingsmethode integreert in het continuüm van ontdekking naar preklinisch onderzoek door directe meting van de virale transcriptionele activiteit en nucleaire organisatie mogelijk te maken.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing op het gebied van virale genregulatie en de vorming van transcriptiefabrieken.
- Screening: Biedt kwantitatieve, reproduceerbare imaging-resultaten voor assayontwikkeling en compound-screening.
- Analytica: Levert ruimtelijk opgeloste metingen van nascent RNA en eiwitcolocalisatie voor vergelijkende analyse.
- Translationeel onderzoek: Verbindt moleculaire imaging-data aan ziekterelateerde modellen van virale reactivatie.
- Hergebruik op bedrijfsniveau: Biedt een herbruikbaar imaging-platform dat aanpasbaar is voor andere studies naar episomale of nucleaire genregulatie.
Operationele & Enterprise Impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in targetvalidatie en vermindert mechanistische ambiguïteit in virale genregulatie.
- Operationele waarde: Standardiseert imaging-workflows voor reproduceerbaarheid en schaalbaarheid over R&D-teams heen.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen door het verstrekken van hoogwaardige, kwantitatieve gegevens over virale transcriptiedynamiek.
- Impact op portfolio: Maakt risicogecorrigeerde prioritisering mogelijk van antivirale targets en mechanismen voor verdere ontwikkeling.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in geavanceerde fluorescentiemicroscopie en het ontwerp van moleculaire probes.
- Vereist toegang tot 3D-beeldvormingsinstrumentatie en infrastructuur voor beeldanalyse.
- Noodzaakt standaardisatie van kleuringsprotocollen en beeldvormingsparameters tussen teams.
- Aanpasbaar aan diverse virale en nucleaire modelsystemen mits er geschikte probes worden ontwikkeld.
- Afhankelijk van de geschiktheid van het celmodel en de probe-specificiteit voor een accurate interpretatie.
