Name: Ontwikkeling van een In Vitro Assay voor het kwantificeren van hematopoietische stamcellen en voorlopercellen cellen (HSPCs) bij de ontwikkeling van de zebravis embryo s (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Leer een in vitro methode om hematopoëtische stam- en voorlopercellen te kwantificeren in ontwikkelende zebravisembryo's. Deze techniek detecteert bloedafwijkingen en ondersteunt medicijnscreening effectief.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Financiering werd verstrekt door de National Institutes of Health (NIH: K01-DK087814-01A1 naar D.L.S.), de California State University Program voor onderwijs & onderzoek in de biotechnologie (CSUPERB: Moleculaire controle van de gewervelde hematopoietische Niche te D.L.S.) en vanuit het kantoor van de Graduate Studies in California State University Chico (op A.C.B.).

De institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) advisory board aan de California State University, Chico, keurt alle methoden die hieronder worden beschreven.
1. bleekmiddel 48 hpf Zebrafish embryo 's
<ol><li>Met 15 cm (w) x 15 cm (l) x 7 cm (h) plastic verpakkingen maken 3 wassen stations: 1) met 1 mL 5% bleekwater in 1000 mL embryo medium (E3; Zie tabel 1), 2) steriele E3 en 3) met steriele E3. Zorg ervoor dat elke container 500 mL oplossing te dompelen de embryo's. Opmerking: Voor elke voorwaarde getest, ten minste 10 embryo's nodig zullen zijn. Deze procedure wassen is geschikt voor maximaal 200 embryo's.</li>
	<li>Pipetteer overdracht plaats van embryo's in een theezeefje en dompelen eieren in wash station #1 voor 5 min. de Theezeef (met embryo's binnen) verwijderen en plaatsen in de wash station #2 voor 5 min; Herhaal voor het wassen station #3 voor een laatste 5 min.</li>
	<li>Na de laatste wash, rinse embryo's uit Theezeef door draaien ondersteboven over een schone 10 cm petrischaal en voorzichtig spoelen embryo's off de Theezeef met steriele E3 en een overdracht pipet.</li>
</ol>2. Dechorionate embryo 's
<ol><li>Pipetteer overdracht verwijderen en weggooien zoveel E3 mogelijk van de petrischaal en voeg 500 μL van dechorionation protease (10 mg/mL) toe aan embryo's. Incubeer bij kamertemperatuur voor 5 min. zachtjes Tik op de kant van de petrischaal om chorions volledig te verwijderen.</li>
	<li>Voeg 20 mL steriele E3 om te verdunnen protease serologische Pipetteer. Toestaan dat embryo's te regelen en de E3 met een pipet overdracht verwijderen. Herhaal deze wassen stap 3 keer om alle sporen van het dechorionation protease te verwijderen.</li>
</ol>3. voorbereiding van de monsters van de Embryo
<ol><li>Plaats met een pipet P1000 10 embryo's in een enkele steriele 1,5 mL microcentrifuge buis.</li>
	<li>E3 verwijderen met een pipet en gooi deze weg. Let op: Pipetteer met zorg als embryo's kunnen gemakkelijk worden verplaatst en verwijderd tijdens het wassen volgt.</li>
</ol>4. voorbereiding van embryo's voor dissociatie
<ol><li>Overdracht van monsters naar laminaire flow hood, en wassen van embryo's door toevoeging van 1 mL steriele E3. Toestaan dat embryo's te regelen naar onderkant van de buis en verwijder de bovendrijvende vloeistof met een pipet P1000. Herhaal dit voor een totaal van 3 wasbeurten.</li>
	<li>Na de laatste wasbeurt, verwijderen van E3 en gooi deze weg. Voeg 1 mL 10 mM dithiothreitol (DTT) in E3 te verwijderen van de slijm coating (en eventuele sporen, gist of bacteriën die kunnen worden onderschept in het) rondom de embryonale zebrafish. Microcentrifuge buis horizontaal leggen en incuberen bij kamertemperatuur laminaire flow Hood gedurende 25 minuten.</li>
</ol>5. embryo dissociatie
<ol><li>Wassen monster 3 keer met 1 mL steriele DPBS (met Ca2 + en Mg2 +). Na de laatste wasbeurt 500 μL van DPBS (met Ca2 + en Mg2 +) en voeg toe 5 μL van 5 mg/mL (26 U/mL) dissociatie protease. Let op: Dit enzym moet Ca2 + en Mg2 +, dus zorg ervoor dat de DPBS bevat deze ionen.</li>
	<li>Incubeer monsters bij 37 ° C op een horizontale roteerschudapparaat op 180 rpm voor 60 min. plaats monsters in de laminaire flow kap en triturate van embryo's met een P1000 tot monsters zijn volledig losgekoppeld. Let op: Controleer embryo's periodiek om te bepalen wanneer ze worden losgekoppeld. De oplossing van het embryo moet één of andere hoeveelheid weefsel aanwezig is; het mag geen volledig homogeen. Het is mogelijk om overmatige digest, die de HSPCs vernietigen zal (Zie aanvullende figuur 1).</li>
</ol>6. bereiding van gedissocieerde embryo 's
<ol><li>Pipetteer de 10 losgekoppeld embryo's op het bovenste reservoir van een 5 mL-polystyreen ronde onderkant buis met een 35 μm cel zeef cap.</li>
	<li>Met een pipet, spoel de Petri-buis met steriel PBS (met geen Ca2 + of Mg2 +) en overdracht oplossing naar 5 mL polystyreen buis bevattende gefilterd cellen uit stap 6.1. Herhaal de 4 mL vloeistof in de polystyreen tube van 5 mL aanwezig is. Opmerking: PBS, DPBS, of andere isotone gebufferde oplossingen kunnen worden gebruikt in dit stadium, zolang ze geen Ca2 + of Mg2 bevatten +
</li>
	<li>Centrifugeer buizen bij 4 ° C en 300 x g gedurende 5 minuten aan het gehomogeniseerde cel monster pellet. Met een pipet, verwijder en weggeworpen uit de ronde onderkant-buis. Zorg voor de cellen Ingehuld aan de onderkant van de buis niet te verstoren. Resuspendeer de cellen in 100 μl van PBS.</li>
</ol>7. bereiding van Methylcellulose
<ol><li>1 x volledige methylcellulose (tabel 1) stockoplossing genereren en toevoegen van 2.5 mL steriel ronde onderkant 14 mL buizen met 3 mL spuiten en naalden 16 G. Gebruik één tube voor elke voorwaarde getest.</li>
	<li>
Het toevoegen van cytokines, kleine moleculen of andere agenten aan elk monster worden onderzocht.
	<ol>
<li>Toevoegen voor myeloïde differentiatie, 1% Carp serum en 0,3 mg/mL recombinante zebrafish granulocyt kolonie stimulerende factor (Gcsf),34 tot en met methylcellulose medium. Zie Svoboda et al. 37 voor volledige beschrijving op hoe te genereren van karper serum en recombinant cytokines.</li>
		<li>Toevoegen voor differentiatie van de erythroid, 1% Carp serum en 0,1 mg/mL zebrafish recombinante erytropoëtine (Epo)38 naar methylcellulose medium.</li>
		<li>Toevoegen om te onderzoeken multilineage progenitorcellen, EPB en Gcsf. Let op: Cytokines en additieven moeten niet in totaal meer dan 10% van het totale volume, zoals het medium niet zal viskeuze genoeg te onderscheiden van afzonderlijke kolonies.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. toevoeging van gedissocieerde embryo's Methylcellulose
<ol><li>Met behulp van een precisiepipet, voeg 100 μl van de gedissocieerde 10 embryo's op het oppervlak van de bereid methylcellulose met recombinant cytokines en karper serum. GLB deksel en vortex zachtjes aan volledig Meng monster. Elke buis moet nu het gedissocieerde weefsel van 10 embryo's bevatten.</li>
	<li>Gebruik 3 mL spuiten en 16 G naalden, aliquoot 1 mL van het monster af in 2 aparte 35 mm petrischalen. Zorg ervoor dat het monster volledig is verspreid over de petrischaal. Herhaal voor elk monster.</li>
	<li>35 mm petrischaaltjes met cellen in methylcellulose in een 15 cm petrischaal plaatsen. Toevoegen aan elke 15 cm schotel, een 35 mm Petri plaat met 5 mL steriel water aan de humidify van de monsters. Incubeer bij 32 ° C en 5% CO2 gedurende 7-10 dagen.</li>
</ol>9. visualisatie van HSPC afkomstige kolonievormende eenheden (CFUs)
<ol><li>Na 7 dagen aan het broeden, Leg monsters op een omgekeerde Microscoop op 40-100 X voor visualisatie en opsomming. Op dit punt, kunnen afzonderlijke kolonies worden geïsoleerd met een pipet en onderworpen aan vlekken en/of gene analyse.</li>
</ol>

<ol><li>Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+clonogenic+common+lymphoid+progenitors+in+mouse+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow.</a> Cell. 91, 661-672 (1997).</li>
<li>Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clonogenic+common+myeloid+progenitor+that+gives+rise+to+all+myeloid+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages.</a> Nature. 404, 193-197 (2000).</li>
<li>Bertrand, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haematopoietic+stem+cells+derive+directly+from+aortic+endothelium+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development.</a> Nature. 464, 108-111 (2010).</li>
<li>Kissa, K., Herbomel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+stem+cells+emerge+from+aortic+endothelium+by+a+novel+type+of+cell+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Blood stem cells emerge from aortic endothelium by a novel type of cell transition.</a> Nature. 464, 112-115 (2010).</li>
<li>Bertrand, J. Y., Kim, A. D., Teng, S., Traver, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD41%2B+cmyb%2B+precursors+colonize+the+zebrafish+pronephros+by+a+novel+migration+route+to+initiate+adult+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">CD41+ cmyb+ precursors colonize the zebrafish pronephros by a novel migration route to initiate adult hematopoiesis.</a> Development. 135, 1853-1862 (2008).</li>
<li>Bertrand, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definitive+hematopoiesis+initiates+through+a+committed+erythromyeloid+progenitor+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Definitive hematopoiesis initiates through a committed erythromyeloid progenitor in the zebrafish embryo.</a> Development. 134, 4147-4156 (2007).</li>
<li>Ma, D., Zhang, J., Lin, H. F., Italiano, J., Handin, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+identification+and+characterization+of+zebrafish+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The identification and characterization of zebrafish hematopoietic stem cells.</a> Blood. 118, 289-297 (2011).</li>
<li>Lam, E. Y., Hall, C. J., Crosier, P. S., Crosier, K. E., Flores, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+Runx1+expression+in+the+dorsal+aorta+tracks+the+emergence+of+blood+progenitors+from+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Live imaging of Runx1 expression in the dorsal aorta tracks the emergence of blood progenitors from endothelial cells.</a> Blood. 116, 909-914 (2010).</li>
<li>Lam, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+runx1+promoter-EGFP+transgenics+mark+discrete+sites+of+definitive+blood+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Zebrafish runx1 promoter-EGFP transgenics mark discrete sites of definitive blood progenitors.</a> Blood. 113, 1241-1249 (2009).</li>
<li>Lin, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+thrombocyte+development+in+CD41-GFP+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish.</a> Blood. 106, 3803-3810 (2005).</li>
<li>Driever, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+screen+for+mutations+affecting+embryogenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish.</a> Development. 123, 37-46 (1996).</li>
<li>Weinstein, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+mutations+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic mutations in the zebrafish.</a> Development. 123, 303-309 (1996).</li>
<li>Ransom, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+zebrafish+mutants+with+defects+in+embryonic+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Characterization of zebrafish mutants with defects in embryonic hematopoiesis.</a> Development. 123, 311-319 (1996).</li>
<li>Amsterdam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large-scale+insertional+mutagenesis+screen+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A large-scale insertional mutagenesis screen in zebrafish.</a> Genes Dev. 13, 2713-2724 (1999).</li>
<li>Gaiano, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertional+mutagenesis+and+rapid+cloning+of+essential+genes+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Insertional mutagenesis and rapid cloning of essential genes in zebrafish.</a> Nature. 383, 829-832 (1996).</li>
<li>Yeh, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovering+chemical+modifiers+of+oncogene-regulated+hematopoietic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Discovering chemical modifiers of oncogene-regulated hematopoietic differentiation.</a> Nat Chem Biol. 5, 236-243 (2009).</li>
<li>Paik, E. J., de Jong, J. L., Pugach, E., Opara, P., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+genetic+screen+in+zebrafish+for+pathways+interacting+with+cdx4+in+primitive+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">A chemical genetic screen in zebrafish for pathways interacting with cdx4 in primitive hematopoiesis.</a> Zebrafish. 7, 61-68 (2010).</li>
<li>Ridges, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+screen+identifies+novel+compound+with+selective+toxicity+against+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Zebrafish screen identifies novel compound with selective toxicity against leukemia.</a> Blood. 119, 5621-5631 (2012).</li>
<li>North, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostaglandin+E2+regulates+vertebrate+haematopoietic+stem+cell+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis.</a> Nature. 447, 1007-1011 (2007).</li>
<li>Astuti, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Functional+Bioluminescent+Zebrafish+Screen+for+Enhancing+Hematopoietic+Cell+Homing%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A Functional Bioluminescent Zebrafish Screen for Enhancing Hematopoietic Cell Homing.</a> Stem Cell Reports. 8, 177-190 (2017).</li>
<li>Kiel, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLAM+family+receptors+distinguish+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+and+reveal+endothelial+niches+for+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells.</a> Cell. 121, 1109-1121 (2005).</li>
<li>Spangrude, G. J., Heimfeld, S., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+mouse+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of mouse hematopoietic stem cells.</a> Science. 241, 58-62 (1988).</li>
<li>Morrison, S. J., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+long-term+repopulating+subset+of+hematopoietic+stem+cells+is+deterministic+and+isolatable+by+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The long-term repopulating subset of hematopoietic stem cells is deterministic and isolatable by phenotype.</a> Immunity. 1, 661-673 (1994).</li>
<li>Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+lymphohematopoietic+reconstitution+by+a+single+CD34-low%2Fnegative+hematopoietic+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell.</a> Science. 273, 242-245 (1996).</li>
<li>Goodell, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dye+efflux+studies+suggest+that+hematopoietic+stem+cells+expressing+low+or+undetectable+levels+of+CD34+antigen+exist+in+multiple+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Dye efflux studies suggest that hematopoietic stem cells expressing low or undetectable levels of CD34 antigen exist in multiple species.</a> Nat Med. 3, 1337-1345 (1997).</li>
<li>Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+functional+properties+of+murine+hematopoietic+stem+cells+that+are+replicating+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo.</a> J Exp Med. 183, 1797-1806 (1996).</li>
<li>Gansner, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sorting+zebrafish+thrombocyte+lineage+cells+with+a+Cd41+monoclonal+antibody+enriches+hematopoietic+stem+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Sorting zebrafish thrombocyte lineage cells with a Cd41 monoclonal antibody enriches hematopoietic stem cell activity.</a> Blood. 129, 1394-1397 (2017).</li>
<li>Smith, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+cell+transplantation+establishes+that+tumor-initiating+cells+are+abundant+in+zebrafish+T-cell+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">High-throughput cell transplantation establishes that tumor-initiating cells are abundant in zebrafish T-cell acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 115, 3296-3303 (2010).</li>
<li>Mizgirev, I., Revskoy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+clonal+zebrafish+lines+and+transplantable+hepatic+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of clonal zebrafish lines and transplantable hepatic tumors.</a> Nat Protoc. 5, 383-394 (2010).</li>
<li>de Jong, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+immune-matched+hematopoietic+transplantation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Characterization of immune-matched hematopoietic transplantation in zebrafish.</a> Blood. 117, 4234-4242 (2011).</li>
<li>Wolf, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+Caudal+Haematopoietic+Embryonic+Stromal+Tissue+%28CHEST%29+Cells+Support+Haematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Zebrafish Caudal Haematopoietic Embryonic Stromal Tissue (CHEST) Cells Support Haematopoiesis.</a> Sci Rep. 7, 44644(2017).</li>
<li>Campbell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+embryonic+stromal+trunk+%28ZEST%29+cells+support+hematopoietic+stem+and+progenitor+cell+%28HSPC%29+proliferation%2C+survival%2C+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish embryonic stromal trunk (ZEST) cells support hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) proliferation, survival, and differentiation.</a> Exp Hematol. 43, 1047-1061 (2015).</li>
<li>Svoboda, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+vertebrate+hematopoiesis+using+zebrafish+thrombopoietin%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Dissection of vertebrate hematopoiesis using zebrafish thrombopoietin.</a> Blood. 124, 220-228 (2014).</li>
<li>Stachura, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+granulocyte+colony-stimulating+factors+%28Gcsfs%29%3A+2+paralogous+cytokines+and+their+roles+in+hematopoietic+development+and+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The zebrafish granulocyte colony-stimulating factors (Gcsfs): 2 paralogous cytokines and their roles in hematopoietic development and maintenance.</a> Blood. 122, 3918-3928 (2013).</li>
<li>Stachura, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+analysis+of+hematopoietic+progenitor+cells+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Clonal analysis of hematopoietic progenitor cells in the zebrafish.</a> Blood. 118, 1274-1282 (2011).</li>
<li>Stachura, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+kidney+stromal+cell+lines+support+multilineage+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Zebrafish kidney stromal cell lines support multilineage hematopoiesis.</a> Blood. 114, 279-289 (2009).</li>
<li>Svoboda, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+tools+for+the+clonal+analysis+of+zebrafish+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Ex vivo tools for the clonal analysis of zebrafish hematopoiesis.</a> Nat Protoc. 11, 1007-1020 (2016).</li>
<li>Paffett-Lugassy, N., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17579187">Functional conservation of erythropoietin signaling in zebrafish.</a> Blood. 110, 2718-2726 (2007).</li>
<li>Stachura, D. L., Traver, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+dissection+of+zebrafish+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cellular dissection of zebrafish hematopoiesis.</a> Methods Cell Biol. 133, 11-53 (2016).</li>
<li>Traver, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+and+in+vivo+imaging+of+multilineage+engraftment+in+zebrafish+bloodless+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants.</a> Nat Immunol. 4, 1238-1246 (2003).</li>
<li>Kobayashi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+localization+of+side+population+%28SP%29+cells+in+zebrafish+kidney+hematopoietic+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Characterization and localization of side population (SP) cells in zebrafish kidney hematopoietic tissue.</a> Blood. 111, 1131-1137 (2008).</li>
<li>Henninger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+fate+mapping+quantifies+the+number+of+haematopoietic+stem+cells+that+arise+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Clonal fate mapping quantifies the number of haematopoietic stem cells that arise during development.</a> Nat Cell Biol. 19, 17-27 (2017).</li>
<li>Tamplin, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+arrival+triggers+dynamic+remodeling+of+the+perivascular+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell arrival triggers dynamic remodeling of the perivascular niche.</a> Cell. 160, 241-252 (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De zebravis modelsysteem is een efficiënte, effectieve en goedkope model voor het bestuderen van primitieve en definitieve gewervelde Haematopoiese geworden. Generatie van tests die zijn snel, goedkoop, en enkele technische moeilijkheden opleveren kan worden gebruikt voor het testen van kleine molecules, analyseren van mutant embryo's en het ophelderen van de moleculaire pathways belangrijk voor HSPC biologie. In vitro beplating van HSPCs van volwassen zebrafish is een effectieve methode om te studeren mutagenes...

Haematopoiese is het proces van het maken van de veelheid van rijpe bloedcellen die nodig is voor de overleving van een organisme. Het is een belangrijke developmental proces waarbij de differentiatie van hematopoietische stamcellen (HSCs) in een verscheidenheid van verstandelijk beperkte celtypes waaruit volwassen bloed. Deze HSCs moeten zelf vernieuwen zodat het systeem nooit uitgeput is en ze van vroege embryonale ontwikkeling tot dood aanhouden moeten. In gewervelde dieren, constante differentiatie en proliferatie van hematopoietische stamcellen en voorlopercellen cellen (HSPCs) zijn nodig voor voldoende vullen de meerderheid van de bloedcellen die post mitotische zijn en elke dag worden gerecycled. HSCs genereren volwassen bloedcellen door de eerste differentiëren in subsets van beperkte voorlopercellen; gemeenschappelijke lymfoïde progenitoren (CLPs)1, die uiteindelijk produceren T, B en NK-cellen, en gemeenschappelijke myeloïde voorlopercellen (CMPs)2 die het genereren van Granulocyten, erytrocyten, macrofagen en megakaryocytes. Deze progenitoren zich inzetten voor het genereren van specifieke cel geslachten, en verder onderscheiden in meer verstandelijk beperkte voorlopercellen zoals myeloïde erythroid progenitoren (Europarlementariërs) die het genereren van erytrocyten en bloedplaatjes of granulocyt macrophage progenitoren (GGP's) die het genereren van basofielen, eosinofielen, neutrofielen en macrofagen2. Identificeren en het isoleren van deze progenitoren maakt de identificatie van belangrijke moleculaire pathways betrokken bij hematopoietische differentiatie en vele hematopoietische ziekten zoals leukemie ontstaan bij deze voorlopercellen niet goed onderscheiden.
In de afgelopen decennia, is het systeem van zebravissen (Danio rerio) model een belangrijke onderzoeksinstrument voor embryonale en volwassen hematopoietische studies geworden. Zebravis zijn vatbaar voor genetische analyse en de fylogenetisch laagste gewervelde model soorten die een vergelijkbare therapieën en hematopoietische systeem voor de mens hebben. Zebravis embryo's ontwikkelen ex utero, en binnen 48 uur bericht genereren bevruchting (hpf) HSPCs3,4,5,6,7,8. Zebravis zijn ook zeer vruchtbare, met vrouwtjes leggen over 100 eieren in een interne koppeling, waardoor voor grote steekproeven en experimentele replicatie. Zebravis embryo's zijn optisch transparant, waardoor voor microscopische visualisatie van het hematopoietische systeem. Enkele fluorescerende transgene coderegels zebrafish markering HSCs zoals runx1: EGFP vissen9, cd41: EGFP vissen10, en kdrl:mCherry; cmyb: GFP3 dubbel-positieve dieren, voorzien van live, real-time visualisatie van HSC ontstaan en de uitbreiding in vivo3,4,7,8, 9. Van de zebravis snelle generatie tijd en ontwikkeling ex utero heeft geleid tot het gebruik ervan in de mutagenese studies11,12,13,14,15 en drug screening16,17,18,19,20 voor verbindingen die houden van therapeutische belofte voor menselijk bloed stoornissen. Globaal, instandhouding van het hematopoietische systeem, de aanwezigheid en eenvoudige ontwikkeling van transgene lijnen en snelle regeneratietijd geboekt de zebravis een goedkoop, snel, flexibel en ideaal model voor hematopoietische studies.
Tal van methoden van isoleren en testen van HSCs zijn in zoogdieren hematopoietische systemen ontwikkeld. Onderzoekers kunnen gebruik maken van een combinatie van cel oppervlakte receptoren aan mark van HSCs21,22,23,24, evenals het benutten van het vermogen van HSCs om efflux kleurstof25,26. Nadat ze zijn aangeduid, kan fluorescentie-activated cell sorting (FACS) hun fysieke scheiding. Waaruit blijkt dat een cel een HSC is vereist het bestralen van een dier van de gastheer te vernietigen van endogene HSPCs, overplanten van vermeende HSCs, en op lange termijn, multi lineage reconstitutie van alle oudere bloed celtypes observeren. Deze testen werken goed in muizen, want er zijn talrijke celoppervlak antilichamen tegen hematopoietische cellen en muis ingeteelde stammen die vergemakkelijken immuun matching voor transplantatie. Echter, zijn paar zebrafish hematopoietische celoppervlak antilichamen gegenereerde27, belemmeren de identificatie en de isolatie van de HSCs. De meest gebruikelijke manier om te markeren en te isoleren van de zebravis HSCs is met transgene dieren, waarbij een reeks van cel-specifieke promotor is het besturen van een fluorescerende eiwit expressie. Studies hebben gevisualiseerd en HSCs in de ventrale muur van de dorsale aorta opgesomd met microscopie met behulp van deze techniek3,4,8,9. Andere laboratoria hebben gegenereerd klonale stammen van zebravis28,29 en succesvolle transplantaties in MHC-matched dieren30hebben uitgevoerd. Echter deze technieken worden kosten onbetaalbaar met veel laboratoria zijn technisch gezien moeilijk en tijdrovend zijn. Om deze kwesties te behandelen, hebben laboratoria gegenereerd verscheidene in vitro testen om te testen voor de aanwezigheid, de proliferatie-tarieven en de capaciteit van de differentiatie van HSPCs31,32,33, 34,35,,36. Deze onderzoeken tonen de proliferatie en differentiatie van HSPCs in vitro31,32,33,34,35,,36, de redding van hematopoietische gebreken36, en een efficiënte methode voor het ontdekken en testen van cytokines33,34,35. Ze hebben ook gebruikt ter identificatie van genen die verantwoordelijk zijn voor31,32van de biologie van de HSPC. In deze studie nemen wij deze testen een stap verder, waardoor de kwantificatie van HSPCs in een zich ontwikkelende zebrafish embryo. Deze testen kunnen ook worden gebruikt om het kwantificeren van het aantal HSPCs in mutant dieren en dieren behandeld met hematopoietische-ontwrichtende drugs. Kortom, deze tests zijn snel, huidige enkele technische uitdagingen, en goedkope manieren om te kwantificeren HSPC nummers, hun verspreiding te onderzoeken en onderzoeken van blokken in differentiatie.

<table><tbody><tr><td>10% Bovine Serum Albumin in Iscove's MDM</td><td>StemCell Technologies&nbsp;</td><td>9300</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (10x) with Calcium2+ and Magnesium2+</td><td>Life Technologies</td><td>14080-055</td><td></td></tr><tr><td>HyClone PBS (1x)</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>sh30256.01</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;DMEM 500 mL</td><td>Corning CellGrow</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;Ham's F12 500 mL</td><td>Corning CellGrow</td><td>10-080-CV</td><td></td></tr><tr><td>FBS 500 mL</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>100-108</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 100 mL (1 M)</td><td>Gibco life technologies</td><td>15-630-080</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin (5000 U/mL en 5000 mg/mL) met L-Glutamine (200 mM)</td><td>Corning Mediatech</td><td>30-009-CI</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin Sulfaat 10 mL (50 mg/mL)</td><td>Corning Mediatech</td><td>30-005-CR</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL MCF tube</td><td>FisherBrand</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>3 mL 23gx1 injectienaald met Luer-lock</td><td>BD Safety Glide</td><td>305905</td><td></td></tr><tr><td>5 mL polystyreen ronde bodembuis met celfilterdop</td><td>Corning Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Methocel MC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>64630</td><td></td></tr><tr><td>14 mL Polystyreen ronde bodembuis</td><td>Corning Falcon</td><td>352057</td><td></td></tr><tr><td>10 mm polystyreen easygrip Petri-schaal</td><td>Corning Falcon</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Librease TM</td><td>Roche Sigma-Aldrich</td><td>5401119001</td><td>dissociatie-protease</td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Roche Sigma-Aldrich</td><td>11459643001</td><td>dechorionering-protease</td></tr><tr><td>15 cm Petri-schaal</td><td>Corning Falcon</td><td>351058</td><td></td></tr><tr><td>AB</td><td>Zebrafish International Resource Center (ZIRC)</td><td>ZL1</td><td>zebravissoort gebruikt</td></tr><tr><td>Dithiolthreitol (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>646563</td><td></td></tr></tbody></table>

ontwikkeling van een in vitro assay voor het kwantificeren van hematopoietische stamcellen en voorlopercellen cellen (hspcs) bij de ontwikkeling van de zebravis embryo 's

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos

Haematopoiese is een essentiële cellulaire proces waarin onderscheid hematopoietische stamcellen en voorlopercellen cellen (HSPCs) in de veelheid van andere cel lineages waaruit volwassen bloed. Isolatie en identificatie van deze HSPCs is moeilijk, omdat ze zijn gedefinieerde ex post facto; zij kunnen pas worden gedefinieerd nadat hun differentiatie in bepaalde cel geslachten. In de afgelopen decennia, is de zebravissen (Danio rerio) een model-organisme om te studeren van Haematopoiese geworden. Zebravis embryo's ontwikkelen ex utero, en door 48 h na bevruchting (hpf) hebben gegenereerd definitieve HSPCs. testen om te beoordelen HSPC differentiatie en proliferatie vermogens hebben ontwikkeld, gebruik makend van transplantatie en de daaropvolgende reconstructie van het hematopoietische systeem naast het visualiseren van gespecialiseerde transgene lijnen met confocale microscopie. Deze tests zijn echter kosten onbetaalbaar, technisch gezien moeilijk en tijdrovend voor veel laboratoria. Ontwikkeling van een in vitro model te beoordelen van de HSPCs zou rendabele, sneller, en huidige minder problemen in vergelijking met de eerder beschreven methoden, waardoor laboratoria te snel beoordelen mutagenese en drug schermen die invloed hebben op HSPC biologie. Deze roman in vitro assay voor het beoordelen van de HSPCs wordt uitgevoerd door de beplating los gezien hele zebrafish embryo's en toevoegen exogene factoren die alleen HSPC differentiatie en proliferatie te bevorderen. Embryo's worden losgekoppeld in afzonderlijke cellen en verguld met HSPC-ondersteunend kolonie stimulerende factoren die ervoor zorgen ze dat voor het genereren van de kolonie vormende eenheden (CFUs) die uit een enkele progenitor cel voortvloeien. Deze testen zou meer zorgvuldig onderzoek van de moleculaire pathways verantwoordelijk voor HSPC proliferatie, differentiatie, en verordening, waarmee onderzoekers te begrijpen van de onderbouwing van gewervelde Haematopoiese en de disregulatie tijdens ziekte.

Om te beoordelen HSPC getallen in embryonale zebrafish, waren 48 hpf embryo's verteerd, verguld in methylcellulose met exogene hematopoietische-ondersteunend groeifactoren en gedurende 7 dagen (Figuur 1A) geïncubeerd. Na 7 dagen werden de kolonie vormende eenheden (CFUs) opgesomde (Figuur 1B) en verbeelde (Figuur 1C). Door het beheersen van de versch...

Hier presenteren we een eenvoudige methode om te kwantificeren van hematopoietische stamcellen en voorlopercellen cellen (HSPCs) in embryonale zebrafish. HSPCs van gedissocieerde zebrafish zijn verguld in methylcellulose met ondersteunende factoren, differentiëren in volwassen bloed. Hierdoor kan de detectie van bloed gebreken en kunt drug screening om te gemakkelijk worden uitgevoerd.

Ontwikkeling van een In Vitro Assay voor het kwantificeren van hematopoietische stamcellen en voorlopercellen cellen (HSPCs) bij de ontwikkeling van de zebravis embryo 's

Hematopoiesis is an essential cellular process in which hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) differentiate into the multitude of different cell ...

Het algemene doel van deze test is om de differentiatie van hematopoëtische voorlopercellen in het zich ontwikkelende zebravisembryo te tellen en te onderzoeken. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van enkele zeer belangrijke vragen op het gebied van hematopoëse, zoals hoeveel stam- en voorlopercellen er eigenlijk in een zich ontwikkelende zebravis zijn. Het grote voordeel van deze techniek is dat het snel is, relatief goedkoop en gemakkelijk uit te voeren.Hoewel deze methode inzicht kan geven in het aantal voorlopers in de zich ontwikkelende zebravis, stelt het onderzoekers ook in staat om het functionele effect van een medicijn of genetische mutatie op de vorming van bloedvoorlopers te meten. We kwamen op het idee voor deze methode toen we genen uitschakelden die volgens ons cruciaal waren voor de bloedvorming. We voorspelden dat we met deze test het verschil zouden kunnen meten tussen normaal ontwikkelende embryo's en degenen die morphanten waren.Gebruik plastic containers om drie wasstations te maken om zebravisembryo's te bleken, waarbij er één station is met één milliliter vijf procent bleekmiddel per liter E3 en twee stations met steriel E3. Plaats embryo's met een

development-an-vitro-assay-to-quantitate-hematopoietic-stem

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Wij rapporteren de ontwikkeling van een systeem voor geautomatiseerde beeldvorming en analyse van transgene zebravis embryo's in multiwell platen. Dit toont de mogelijkheid om dosisafhankelijke effecten van een klein molecuul, BCI, meten op fibroblast groeifactor reporter-gen expressie en leveren van technologie voor de oprichting van high-throughput zebravis chemische schermen.

Ontwikkeling van geautomatiseerde beeldvorming en analyse voor de zebravis chemische schermen.

De zebravis, een kleine tropische vissen, is uitgegroeid tot een populair model voor het bestuderen van gen-functie tijdens gewervelde ontwikkeling en ziekte. De ruimtelijke en temporele expressie van de doelwitgenen worden...

Hoge resolutie Hele Mount<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie in zebravis embryo&#39;s om genexpressie en functie te bestuderen

De zebravis is een krachtig modelsysteem voor ontwikkelingsbiologie en onderzoek naar menselijke ziekten vanwege hun genetische overeenkomsten met hogere gewervelde dieren. Dit protocol beschrijft een methodologie om haploïde zebravis-embryo's te creëren die kunnen worden gebruikt voor forward screen-strategieën om recessieve mutaties in genen die essentieel zijn voor vroege embryogenese te identificeren.

Productie van Haploid zebravis embryo&#39;s door<em&gt; In Vitro</em&gt; Bemesting

Cardiale genexpressie profielen te analyseren tijdens zebravis ontwikkeling van het hart, heeft totaal RNA worden geëxtraheerd uit geïsoleerde harten. Hier presenteren we een protocol voor het verzamelen van functionele / kloppende harten door snelle handmatige dissectie van de zebravis embryo's tot cardiale-specifieke mRNA te verkrijgen.

Grootschalige de zebravis embryonale Hart Dissection voor Transcriptionele Analyse

Dit protocol beschrijft een methode voor het isoleren van enkele cellen uit zebravis-embryo's, het verrijken van cellen van belang, het vastleggen van zebraviscellen in microfluïdische gebaseerde enkelcellige multiplexsystemen en het beoordelen van genexpressie uit enkele cellen.

Isolatie en karakterisering van enkele cellen van zebravis embryo&#39;s

Hematopoietische stamcellen en progenitorcellen (HSPC) afgeleid van gespecialiseerde (hemogenic) endotheelcellen tijdens de ontwikkeling, maar weinig bekend over het proces waarbij sommige endotheelcellen specificeren bloedvormende worden. We tonen een stroom-cytometrie-gebaseerde methode waarmee gelijktijdige isolatie van hemogenic endotheelcellen en HSPC van muizen embryonale weefsels.

Isolatie van muizen embryonale Hemogenic endotheelcellen

Dit protocol geeft stap-voor-stap instructies over hoe je parabiotische zebravis-embryo's van verschillende genetische achtergronden kunt genereren. In combinatie met de ongeëvenaarde beeldvormingscapaciteiten van het zebravis-embryo biedt deze methode een uniek krachtig middel om cel-autonome versus niet-cel-autonome functies voor kandidaat-genen van belang te onderzoeken.

Generatie Parabiotic zebravis embryo&#39;s door Surgical Fusion of Developing Blastulae

Hier gepresenteerd is een protocol voor whole-mount in situ RNA hybridisatie analyse in zebravis en buisvorming test in patiënt-afgeleide geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide endotheelcellen om de rol van endoglin in vasculaire vorming te bestuderen.

Whole-Mount In Situ Hybridisatie in Zebrafish Embryo's en Tube Formation Assay in iPSC-ECs om de rol van Endoglin in vasculaire ontwikkeling te bestuderen

Deze test is een eenvoudige methode om hematopoëtische cellen te kwantificeren bij de ontwikkeling van embryonale zebravissen. Bloedcellen van gedissocieerde zebravissen worden onderworpen aan flow cytometrie analyse. Dit maakt het mogelijk om bloeddefecten bij gemuteerde dieren en na genetische modificatie te detecteren.

Flowcytometrie gebruiken om veranderde bloedvorming in de zich ontwikkelende zebravis te detecteren en te kwantificeren

Hier presenteren we een effectief, eenvoudig en snel 3D-kweekprotocol voor de vorming van sferoïden van twee zebravissen (Danio rerio) cellijnen: ZEM2S (embryo) en ZFL (normale hepatocyt).

Een 3D-kweekmethode van sferoïden van embryonale en lever zebraviscellijnen

Dit protocol beschrijft een goedkope lichtmicroscopiemethode om de cardiale morfologie en functie in zebravisembryo's te beoordelen, waardoor een reproduceerbare evaluatie van ontwikkelingscardiotoxiciteit mogelijk is zonder dat er geavanceerde beeldvormingssystemen nodig zijn.

Functionele cardiale beeldvorming in zebravisembryo's met behulp van standaardmicroscopie en videoanalyse: toepassingen in milieu- en biomedisch onderzoek

Leer een in vitro methode om hematopoëtische stam- en voorlopercellen te kwantificeren in ontwikkelende zebravisembryo's. Deze techniek detecteert bloedafwijkingen en ondersteunt medicijnscreening effectief.

Ontwikkeling van een In Vitro Assay voor het kwantificeren van hematopoietische stamcellen en voorlopercellen cellen (HSPCs) bij de ontwikkeling van de zebravis embryo s (Video) | JoVE Journal

Ontwikkeling van een In Vitro Assay voor het kwantificeren van hematopoietische stamcellen en voorlopercellen cellen (HSPCs) bij de ontwikkeling van de zebravis embryo 's

Meer video's verkennen