Name: Robuuste DNA isolatie en High-throughput Sequencing bibliotheek bouw voor Herbarium Specimens (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-08T14:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 3 s
Description: Leer robuuste DNA-isolatie en high-throughput sequencing bibliotheekbouw voor herbarium specimens. Deze methode maximaliseert het gebruik van gedegradeerde historische collecties in fylogenomisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Taylor AuBuchon-Elder, Jordanië Teisher, en Kristina Zudock voor hulp bij bemonstering herbarium exemplaren en de Missouri Botanical Garden voor toegang tot herbarium exemplaren voor destructieve bemonstering. Dit werk was ondersteuning door een subsidie van de National Science Foundation (DEB-1457748).

<ol><li>Savolainen, V., Cuénoud, P., Spichiger, R., Martinez, M. D. P., Crèvecoeur, M., Manen, J. F. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF00984634">The use of herbarium specimens in DNA phylogenetics: Evaluation and improvement.</a> Plant Syst Evo. 197 (1-4), 87-98 (1995).</li>
<li>Zedane, L., Hong-Wa, C., Murienne, J., Jeziorski, C., Baldwin, B. G., Besnard, G. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/bij.12509/abstract">Museomics illuminate the history of an extinct, paleoendemic plant lineage (Hesperelaea, Oleaceae) known from an 1875 collection from Guadalupe Island, Mexico.</a> Bio J Linn Soc. 117 (1), 44-57 (2016).</li>
<li>Teisher, J. K., McKain, M. R., Schaal, B. A., Kellogg, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyphyly+of+Arundinoideae+%28Poaceae%29+and+Evolution+of+the+Twisted+Geniculate+Lemma+Awn%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Bot%22%5BJournal%5D)">Polyphyly of Arundinoideae (Poaceae) and Evolution of the Twisted Geniculate Lemma Awn.</a> Ann Bot. , (2017).</li>
<li>Cozzolino, S., Cafasso, D., Pellegrino, G., Musacchio, A., Widmer, A. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s10592-006-9209-7">Genetic variation in time and space: the use of herbarium specimens to reconstruct patterns of genetic variation in the endangered orchid Anacamptis palustris.</a> Conserv Gen. 8 (3), 629-639 (2007).</li>
<li>Wandeler, P., Hoeck, P. E. A., Keller, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Back+to+the+future%3A+museum+specimens+in+population+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Tre+Eco+%26+Evo%22%5BJournal%5D)">Back to the future: museum specimens in population genetics.</a> Tre Eco & Evo. 22 (12), 634-642 (2007).</li>
<li>Rivers, M. C., Taylor, L., Brummitt, N. A., Meagher, T. R., Roberts, D. L., Lughadha, E. N. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0006320711002679">How many herbarium specimens are needed to detect threatened species?</a> Bio Conserv. 144 (10), 2541-2547 (2011).</li>
<li>Saltonstall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryptic+invasion+by+a+non-native+genotype+of+the+common+reed%2C+Phragmites+australis%2C+into+North+America%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS+USA%22%5BJournal%5D)">Cryptic invasion by a non-native genotype of the common reed, Phragmites australis, into North America.</a> PNAS USA. 99 (4), 2445-2449 (2002).</li>
<li>Besnard, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+museums+to+genomics%3A+old+herbarium+specimens+shed+light+on+a+C3+to+C4+transition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Bot%22%5BJournal%5D)">From museums to genomics: old herbarium specimens shed light on a C3 to C4 transition.</a> J Exp Bot. 65 (22), 6711-6721 (2014).</li>
<li>Särkinen, T., Staats, M., Richardson, J. E., Cowan, R. S., Bakker, F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+open+the+treasure+chest%3F+Optimising+DNA+extraction+from+herbarium+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">How to open the treasure chest? Optimising DNA extraction from herbarium specimens.</a> PLoS ONE. 7 (8), e43808(2012).</li>
<li>Harris, S. A. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF00937835">DNA analysis of tropical plant species: An assessment of different drying methods.</a> Plant Syst Evo. 188 (1-2), 57-64 (1994).</li>
<li>Staats, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+in+plant+herbarium+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">DNA damage in plant herbarium tissue.</a> PLoS ONE. 6 (12), e28448(2011).</li>
<li>Bakker, F. T., et al. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/bij.12642/abstract">Herbarium genomics: plastome sequence assembly from a range of herbarium specimens using an Iterative Organelle Genome Assembly pipeline.</a> Bio J of the Linn Soc. 117 (1), 33-43 (2016).</li>
<li>Camacho, F. J., Gernandt, D. S., Liston, A., Stone, J. K., Klein, A. S. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1046/j.1365-294X.1997.00266.x/full">Endophytic fungal DNA, the source of contamination in spruce needle DNA.</a> Mol Eco. 6 (10), 983-987 (1997).</li>
<li>Hofreiter, M., Jaenicke, V., Serre, D., Von Haeseler, A., Pääbo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequences+from+multiple+amplifications+reveal+artifacts+induced+by+cytosine+deamination+in+ancient+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">DNA sequences from multiple amplifications reveal artifacts induced by cytosine deamination in ancient DNA.</a> Nucl Acids Res. 29 (23), 4793-4799 (2001).</li>
<li>Staats, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+treasure+troves%3A+Complete+genome+sequencing+of+herbarium+and+insect+museum+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Genomic treasure troves: Complete genome sequencing of herbarium and insect museum specimens.</a> PLoS ONE. 8 (7), e69189(2013).</li>
<li>Bakker, F. T. <a target="_blank" href="http://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/00837792.2017.1313383">Herbarium genomics: skimming and plastomics from archival specimens.</a> Webbia. 72 (1), 35-45 (2017).</li>
<li>Doyle, J. J., Doyle, J. L. <a target="_blank" href="http://www.citeulike.org/user/echinotrix/article/678648">A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue.</a> Phytochem Bul. 19, 11-15 (1987).</li>
<li>Allen, G. C., Flores-Vergara, M. A., Krasynanski, S., Kumar, S., Thompson, W. F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17406474">A modified protocol for rapid DNA isolation from plant tissue using cetryltrimethylammonium bromide.</a> Nat Prot. 1, 2320-2325 (2006).</li>
<li>Twyford, A. D., Ness, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+complete+plastid+genome+seqeuncing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Eco+Resour%22%5BJournal%5D)">Strategies for complete plastid genome seqeuncing.</a> Mol Eco Resour. , (2016).</li>
<li>Aird, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+and+minimizing+PCR+amplification+bias+in+Illumina+sequencing+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Bio%22%5BJournal%5D)">Analyzing and minimizing PCR amplification bias in Illumina sequencing libraries.</a> Genome Bio. 12 (2), R18(2011).</li>
<li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trimmomatic%3A+A+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinf%22%5BJournal%5D)">Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinf. 30, 2114-2120 (2014).</li>
<li>Grigoriev, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MycoCosm+portal%3A+gearing+up+for+1000+fungal+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">MycoCosm portal: gearing up for 1000 fungal genomes.</a> Nucl Acids Res. 42 (1), D699-D704 (2014).</li>
<li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nat Meth. 9 (4), 357-359 (2012).</li>
<li>McKain, M. R. Herbarium Genomics. , Github Repository 
 <a target="_blank" href="https://github.com/mrmckain/">https://github.com/mrmckain/</a> (2017).</li>
<li>McKain, M. R., Wilson, M. A. Fast-Plast: Rapid de novo assembly and finishing for whole chloroplast genomes. , Github Repository 
 <a target="_blank" href="https://github.com/mrmckain/">https://github.com/mrmckain/</a> (2017).</li>
<li>McKain, M. R., McNeal, J. R., Kellar, P. R., Eguiarte, L. E., Pires, J. C., Leebens-Mack, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+of+rapid+diversification+and+convergent+origins+of+active+pollination+within+Agavoideae+%28Asparagaceae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Bot%22%5BJournal%5D)">Timing of rapid diversification and convergent origins of active pollination within Agavoideae (Asparagaceae).</a> Am J Bot. 103 (10), 1717-1729 (2016).</li>
<li>McKain, M. R., Hartsock, R. H., Wohl, M. M., Kellogg, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Verdant%3A+automated+annotation%2C+alignment%2C+and+phylogenetic+analysis+of+whole+chloroplast+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinf%22%5BJournal%5D)">Verdant: automated annotation, alignment, and phylogenetic analysis of whole chloroplast genomes.</a> Bioinf. , (2016).</li>
<li>Staton, S. E., Burke, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposome%3A+A+toolkit+for+annotation+of+transposable+element+families+from+unassembled+sequence+reads%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinf%22%5BJournal%5D)">Transposome: A toolkit for annotation of transposable element families from unassembled sequence reads.</a> Bioinf. 31 (11), 1827-1829 (2015).</li>
<li>Bao, W., Kojima, K. K., Kohany, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repbase+Update%2C+a+database+of+repetitive+elements+in+eukaryotic+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Mobile+DNA%22%5BJournal%5D)">Repbase Update, a database of repetitive elements in eukaryotic genomes.</a> Mobile DNA. 6 (1), 11(2015).</li>
<li>McKain, M. R. Transposons. , Github Repository 
 <a target="_blank" href="https://github.com/mrmckain/">https://github.com/mrmckain/</a> (2017).</li>
<li>Weiß, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+patterns+of+damage+and+decay+kinetics+of+DNA+retrieved+from+plant+herbarium+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Royal+Soc+Open+Sci%22%5BJournal%5D)">Temporal patterns of damage and decay kinetics of DNA retrieved from plant herbarium specimens.</a> Royal Soc Open Sci. 3 (6), 160239(2016).</li>
<li>Sawyer, S., Krause, J., Guschanski, K., Savolainen, V., Pääbo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+patterns+of+nucleotide+misincorporations+and+DNA+fragmentation+in+ancient+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Temporal patterns of nucleotide misincorporations and DNA fragmentation in ancient DNA.</a> PLoS ONE. 7 (3), e34131(2012).</li>
<li>Head, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Library+construction+for+next-generation+sequencing%3A+overviews+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges.</a> BioTechniques. 56 (2), 61-64 (2014).</li>
<li>Grover, C. E., Salmon, A., Wendel, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+sequence+capture+as+a+powerful+tool+for+evolutionary+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Bot%22%5BJournal%5D)">Targeted sequence capture as a powerful tool for evolutionary analysis.</a> Am J Bot. 99, 312-319 (2012).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij hebben geen concurrerende belangen.

Het protocol hier gepresenteerd is een uitgebreide en robuuste methode voor DNA isolatie en het rangschikken van bibliotheek bereiding op basis van gedroogde plant exemplaren. De consistentie van de methode en de minimale behoefte te wijzigen op basis van specimen kwaliteit maken het schaalbare voor groot herbarium gebaseerde sequencing projecten. De opname van een optionele reamplification stap voor lage opbrengst bibliotheken kan de opname van lage kwaliteit, geringe hoeveelheid, zeldzame, of historisch belangrijke voo...

Herbarium collecties zijn een potentieel waardevolle bron van zowel de soorten en de genomische diversiteit voor studies inclusief fylogenie1,2,3, populatie genetica4,5, instandhouding biologie6, invasieve soorten biologie7en trek evolutie8. De mogelijkheid om het verkrijgen van een rijke diversiteit aan soorten, populaties, geografische locaties en tijdstippen hoogtepunten de "schatkamer"9 thats het herbarium. Historisch, heeft de aangetaste aard van herbarium afkomstige DNA PCR-gebaseerde projecten, vaak indelings onderzoekers aan het gebruik van alleen markeringen gevonden in hoge exemplaar, zoals regio's van de chloroplast genoom- of de interne getranscribeerde spacer (ITS) voor de ribosomal belemmerd RNA. Kwaliteit van specimens en DNA variëren uitgebreid op basis van methoden van behoud9,10, met double-stranded pauzes en versnippering van warmte in het droogproces wordt de meest voorkomende vormen van schade, het creëren van gebruikt de zogenaamde 90% DNA lock-up die PCR gebaseerde studies11heeft bezwaard. Afgezien van fragmentatie is het tweede meest voorkomende probleem in herbarium genomics besmetting, zoals die afkomstig is van endophytic schimmels13 of schimmels postmortale verworven na collectie maar vóór de montage in het herbarium12, hoewel Dit probleem kan worden opgelost bioinformatically gegeven de juiste schimmel database (zie hieronder). Een derde, en minder vaak, probleem is wijziging van de volgorde via cytosine (C/G→T/A) deamination14, hoewel het wordt geschat op lage (~ 0,03%) in herbarium specimens11. Met de komst van high-throughput sequencing (HTS), kan het probleem van de versnippering worden overwonnen met korte leest en sequencing diepte12,15, waardoor genomic-niveau data-acquisitie van talrijke exemplaren met lage kwaliteit DNA, en soms zelfs het hele genoom sequencing15toelaat.
Herbarium monsters worden steeds vaker gebruikt en zijn een grotere component fylogenetische projecten16. Een uitdaging van dit moment herbarium exemplaren te gebruiken voor HTS is consequent voldoende dubbele gestrande DNA, een noodzakelijke voorwaarde voor sequencing protocollen, verkrijgen van talrijke soorten in een tijdig, zonder te optimaliseren van methoden voor het individu exemplaren. In deze paper wordt een protocol voor DNA-extractie en bibliotheek voorbereiding van herbarium specimens die profiteert van bestaande methoden en hen te voorzien van snelle en repliceerbaar resultaten wijzigt aangetoond. Deze methode zorgt voor volledige verwerking vanaf specimen aan een bibliotheek voor 24 samples in 13 h, met 8 h hands-on tijd, of 16 h, met 9 h hands-on tijd, wanneer de optionele reamplification stap nodig is. Gelijktijdige verwerking van meer monsters is haalbaar, al is de beperkende factor centrifuge capaciteit en technische vaardigheid. Het protocol is ontworpen om alleen typische laboratoriumapparatuur (thermocycler centrifuge en magnetische stands) in plaats van gespecialiseerde apparatuur, zoals een vernevelaar of ultrasoonapparaat, voor het scheren van DNA vereisen.
DNA kwaliteit, fragment grootte en het aantal beperken factoren voor het gebruik van herbarium specimens in high-throughput sequencing experimenten. Andere methoden voor het isoleren van herbarium DNA en het maken van high-throughput sequencing bibliotheken hebben aangetoond dat het nut van het gebruik van zo weinig als 10 ng DNA16; maar ze vereisen het optimale aantal PCR experimenteel te bepalen cycli vereist voor de voorbereiding van de bibliotheek. Dit wordt onpraktisch als omgaan met buitengewoon kleine hoeveelheden van levensvatbare dubbele strandde DNA (dsDNA), zoals sommige herbarium exemplaren alleen voldoende DNA voor een preparaat één bibliotheek produceren. De methode die hier gepresenteerd maakt gebruik van een enkel getal van cycli ongeacht monster kwaliteit, dus geen DNA is verloren in bibliotheek optimization stappen. In plaats daarvan, is een stap in de reamplification wordt aangeroepen wanneer bibliotheken niet voldoen aan de minimale bedragen die nodig zijn voor het rangschikken. Vele herbarium monsters zijn zeldzaam en weinig materiaal, waardoor het moeilijk te rechtvaardigen destructieve bemonstering in veel gevallen bezitten. Om dit tegen te, kunt het gepresenteerde protocol dsDNA ingang maten van minder dan 1,25 ng in het voorbereidingsproces van de bibliotheek, uitbreiding van het toepassingsgebied van levensvatbare monsters voor high-throughput sequencing en het minimaliseren van de noodzaak voor destructieve bemonstering van specimens.
Het volgende protocol is geoptimaliseerd voor grassen en getest op honderden verschillende soorten van herbarium monsters, hoewel we verwachten dat het protocol kan worden toegepast op vele andere plantengroepen. Het bevat een optionele herstelstap, die kan worden gebruikt voor het opslaan van lage kwaliteit en/of zeldzame exemplaren. Gebaseerd op meer dan tweehonderd herbarium exemplaren getest, werkt dit protocol op monsters met lage weefsel input en kwaliteit, waardoor het behoud van zeldzame specimens via minimale destructieve bemonstering. Hier is het aangetoond dat dit protocol kan bieden hoge kwaliteit Bibliotheken, die kunnen worden sequenced voor phylogenomics gebaseerde projecten.

<table><tbody><tr><td>Veriti Thermal Cycler</td><td>Applied Biosystems</td><td>4452300</td><td>96 well&nbsp;</td></tr><tr><td>Gel Imaging System</td><td>Azure Biosystems</td><td>c300</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge 20 Series</td><td>Beckman Coulter</td><td>B30137</td><td></td></tr><tr><td>Digital Dry Bath</td><td>Benchmark Scientific</td><td>BSH1001</td><td></td></tr><tr><td>Electrophoresis System</td><td>EasyCast</td><td>B2</td><td></td></tr><tr><td>PURELAB flex 2 (Ultra pure water)</td><td>ELGA&nbsp;</td><td>89204-092</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind Tube&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>30108078</td><td>2 ml</td></tr><tr><td>Mini centrifuge</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-006-901</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-812</td><td></td></tr><tr><td>Mortar</td><td>Fisher Scientific</td><td>S02591</td><td>porselein</td></tr><tr><td>Pestle</td><td>Fisher Scientific</td><td>S02595</td><td>porselein</td></tr><tr><td>Centrifuge tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-403-161</td><td></td></tr><tr><td>Microwave</td><td>Kenmore</td><td>405.7309231</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Assay Tubes</td><td>Invitrogen</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>0.2 ml Strip tube and Cap for PCR</td><td>VWR</td><td>20170-004</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 Fluorometer</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Balance</td><td>Mettler Toledo</td><td>PM2000</td><td></td></tr><tr><td>Liquid Nitrogen Short-term Storage</td><td>Nalgene</td><td>F9401</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic-Ring Stand&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td>AM10050</td><td>96 well&nbsp;</td></tr><tr><td>Water Bath</td><td>VWR</td><td>89032-210</td><td></td></tr><tr><td>Hot Plate Stirrers</td><td>VWR</td><td>97042-754</td><td></td></tr><tr><td>Liquid Nitrogen</td><td>Airgas</td><td>UN1977</td><td></td></tr><tr><td>1 X TE Buffer</td><td>Ambion</td><td>AM9849</td><td>pH 8.0</td></tr><tr><td>CTAB</td><td>AMRESCO</td><td>0833-500G</td><td></td></tr><tr><td>2-MERCAPTOETHANOL</td><td>AMRESCO</td><td>0482-200ML</td><td></td></tr><tr><td>Ribonuclease A</td><td>AMRESCO</td><td>E866-5ML</td><td>10 mg/ml oplossing</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63882</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>bio WORLD</td><td>705744</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl Alcohol</td><td>bio WORLD</td><td>40970004-1</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease Free water</td><td>bio WORLD</td><td>42300012-2</td><td></td></tr><tr><td>Isoamyl Alcohol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A393-500</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Acetate Trihydrate</td><td>Fisher Scientific</td><td>s608-500</td><td></td></tr><tr><td>LE Agarose</td><td>GeneMate</td><td>E-3120-500</td><td></td></tr><tr><td>100bp PLUS DNA Ladder</td><td>Gold Biotechnology</td><td>D003-500</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, Disodium Salt</td><td>IBI Scientific</td><td>IB70182</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Life Technologies</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>MP Biomedicals</td><td>103133</td><td>ultra pure</td></tr><tr><td>Gel Loading Dye Purple (6 X)</td><td>New England BioLabs</td><td>B7024S</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext dsDNA Fragmentase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0348L</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit for Illumina&nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>E7645L</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Multiplex Oligos for Illumina</td><td>New England BioLabs</td><td>E7600S</td><td>Dual Index Primers Set 1</td></tr><tr><td>NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix</td><td>New England BioLabs</td><td>M0543L</td><td></td></tr><tr><td>Mag-Bind RXNPure Plus</td><td>Omega bio-tek</td><td>M1386-02</td><td></td></tr><tr><td>GelRed 10000 X</td><td>Pheonix Research</td><td>41003-1</td><td></td></tr><tr><td>Phenol solution</td><td>SIGMA Life Science</td><td>P4557-400ml</td><td></td></tr><tr><td>PVP40</td><td>SIGMA-Aldrich</td><td>PVP40-50G</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>VWR</td><td>EM8.22265.2500</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Koptec</td><td>V1016</td><td>200 Proof</td></tr><tr><td>Silica sand</td><td>VWR</td><td>14808-60-7</td><td></td></tr><tr><td>Reamplification primers</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>zie tekst</td><td></td></tr><tr><td>Sequencher v.5.0.1</td><td>GeneCodes</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

robuuste dna isolatie en high-throughput sequencing bibliotheek bouw voor herbarium specimens

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Herbaria zijn een onschatbare bron van plantaardig materiaal dat kan worden gebruikt in een verscheidenheid van biologische studies. Het gebruik van herbarium specimens wordt geassocieerd met een aantal uitdagingen met inbegrip van monster behoud kwaliteit gedegradeerde DNA en destructieve bemonstering van zeldzame exemplaren. Om effectiever gebruiken herbarium materiaal grote sequencing projecten, een betrouwbare en schaalbare methode van DNA isolatie en bibliotheek voorbereiding nodig. Deze paper toont een robuuste, begin-to-end protocol voor DNA isolatie en hoge gegevensdoorvoer bibliotheek constructie van herbarium specimens die geen wijziging voor afzonderlijke monsters vereist. Dit protocol is op maat gemaakt voor lage kwaliteit gedroogde plant materiaal en neemt profiteren van bestaande methoden door het optimaliseren van weefsel slijpen, bibliotheek maat keuze wijzigen en invoering van een optionele reamplification stap voor lage opbrengst bibliotheken. Reamplification van lage opbrengst DNA bibliotheken kan redden monsters afgeleid van onvervangbare en potentieel waardevolle herbarium specimens, ontkenning van de noodzaak voor extra destructieve bemonstering en zonder merkbare sequencing bias voor common fylogenetische toepassingen. Het protocol is getest op honderden soorten gras, maar wordt verwacht om flexibel te zijn voor gebruik in andere geslachten van de plant na verificatie. Dit protocol kan worden beperkt door de uiterst aangetaste DNA, waar fragmenten niet bestaan in het bereik van de gewenste grootte, en secundaire metabolieten in sommige plantaardige materiaal aanwezig die een remmende werking schoon DNA isolatie. Globaal, is dit protocol introduceert een snelle en uitgebreide methode waarmee voor DNA isolatie en voorbereiding van de bibliotheek voor 24 samples in minder dan 13 h, met slechts 8 h van actieve hands-on tijd met minimale wijzigingen.

DNA isolatie en definitieve bibliotheek opbrengst In deze studie werd de doeltreffendheid van het protocol voor de isolatie van DNA van het herbarium en het herstel van hoge kwaliteit sequencing bibliotheken aangetoond door middel van vijftig verschillende monsters met de oudste van 1920 en de jongste vanaf 2012 (tabel 2). Voor elk monster werd ongeveer 10 mg blad weefsel gebruikt voor DNA-isolatie. Groener blad weefsel werd begunstigd, indien beschikb...

Dit artikel demonstreert een gedetailleerd protocol voor DNA isolatie en hoge gegevensdoorvoer sequencing bibliotheek bouw van herbarium materiaal met inbegrip van de redding van uitzonderlijk slechte kwaliteit DNA.

Robuuste DNA isolatie en High-throughput Sequencing bibliotheek bouw voor Herbarium Specimens

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Het algemene doel van dit protocol is om de hoeveelheid geïsoleerde dubbelstrengs DNA en daaropvolgende high-throughput sequencing bibliotheken van herbariumexemplaren te verhogen, waardoor hun bruikbaarheid in fylogenomisch onderzoek wordt gemaximaliseerd. Deze methode ontsluit het potentieel van herbariumexemplaren die anders niet bruikbaar zouden zijn voor sequencingprojecten als genomische sequenties vanwege uitgebreide monsterdegradatie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze robuust genoeg is dat zeldzame en historisch belangrijke herbariumexemplaren kunnen worden gebruikt zonder de noodzaak van uitgebreide destructief bemonstering.Deze techniek verlengt de diepte van taxonbemonstering in systematische spaced projecten. Soortenverwerving is een beperkende stap, maar met dit protocol kunnen historische collecties gemakkelijk worden gebruikt in deze studies. Voeg vloeibare stikstof en 30 tot 50 milligram gesteriliseerde zand toe om een centimeter vierkant van vooraf geselecteerd herbariumweefsel tot fijn poeder te vermalen in vooraf gekoelde mortel en stamper.Voldoende malen is essentieel voor succesvolle DNA-isolatie. En er moet voor worden gezorgd dat het monster volledig gepulveriseerd is. Voeg vervolgens het bevroren poeder toe aan twee twee-milliliterbuisjes, waarbij niet meer dan de helft van het buisvolume wordt gevuld.Voeg vervolgens 600 microliter warme CTAB-oplossing toe aan elke buis. Meng het poeder grondig door te keren en te vortexen. Bewaar vervolgens de monsters in een waterbad op 65 graden Celsius gedurende een tot 1,5 uur.Ondertussen, vortex elke 15 minuten. Centrifugeer vervolgens de monsters bij 10.000 g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Na centrifugatie, breng ongeveer 500 microliter van de supernatant over naar een nieuwe, verse set van gelabelde buisjes.Voeg aan het supernatant vier microliter van 10 milligram per milliliter RNase A toe aan elke toon. Meng vervolgens de inhoud van de buis door te keren of te pipetteren. Bewaar de monsters in een hitteblok of waterbad op 37 graden Celsius gedurende 15 minuten.Zodra de buisjes kamertemperatuur hebben bereikt, voeg ongeveer 500 microliter van 25:24:1 fenol, chloroform, isoamy alcohol mengsel toe aan de monsters. Meng vervolgens de inhoud van de buis door te keren of herhaaldelijk te pipetteren. Centrifugeer vervolgens de monsters bij 12.000 g gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.Breng de bovenste waterige laag, die ongeveer 400 microliter is, over naar een nieuwe set van gelabelde buisjes. Voeg aan de waterige laag in elke buis ongeveer 400 microliter van 24:1 chloroform, isoamy alcohol mengsel toe. Meng het monster grondig door herhaaldelijk te pipetteren of te keren.Centrifugeer vervolgens de buisjes bij 12.000 g gedurende vijf minuten en breng ongeveer 300 microliter van de bovenste waterige laag over naar vooraf gekoelde, gelabelde buisjes. Voeg vervolgens 300 microliter van vooraf gekoeld isopropanol en 12 microliter van 2,5 molair natriumacetaat toe. Bewaar vervolgens de buisjes bij min 20 graden Celsius gedurende 30 tot 60 minuten.Na bewaar, verwijder de monsters uit de vriezer. Centrifugeer vervolgens de monsters bij 12.000 g gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Na centrifugatie, was de pellet met ongeveer 300 tot 500 microliter van 70% ethanol.Centrifugeer opnieuw de buisjes bij 12.000 g gedurende 10 minuten. Verwijder vervolgens voorzichtig het supernatant zonder de pellet te verstoren. Droog vervolgens de pellets in de lucht en los het DNA op in 50 microliter van 1X Tris-EDTA buffer.Voeg een tot 16 microliter van geïsoleerd DNA en twee microliter van fragmentatiereactiebuffer toe in een 0,2-milliliter polymerasekettingreactiebuis. Pas het eindvolume aan tot 18 microliter met nuclease-vrij water. Voeg vervolgens twee microliter van dubbelstrengs DNA fragmentatie-enzym toe en vortex de mengsel kort gedurende drie seconden.Bewaar vervolgens de monsters bij 37 graden Celsius gedurende 8,5 minuten in de thermocycler. Voeg na bewaar vijf microliter van 0,5 molair EDTA toe aan de buisjes. Voeg 25 microliter van nuclease-vrij water toe om het totale volume van het gescheurde DNA aan te passen tot 50 microliter.Voeg vervolgens 45 microliter van SPRI-kralen aangebracht bij kamertemperatuur toe aan 50 microliter van gescheurd DNA en meng de twee grondig door herhaaldelijk te pipetteren. Laat het monster bevattende buisjes vijf minuten staan. Breng vervolgens de buisjes over op een magnetische plaat en wacht nog eens vijf minuten.Verwijder voorzichtig het supernatant. Voeg vervolgens 200 microliter van vers 80% ethanol toe aan de buisjes op de magnetische stand en wacht nog eens 30 seconden bij kamertemperatuur. Verwijder na 30 seconden voorzichtig het supernatant.Laat het deksel van de buis open staan om de kralen vijf minuten in de lucht te drogen op de magnetische stand. Verwijder vervolgens de buisjes van de magneetstand en elueer het DNA van de kralen in 55 microliter van 0,1X Tris-EDTA buffer. Meng het DNA grondig door herhaaldelijk te pipetteren.Bewaar vervolgens het monster bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Plaats het buisje opnieuw op de magnetische stand en wacht tot de oplossing in ongeveer twee minuten helder wordt. Verwijder 52 microliter van het supernatant en voer vervolgens DNA-kwantificeringsanalyse uit zoals beschreven in het tekstprotocol.Voeg aan 50 microliter van schoongemaakt en gescheurd DNA drie microliter van endonuclease, fosfaat-staartenzymen en zeven microliter van reactiebuffer toe. Meng het DNA en de andere componenten grondig door herhaaldelijk te pipetteren. Draai vervolgens de buisjes om de luchtbellen te verwijderen.Na het draaien, breng de monsters over naar een thermocycler en stel het programma in. Verdun de adapter 25 tot 50-voudig om een werkconcentratie van 0,6 tot 0,3 micromolar te bereiken. Voor high-throughput kort-lezen sequencing, voeg

robust-dna-isolation-high-throughput-sequencing-library-construction

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

De Hi-C methode maakt het mogelijk onpartijdige, genoom-brede identificatie van chromatine interacties (1). Hi-C paren nabijheid ligatie en massaal parallelle sequencing. De resulterende gegevens kunnen worden gebruikt om de genomische architectuur studeren op meerdere schalen: eerste resultaten geïdentificeerd functies zoals chromosoom gebieden, scheiding van open en gesloten chromatine, en chromatine structuur op de megabase schaal.

Hi-C: een methode om de driedimensionale architectuur van genoom-onderzoek.

Dit manuscript beschrijft een geautomatiseerde aanpak voor gelgrootteselectie voor het zuiveren van DNA-fragmenten voor next-generation sequencing. De Ranger-technologie biedt volledige automatisering van het gehele proces van agarose gel laden, elektroforetische analyse en herstel van gerichte DNA-fragmenten, waardoor high-throughput en hoge kwaliteit next-generation sequencing bibliotheken mogelijk zijn.

Geautomatiseerde Gel Size Selectie om de kwaliteit van next-generation sequencing bibliotheken Bereid uit Environmental watermonsters Verbeteren

We beschrijven een efficiente en rendabele methode voor het extraheren van nucleïnezuur uit uitstrijkjes ter karakterisering van bacteriële 16S rRNA gen gebruiken amplicon sequencing. De methode maakt het mogelijk voor een gemeenschappelijke aanpak voor de verwerking van meerdere soorten monster en herbergt een aantal downstream-analytische processen.

Efficiënte Nucleic Acid Extraction en 16S rRNA Gene Sequencing voor Bacteriële Gemeenschap karakterisering

De vergelijking en optimalisatie van twee organellaire DNA-verrijkingsmethoden worden voorgesteld: traditionele differentiële centrifugatie en fractionering van het totale gDNA op basis van methyleringsstatus. We beoordelen de resulterende DNA-hoeveelheid en kwaliteit, tonen de prestaties aan bij korte-leesvolgorde-sequencing, en bespreken het potentieel voor gebruik bij langlezen single-molecule sequencing.

Optimalisatie en Vergelijkende Analyse van Plant Organellaire DNA Verrijkingsmethoden Geschikt voor Volgend Sequencing

Gel-seq kan onderzoekers gelijktijdig bereiden bibliotheken voor beide DNA - en RNA-seq op de te verwaarlozen extra kosten vanaf 100-1000 cellen met behulp van een eenvoudige hydrogel-apparaat. Dit document stelt een gedetailleerde aanpak voor de fabricage van zowel het apparaat als het biologische protocol voor het genereren van gepaarde bibliotheken.

Gel-seq: Een methode voor de voorbereiding van de bibliotheek van de gelijktijdige Sequencing van DNA en RNA met Hydrogel Matrices

Besmetting tijdens de genomic sequencing van microscopische organismen blijft een groot probleem. Hier, laten we een methode om het genoom van een beerdiertjes uit een enkel exemplaar met zo weinig als 50 pg van genomic DNA zonder het hele genoom versterking om te minimaliseren van het risico van besmetting.

Ultralow Input genoom Sequencing bibliotheek bereiding op basis van een enkel exemplaar van de Tardigrade

Lange-lezen sequenties vergemakkelijken aanzienlijk de assemblage van complexe genomen en karakterisering van structurele variatie. Beschrijven we een methode voor het genereren van ultra lange reeksen door sequentiebepaling nanopore gebaseerde platformen. De benadering neemt een geoptimaliseerde DNA-extractie, gevolgd door de gewijzigde bibliotheek preparaten voor het genereren van honderden kilobase leest met gematigde dekking van menselijke cellen.

Ultra lange lezen Sequencing voor hele Genomic DNA-analyse

Dit protocol beschrijft een alomvattende aanpak voor het kweken, sequentiëren en de novo hybride genoomassemblage van urinebacteriën. Het biedt een reproduceerbare procedure voor het genereren van volledige, circulaire genoomsequenties die nuttig zijn bij het bestuderen van zowel chromosomale als extrachromosomale genetische elementen die bijdragen aan urinaire kolonisatie, pathogenese en verspreiding van antimicrobiële resistentie.

Hybride de novo genoomassemblage voor het genereren van complete genomen van urinebacteriën met behulp van short- en long-read sequencing-technologieën

De haalbaarheid en effectiviteit van high-throughput scRNA-seq-methoden luiden een eencellig tijdperk in plantenonderzoek in. Hier wordt een robuuste en complete procedure gepresenteerd voor het isoleren van specifieke Arabidopsis thaliana wortelceltypen en de daaropvolgende transcriptoombibliotheekconstructie en -analyse.

Isolatie en transcriptoomanalyse van plantenceltypen

Het huidige artikel heeft tot doel gedetailleerde en adequate protocollen te bieden voor de isolatie van plant-geassocieerde endofytische schimmels, langdurige bewaring van isolaten, morfologische karakterisering en totale DNA-extractie voor daaropvolgende moleculaire identificatie en metagenomische analyses.

Isolatie, karakterisering en totale DNA-extractie om endofytische schimmels in mycoheterotrofe planten te identificeren

Het huidige protocol beschrijft het gebruik van DNA-barcoderingstechnologie om plantaardige medicinale materialen te authenticeren, en de medicinale plant Angelica sinensis (Oliv.) Diels werd als voorbeeld aangewezen.

Toepassing van DNA-barcodering om geneeskrachtige planten te identificeren

Leer robuuste DNA-isolatie en high-throughput sequencing bibliotheekbouw voor herbarium specimens. Deze methode maximaliseert het gebruik van gedegradeerde historische collecties in fylogenomisch onderzoek.

Robuuste DNA isolatie en High-throughput Sequencing bibliotheek bouw voor Herbarium Specimens

Meer video's verkennen