Robuuste DNA isolatie en High-throughput Sequencing bibliotheek bouw voor Herbarium Specimens
March 8th, 2018
Dit artikel demonstreert een gedetailleerd protocol voor DNA isolatie en hoge gegevensdoorvoer sequencing bibliotheek bouw van herbarium materiaal met inbegrip van de redding van uitzonderlijk slechte kwaliteit DNA.
Het algemene doel van dit protocol is om de hoeveelheid geïsoleerde dubbelstrengs DNA en daaropvolgende high-throughput sequencing bibliotheken van herbariumexemplaren te verhogen, waardoor hun bruikbaarheid in fylogenomisch onderzoek wordt gemaximaliseerd. Deze methode ontsluit het potentieel van herbariumexemplaren die anders niet bruikbaar zouden zijn voor sequencingprojecten als genomische sequenties vanwege uitgebreide monsterdegradatie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze robuust genoeg is dat zeldzame en historisch belangrijke herbariumexemplaren kunnen worden gebruikt zonder de noodzaak van uitgebreide destructief bemonstering.
Deze techniek verlengt de diepte van taxonbemonstering in systematische spaced projecten. Soortenverwerving is een beperkende stap, maar met dit protocol kunnen historische collecties gemakkelijk worden gebruikt in deze studies. Voeg vloeibare stikstof en 30 tot 50 milligram gesteriliseerde zand toe om een centimeter vierkant van vooraf geselecteerd herbariumweefsel tot fijn poeder te vermalen in vooraf gekoelde mortel en stamper.
Voldoende malen is essentieel voor succesvolle DNA-isolatie. En er moet voor worden gezorgd dat het monster volledig gepulveriseerd is. Voeg vervolgens het bevroren poeder toe aan twee twee-milliliterbuisjes, waarbij niet meer dan de helft van het buisvolume wordt gevuld.
Voeg vervolgens 600 microliter warme CTAB-oplossing toe aan elke buis. Meng het poeder grondig door te keren en te vortexen. Bewaar vervolgens de monsters in een waterbad op 65 graden Celsius gedurende een tot 1,5 uur.
Ondertussen, vortex elke 15 minuten. Centrifugeer vervolgens de monsters bij 10.000 g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Na centrifugatie, breng ongeveer 500 microliter van de supernatant over naar een nieuwe, verse set van gelabelde buisjes.
Voeg aan het supernatant vier microliter van 10 milligram per milliliter RNase A toe aan elke toon. Meng vervolgens de inhoud van de buis door te keren of te pipetteren. Bewaar de monsters in een hitteblok of waterbad op 37 graden Celsius gedurende 15 minuten.
Zodra de buisjes kamertemperatuur hebben bereikt, voeg ongeveer 500 microliter van 25:24:1 fenol, chloroform, isoamy alcohol mengsel toe aan de monsters. Meng vervolgens de inhoud van de buis door te keren of herhaaldelijk te pipetteren. Centrifugeer vervolgens de monsters bij 12.000 g gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
Breng de bovenste waterige laag, die ongeveer 400 microliter is, over naar een nieuwe set van gelabelde buisjes. Voeg aan de waterige laag in elke buis ongeveer 400 microliter van 24:1 chloroform, isoamy alcohol mengsel toe. Meng het monster grondig door herhaaldelijk te pipetteren of te keren.
Centrifugeer vervolgens de buisjes bij 12.000 g gedurende vijf minuten en breng ongeveer 300 microliter van de bovenste waterige laag over naar vooraf gekoelde, gelabelde buisjes. Voeg vervolgens 300 microliter van vooraf gekoeld isopropanol en 12 microliter van 2,5 molair natriumacetaat toe. Bewaar vervolgens de buisjes bij min 20 graden Celsius gedurende 30 tot 60 minuten.
Na bewaar, verwijder de monsters uit de vriezer. Centrifugeer vervolgens de monsters bij 12.000 g gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Na centrifugatie, was de pellet met ongeveer 300 tot 500 microliter van 70% ethanol.
Centrifugeer opnieuw de buisjes bij 12.000 g gedurende 10 minuten. Verwijder vervolgens voorzichtig het supernatant zonder de pellet te verstoren. Droog vervolgens de pellets in de lucht en los het DNA op in 50 microliter van 1X Tris-EDTA buffer.
Voeg een tot 16 microliter van geïsoleerd DNA en twee microliter van fragmentatiereactiebuffer toe in een 0,2-milliliter polymerasekettingreactiebuis. Pas het eindvolume aan tot 18 microliter met nuclease-vrij water. Voeg vervolgens twee microliter van dubbelstrengs DNA fragmentatie-enzym toe en vortex de mengsel kort gedurende drie seconden.
Bewaar vervolgens de monsters bij 37 graden Celsius gedurende 8,5 minuten in de thermocycler. Voeg na bewaar vijf microliter van 0,5 molair EDTA toe aan de buisjes. Voeg 25 microliter van nuclease-vrij water toe om het totale volume van het gescheurde DNA aan te passen tot 50 microliter.
Voeg vervolgens 45 microliter van SPRI-kralen aangebracht bij kamertemperatuur toe aan 50 microliter van gescheurd DNA en meng de twee grondig door herhaaldelijk te pipetteren. Laat het monster bevattende buisjes vijf minuten staan. Breng vervolgens de buisjes over op een magnetische plaat en wacht nog eens vijf minuten.
Verwijder voorzichtig het supernatant. Voeg vervolgens 200 microliter van vers 80% ethanol toe aan de buisjes op de magnetische stand en wacht nog eens 30 seconden bij kamertemperatuur. Verwijder na 30 seconden voorzichtig het supernatant.
Laat het deksel van de buis open staan om de kralen vijf minuten in de lucht te drogen op de magnetische stand. Verwijder vervolgens de buisjes van de magneetstand en elueer het DNA van de kralen in 55 microliter van 0,1X Tris-EDTA buffer. Meng het DNA grondig door herhaaldelijk te pipetteren.
Bewaar vervolgens het monster bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Plaats het buisje opnieuw op de magnetische stand en wacht tot de oplossing in ongeveer twee minuten helder wordt. Verwijder 52 microliter van het supernatant en voer vervolgens DNA-kwantificeringsanalyse uit zoals beschreven in het tekstprotocol.
Voeg aan 50 microliter van schoongemaakt en gescheurd DNA drie microliter van endonuclease, fosfaat-staartenzymen en zeven microliter van reactiebuffer toe. Meng het DNA en de andere componenten grondig door herhaaldelijk te pipetteren. Draai vervolgens de buisjes om de luchtbellen te verwijderen.
Na het draaien, breng de monsters over naar een thermocycler en stel het programma in. Verdun de adapter 25 tot 50-voudig om een werkconcentratie van 0,6 tot 0,3 micromolar te bereiken. Voor high-throughput kort-lezen sequencing, voeg
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel demonstreert een gedetailleerd protocol voor DNA-isolatie en constructie van high-throughput sequencing bibliotheken uit herbariummateriaal. De methode verbetert de bruikbaarheid van gedegradeerde herbariumspecimens in fylogenetische studies.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Genomiek
- Fylogenetica
- Botanisch onderzoek
Achtergrond
- Herbariumspecimens bevatten vaak gedegradeerd DNA.
- Traditionele methoden zijn mogelijk niet geschikt voor deze monsters.
- High-throughput sequencing kan profiteren van verbeterde DNA-isolatietechnieken.
- Dit protocol heeft als doel historische collecties effectief te gebruiken.
Doel van de studie
- Om de hoeveelheid geïsoleerde dubbelstrengs DNA te verhogen.
- Om high-throughput sequencing bibliotheken te construeren uit herbariumspecimens.
- Om de bruikbaarheid van gedegradeerde monsters in genomische studies te maximaliseren.
Gebruikte methoden
- Voeg vloeibare stikstof en gesteriliseerde zand toe om herbariumweefsel te malen.
- Gebruik een voorgekoelde vijzel en stamper voor monstervoorbereiding.
- Volg een gedetailleerd protocol voor DNA-isolatie.
- Bouw sequencingbibliotheken op die geschikt zijn voor high-throughput analyse.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van DNA uit historisch belangrijke specimen.
- Aangetoonde robuustheid van het protocol voor gedegradeerde monsters.
- Uitgebreide taxon-sampling in systematische studies.
- Vereenvoudigde opname van historische collecties in genomisch onderzoek.
Conclusies
- Het protocol verbetert de haalbaarheid van het gebruik van herbariumspecimens in sequencingprojecten.
- Het opent nieuwe wegen voor fylogenetisch onderzoek.
- Zeldzame specimen kunnen worden gebruikt zonder uitgebreide destructieve bemonstering.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Unlocking robust DNA isolation and high-throughput sequencing from herbarium specimens addresses a critical bottleneck in plant genomics and phylogenetic discovery. This protocol enables the inclusion of rare, degraded, or irreplaceable samples in large-scale sequencing projects, expanding taxonomic breadth and reducing destructive sampling. The approach supports scalable, reproducible workflows essential for enterprise-level R&D and portfolio expansion in plant biotechnology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of genetic diversity from historical and rare plant specimens.
- Supports functional validation of phylogenetic targets using previously inaccessible material.
- Facilitates predictive confidence in lineage assignment and evolutionary studies.
Screening & Assay Development
- Prepares validated DNA libraries suitable for high-throughput sequencing platforms.
- Standardizes sample processing across diverse, low-quality plant materials.
- Delivers reproducible, quantitative DNA yields for downstream comparative analyses.
Translational & Preclinical Research
- Enables continuity from discovery genomics to translational phylogenetic applications.
- Supports risk-adjusted advancement of plant-derived targets for further study.
- Provides a foundation for biomarker discovery in plant systematics when applicable.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates at the interface of sample acquisition and sequencing library preparation, bridging early discovery with downstream genomic analysis.
- Discovery Biology: Expands hypothesis testing to include rare and degraded specimens, increasing biological de-risking.
- Screening: Delivers assay-ready DNA libraries with consistent fragment sizes and yields.
- Analytics: Provides quantitative DNA and library quality metrics for cross-sample comparison.
- Translational Research: Maintains continuity for phylogenetic and evolutionary studies using historical samples.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, adaptable workflow for diverse plant lineages and future projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces ambiguity in plant target validation.
- Operational Value: Standardizes DNA isolation and library construction for high-throughput scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions for rare sample utilization and portfolio expansion.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of plant targets and maximizes use of historical collections.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plant molecular biology and sequencing library preparation.
- Needs access to standard molecular biology instrumentation and high-throughput sequencing infrastructure.
- Demands cross-team standardization for reproducibility across diverse sample types.
- May require adaptation for plant lineages with extreme DNA degradation or inhibitory metabolites.
- Limited by DNA fragment size distribution and presence of secondary metabolites in some specimens.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:58
DNA Extraction
4:39
DNA Shearing
5:28
Bead Clean-up
7:06
Library Preparation
7:40
Adaptor Ligation
8:46
PCR Amplification
9:12
Size Selection for Desired Library Size and Quality Control
11:04
Results: Isolation and High-throughput Sequencing of Poor Quality DNA Isolated from Various Herbarium Species
12:33
Conclusion
