Robuuste DNA isolatie en High-throughput Sequencing bibliotheek bouw voor Herbarium Specimens

Het algemene doel van dit protocol is om de hoeveelheid geïsoleerde dubbelstrengs DNA en daaropvolgende high-throughput sequencing bibliotheken van herbariumexemplaren te verhogen, waardoor hun bruikbaarheid in fylogenomisch onderzoek wordt gemaximaliseerd. Deze methode ontsluit het potentieel van herbariumexemplaren die anders niet bruikbaar zouden zijn voor sequencingprojecten als genomische sequenties vanwege uitgebreide monsterdegradatie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze robuust genoeg is dat zeldzame en historisch belangrijke herbariumexemplaren kunnen worden gebruikt zonder de noodzaak van uitgebreide destructief bemonstering.

Deze techniek verlengt de diepte van taxonbemonstering in systematische spaced projecten. Soortenverwerving is een beperkende stap, maar met dit protocol kunnen historische collecties gemakkelijk worden gebruikt in deze studies. Voeg vloeibare stikstof en 30 tot 50 milligram gesteriliseerde zand toe om een centimeter vierkant van vooraf geselecteerd herbariumweefsel tot fijn poeder te vermalen in vooraf gekoelde mortel en stamper.

Voldoende malen is essentieel voor succesvolle DNA-isolatie. En er moet voor worden gezorgd dat het monster volledig gepulveriseerd is. Voeg vervolgens het bevroren poeder toe aan twee twee-milliliterbuisjes, waarbij niet meer dan de helft van het buisvolume wordt gevuld.

Voeg vervolgens 600 microliter warme CTAB-oplossing toe aan elke buis. Meng het poeder grondig door te keren en te vortexen. Bewaar vervolgens de monsters in een waterbad op 65 graden Celsius gedurende een tot 1,5 uur.

Ondertussen, vortex elke 15 minuten. Centrifugeer vervolgens de monsters bij 10.000 g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Na centrifugatie, breng ongeveer 500 microliter van de supernatant over naar een nieuwe, verse set van gelabelde buisjes.

Voeg aan het supernatant vier microliter van 10 milligram per milliliter RNase A toe aan elke toon. Meng vervolgens de inhoud van de buis door te keren of te pipetteren. Bewaar de monsters in een hitteblok of waterbad op 37 graden Celsius gedurende 15 minuten.

Zodra de buisjes kamertemperatuur hebben bereikt, voeg ongeveer 500 microliter van 25:24:1 fenol, chloroform, isoamy alcohol mengsel toe aan de monsters. Meng vervolgens de inhoud van de buis door te keren of herhaaldelijk te pipetteren. Centrifugeer vervolgens de monsters bij 12.000 g gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.

Breng de bovenste waterige laag, die ongeveer 400 microliter is, over naar een nieuwe set van gelabelde buisjes. Voeg aan de waterige laag in elke buis ongeveer 400 microliter van 24:1 chloroform, isoamy alcohol mengsel toe. Meng het monster grondig door herhaaldelijk te pipetteren of te keren.

Centrifugeer vervolgens de buisjes bij 12.000 g gedurende vijf minuten en breng ongeveer 300 microliter van de bovenste waterige laag over naar vooraf gekoelde, gelabelde buisjes. Voeg vervolgens 300 microliter van vooraf gekoeld isopropanol en 12 microliter van 2,5 molair natriumacetaat toe. Bewaar vervolgens de buisjes bij min 20 graden Celsius gedurende 30 tot 60 minuten.

Na bewaar, verwijder de monsters uit de vriezer. Centrifugeer vervolgens de monsters bij 12.000 g gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Na centrifugatie, was de pellet met ongeveer 300 tot 500 microliter van 70% ethanol.

Centrifugeer opnieuw de buisjes bij 12.000 g gedurende 10 minuten. Verwijder vervolgens voorzichtig het supernatant zonder de pellet te verstoren. Droog vervolgens de pellets in de lucht en los het DNA op in 50 microliter van 1X Tris-EDTA buffer.

Voeg een tot 16 microliter van geïsoleerd DNA en twee microliter van fragmentatiereactiebuffer toe in een 0,2-milliliter polymerasekettingreactiebuis. Pas het eindvolume aan tot 18 microliter met nuclease-vrij water. Voeg vervolgens twee microliter van dubbelstrengs DNA fragmentatie-enzym toe en vortex de mengsel kort gedurende drie seconden.

Bewaar vervolgens de monsters bij 37 graden Celsius gedurende 8,5 minuten in de thermocycler. Voeg na bewaar vijf microliter van 0,5 molair EDTA toe aan de buisjes. Voeg 25 microliter van nuclease-vrij water toe om het totale volume van het gescheurde DNA aan te passen tot 50 microliter.

Voeg vervolgens 45 microliter van SPRI-kralen aangebracht bij kamertemperatuur toe aan 50 microliter van gescheurd DNA en meng de twee grondig door herhaaldelijk te pipetteren. Laat het monster bevattende buisjes vijf minuten staan. Breng vervolgens de buisjes over op een magnetische plaat en wacht nog eens vijf minuten.

Verwijder voorzichtig het supernatant. Voeg vervolgens 200 microliter van vers 80% ethanol toe aan de buisjes op de magnetische stand en wacht nog eens 30 seconden bij kamertemperatuur. Verwijder na 30 seconden voorzichtig het supernatant.

Laat het deksel van de buis open staan om de kralen vijf minuten in de lucht te drogen op de magnetische stand. Verwijder vervolgens de buisjes van de magneetstand en elueer het DNA van de kralen in 55 microliter van 0,1X Tris-EDTA buffer. Meng het DNA grondig door herhaaldelijk te pipetteren.

Bewaar vervolgens het monster bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Plaats het buisje opnieuw op de magnetische stand en wacht tot de oplossing in ongeveer twee minuten helder wordt. Verwijder 52 microliter van het supernatant en voer vervolgens DNA-kwantificeringsanalyse uit zoals beschreven in het tekstprotocol.

Voeg aan 50 microliter van schoongemaakt en gescheurd DNA drie microliter van endonuclease, fosfaat-staartenzymen en zeven microliter van reactiebuffer toe. Meng het DNA en de andere componenten grondig door herhaaldelijk te pipetteren. Draai vervolgens de buisjes om de luchtbellen te verwijderen.

Na het draaien, breng de monsters over naar een thermocycler en stel het programma in. Verdun de adapter 25 tot 50-voudig om een werkconcentratie van 0,6 tot 0,3 micromolar te bereiken. Voor high-throughput kort-lezen sequencing, voeg