Ontwikkeling van een In Vitro Assay voor het kwantificeren van hematopoietische stamcellen en voorlopercellen cellen (HSPCs) bij de ontwikkeling van de zebravis embryo 's

Het algemene doel van deze test is om de differentiatie van hematopoëtische voorlopercellen in het zich ontwikkelende zebravisembryo te tellen en te onderzoeken. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van enkele zeer belangrijke vragen op het gebied van hematopoëse, zoals hoeveel stam- en voorlopercellen er eigenlijk in een zich ontwikkelende zebravis zijn. Het grote voordeel van deze techniek is dat het snel is, relatief goedkoop en gemakkelijk uit te voeren.

Hoewel deze methode inzicht kan geven in het aantal voorlopers in de zich ontwikkelende zebravis, stelt het onderzoekers ook in staat om het functionele effect van een medicijn of genetische mutatie op de vorming van bloedvoorlopers te meten. We kwamen op het idee voor deze methode toen we genen uitschakelden die volgens ons cruciaal waren voor de bloedvorming. We voorspelden dat we met deze test het verschil zouden kunnen meten tussen normaal ontwikkelende embryo's en degenen die morphanten waren.

Gebruik plastic containers om drie wasstations te maken om zebravisembryo's te bleken, waarbij er één station is met één milliliter vijf procent bleekmiddel per liter E3 en twee stations met steriel E3. Plaats embryo's met een overdrachtpijpje in een theezeef en dompel ze vijf minuten onder in wasstation nummer een. Breng vervolgens de theezeef met de embryo's over naar wasstation nummer twee gedurende vijf minuten. Herhaal dit voor wasstation nummer drie gedurende nog eens vijf minuten.

Na de laatste wassing, verwijder de embryo's uit de theezeef door deze ondersteboven te keren boven een schone 10 centimeter petrischaal en gebruik een overdrachtpijpje en steriel E3 om de embryo's voorzichtig van de zeef af te spoelen. Om de embryo's te ontschillen, gebruik een overdrachtpijpje om zoveel mogelijk E3 uit de petrischaal te verwijderen en weg te gooien. Voeg vervolgens 500 microliters dechorionatieprodeas toe aan de embryo's en incubeer ze vijf minuten op kamertemperatuur.

Tikt vervolgens zachtjes op de zijkant van de petrischaal om de chorions volledig te verwijderen. Voeg vervolgens met een serologische pipet 20 milliliter steriel E3 toe om de prodeas te verdunnen. Laat de embryo's bezinken en gebruik een pipet om het E3 te verwijderen. Herhaal deze wasstap drie keer om alle sporen van de dechorionatieprodeas te verwijderen.

Gebruik een pipet om 10 embryo's in een enkele steriele 1,5 milliliter microcentrifugebuis te plaatsen om embryomonsters voor te bereiden. Pipetteer vervolgens voorzichtig het E3 weg en gooi het weg. Breng monsters over naar een laminaire stroomkap en was de embryo's door één milliliter steriel E3 toe te voegen, zodat de embryo's naar de bodem van de buis zinken.

Gebruik vervolgens een P1000 pipet om het supernatant te verwijderen. Herhaal dit in totaal drie keer. Na de laatste wassing, verwijder het E3 en gooi het weg.

Voeg vervolgens één milliliter 10 millimolair DTT in E3 toe om de slijmlaag en eventuele sporen, gisten of bacteriën die zich in de slijmlaag rond de embryo's bevinden te verwijderen. Leg de microcentrifugebuis horizontaal en incubeer deze 25 minuten op kamertemperatuur. Gebruik één milliliter steriel DPBS om de monsters drie keer te wassen en de embryo's te dissociëren.

Na de laatste wassing, voeg 500 microliters DPBS met calcium en magnesium en vijf microliters vijf milligram per milliliter dissociatieprodeas toe. Incubeer de monsters gedurende 60 minuten op 37 graden Celsius op een horizontale orbitale shaker bij 180 rpm. Plaats vervolgens de monsters en de laminaire stroomkap en gebruik een P1000 om de embryo's te trituren totdat de monsters volledig gedissocieerd zijn.

Wees voorzichtig en controleer de embryo's regelmatig om te bepalen wanneer ze gedissocieerd zijn. Je wilt dat er wat weefsel aanwezig is. Het is mogelijk om de embryo's te veel te verteren, waardoor de voorlopercellen worden vernietigd.

Pipetteer de 10 gedissocieerde embryo's op de bovenste reservoir van een vijf milliliter polystyreen buis met een ronde bodem en een 35 micrometer celstrainerdop. Spoel de embryobuis met een pipet en steriel PBS en breng de oplossing over naar de vijf milliliter polystyreen buis met gefilterde cellen. Herhaal de spoeling tot er vier milliliter vloeistof in de buis aanwezig is.

Centrifugeer de buizen bij 300 keer de zwaartekracht en vier graden Celsius gedurende vijf minuten om het gehomogeniseerde celmonster te paletteren. Verwijder met een pipet en gooi het supernatant van de buis met ronde bodem weg, zorg ervoor dat je de cellen die op de bodem zijn gepelleteerd niet verstoort. Gebruik vervolgens 100 microliters PBS om de cellen op te schorsen.

Bereid een X complete methylcellulose stockoplossing voor en gebruik drie milliliter spuiten en 16 gauge naalden om 2,5 milliliter steriel rond bodem buizen van 14 milliliter toe te voegen. Gebruik één buis voor elke geteste conditie. Voor myeloid differentiatie, voeg één procent karperserum en 0,3 milligram per milliliter recombinante zebravis granulocyte koloniestimulerende factor of GCSF toe aan methylcellulose medium.

Voor erythroïde differentiatie, voeg één procent karperserum en 0,1 milligram per milliliter recombinante zebravis erytropoëtine of EPO toe aan methylcellulose medium. Om multi-lineage voorlopers te onderzoeken, voeg EPO en GCSF toe. Voeg met een pipet 100 microliters van de 10 gedissocieerde embryo's toe aan het oppervlak van de voorbereide methylcellulose met de recombinante cytokinen in karperserum.

Dek de dop af en vortex voorzichtig om het monster volledig te homogeniseren. Elke buis zou nu het gedissocieerde weefsel van 10 embryo's moeten bevatten. Gebruik drie milliliter spuiten en 16 gauge naalden om één milliliter monster in twee afzonderlijke 35 millimeter petrischalen te verdelen.

Zorg ervoor dat het monster volledig in de petrischaal is verspreid. Herhaal dit voor elk monster. Plaats de 35 millimeter petrischalen met cellen en methylcellulose in een 15 centimeter petrischaal.

Voeg aan elke grote plaat één 3